CN109355302A - 一种DNA-Maker的简易制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种DNA‑Maker的简易制备方法，其步骤为：将p12S‑MK、p12F‑MK两种质粒用EcoR Ⅰ限制性内切酶进行酶切，对酶切产物进行纯化回收后，加储存液、Loading buffer混合即可。本方法稳定性高，可以确保批次之间的重复性生产，从而实现大规模生产，生产过程简单，前期载体构建好之后，后期DNA‑Maker生产成本很低，所制备的DNA‑Maker条带清晰、分布均匀并且质量稳定可长期存放。此外本发明对酶切体系及时间进行了优化，极大的提高了酶切效率，缩短了制备时间。

Description

一种DNA-Maker的简易制备方法
技术领域
本发明属于基因工程与分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种DNA-Maker的简易制备方法。
背景技术
自20世纪50年代分子生物学诞生，一直到20世纪70年代基因工程技术出现以来，分子生物学相关技术发展迅速，各种新技术、新方法不断涌现，特别是基因组时代以及后基因组时代高通量手段的出现如基因芯片、SAGE、微卫星DNA、AFLPs、SNPs和RAPDs、基因分型和DNA指纹研究等的应用和开发使得分子生物学领域发生着翻天覆地的变化，且在生命科学、医学等学科得到了广泛应用。
在DNA的体外操作中，涉及到DNA分子的扩增、纯化、切割、连接等许多过程，其中，最基础而且应用非常广泛的一项操作是DNA扩增和电泳。而DNA分子量标准是指一组分子量已知的DNA分子的混合物，电泳后按照其分子量的大小和迁移率的不同，在凝胶上形成一个DNA片段分布的梯度(ladder)，用以指示电泳过程中未知DNA样品的分子量。
DNA-Maker的应用非常广泛，是分子生物学实验室的常用试剂。在DNA-Maker的制备上，目前主要有两种方法：酶切法和PCR法。尽管实现DNA-Maker的原理非常简单，但要制作低成本高质量的DNA-Maker还是有相当的难度。目前，许多生物公司也为此开发了多种针对不同应用的，具有不同分子量范围的DNA-Maker产品。
PCR法是根据特定的模板设计特定的引物扩增出一系列不同大小的DNA片段，通过纯化、定量和组合即形成了DNA-Maker。该方法的优点是操作简单、制作方便，各条带的大小控制方便，不同大小的条带可以灵活的组合成不同的DNA-Maker。但其成本较高，长片段扩增困难或效率不高，条带不够锐利，条带之间的亮度难以完全一致，重复性差，稳定性不高，不易长时期保存，且保存环境在-20℃，不能保存在室温条件下，不便于使用。
酶切法分为以天然来源的基因组DNA的限制性酶切和基于人工构建载体的限制性酶切。天然来源的基因组DNA酶切是指分离某种来源固定、背景信息清晰的基因组DNA分子，用一种或几种限制性内切酶进行消化。从而产生一系列DNA片段组合。用这种方法生产DNA-Maker制作方便，在DNA来源方便的情况下，成本也比较低。但其缺点也是显而易见的，即条带距离不均匀、条带的分子量未能是整数、条带亮度严重不均一等。为此，随着基因工程技术的发展，人们想到用人工构建的DNA分子(比如质粒)进行限制性酶切来制备DNA-Maker。通过一次性将所需要的片段以设计好的酶切方式连接到载体中，通过发酵培养和质粒DNA提取，适当酶切后既可获得大量目标DNA片段。这种方法的优势在于可以通过大肠杆菌的培养获得大量廉价的质粒DNA，通过酶切方法获得的片段电泳时条带锐利，生产重复性高，稳定性高，可长期保存在室温状态，一旦质粒构建好，后续生产成本低。
酶切的方法又分为部分酶切和完全酶切。部分酶切是将具有某种单位长度而且带有设计好的酶切位点的片段顺序连接到载体中，通过控制酶的活性，温度和反应时间等酶切条件，实现载体的部分酶切，酶切产物将是质粒上该单位长度的倍数的片段。该方法是用于以单位长度递增的DNA-Maker的制备，其优点是制备方便，条带分布均匀，但其缺点是部分酶切的程度难以掌握，条带亮度与酶切的完全程度相关。
完全酶切是将设计好的一组不同大小的DNA片段克隆到特定的载体中，经过大肠杆菌扩增后，将纯化得到的质粒DNA通过完全酶切，获得相应大小的DNA片段。该方法制备的DNA-Maker质量较好。
综上所述，在目前DNA-Maker的生产过程中，主要采用的PCR扩增的方式，虽然该方法简单，但是一种劳动密集型的，难以保证批次之间重复性的生产，从而难以实现大规模生产，总体成本较高的方法。酶切法中的人工构建DNA分子的酶切是将来技术发展的主流。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种DNA-Maker的简易制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种DNA-Maker的简易制备方法，包括以下步骤：
步骤1、构建重组质粒载体；
步骤2、对重组质粒载体进行基因工程改造；
步骤3、重组质粒的提取；
步骤4、重组质粒质粒酶切；
步骤5、酶切产物的纯化回收；
步骤6、纯化回收产物与储存液、Loading buffer混合储存。
可选地，所述步骤1中的构建重组质粒载体具体为：以pPIC9k载体为模板，设计7条引物，在上游设计一条公共引物，在下游分别设计5条引物，在上游引物设计两个酶切位点，两个酶切位点分别为GAATTC和CTCGAT，在下游引物上设计一个酶切位点，酶切位点为GTCGAC，且设计为同尾酶酶切位点，使PCR产物经内切酶切割后产生相同的粘性末端，便于克隆到载体。
可选地，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.6所示。
可选地，所述步骤2中的对重组质粒载体进行基因工程改造具体为：质粒载体pPIC9k用BamH I酶切后，对质粒载体去磷酸化处理，然后用XholI和SaII双酶切片段后与载体质粒相连接；将连接产物转化的大肠杆菌JM109在含氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂培养基中筛选培养；挑取若干白色单菌落置含Amp的LB培养液中37℃振摇过夜培养，用试剂盒提取质粒DNA进行EcoR I酶切及电泳分析鉴定；鉴定得到的重组子再次用XholI酶切后，对重组子进行去磷酸化处理，然后再与用XholI和SaII双酶切后的另一个片段相连接，将新连接产物转化的大肠杆菌JM109在含氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂培养基中筛选培养，挑取若干单菌落置含Amp的LB培养液中37℃振摇过夜培养，运用菌体电泳的方法筛选出滞后菌落，用试剂盒提取质粒DNA进行EcoR I酶切及电泳分析鉴定选出新的重组子；如此反复进行酶切、去磷酸化、连接、转化、筛选、再酶切验证直到最后一个片段连接上载体构成含多个EcoR I酶切位点的DNA-Maker载体。
可选地，所述步骤4中的重组质粒质粒酶切，为完全酶切，即100ul完全酶切体系为：质粒70ul、Cutsmart buffer 10ul、EcoR I 5ul、ddH2O 15ul，酶切时间为8个小时。
可选地，所述步骤5中的纯化回收产物与储存液、Loading buffer混合储存具体为：纯化回收的DNA-Maker用EB溶解后，加5％甘油、总体积十分之一的10×Loadingbuffer，混匀后放在-20℃冰箱即长期保存。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明DNA-Maker电泳后可得到五条条带清晰、分布均匀、bp数为整数且明确的条带，即：4000bp、2000bp、1000bp、500bp、100bp。
2)本方法生产过程简单、稳定性高，可以保证批次之间重复性的生产，从而实现大规模生产。
3)本方法生产的DNA-Maker质量稳定可长期存放。
4)本发明对酶切体系及时间进行了优化，极大的提高酶切效率，缩短制备时间。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明载体构建策略图；
图2是本发明p12F-MK载体的构建结构示意图；
图3是本发明p12S-MK载体的构建结构示意图；
图4是本发明所得DNA-Maker成品电泳后的效果图；其中，1代表本发明所得DNA-Maker成品，2代表购买的商品DNA-Maker；
图5是本发明p12S-MK、p12F-MK载体20ul酶切体系不同载体浓度试酶切的电泳效果图；其中，0代表购买的商品DNA-Maker，1-5代表p12S-MK载体试酶切分别对应表2的不同载体浓度的20ul酶切体系的电泳效果图，6-10代表p12F-MK载体试酶切对应表2的不同载体浓度的20ul酶切体系电泳效果图；
图6是本发明以20ul最优体系为基准扩大至100ul体系完全酶切的不同载体浓度的电泳效果图；其中，M代表购买的商品DNA-Maker，1-3分别代表p12S-MK载体对应表3的不同载体浓度的100ul完全酶切体系的电泳效果图，4-6分别代表p12F-MK载体对应表3的不同载体浓度的100ul完全酶切体系的电泳效果图；
图7是本发明以酶浓度为单一变量进行酶切的电泳效果图；其中，M代表购买的商品DNA-Maker，1-3分别代表P12S-MK载体对应表4的不同酶浓度的酶切体系的电泳效果图，4-6代表分别P12F-MK载体试对应表4的不同酶浓度的酶切体系的电泳效果图；
图8是本发明在最优体系下，以时间为单一变量进行酶切的电泳效果图；其中，M代表购买的商品DNA-Maker，1-3分别代表p12S-MK载体在最优体系下酶切时间为30分钟、8小时、12小时的电泳效果图，4-6分别代表p12F-MK载体试在最优体系下酶切时间为30分钟、8小时、12小时的电泳效果图。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1引物设计合成及PCR片段扩增
p12S-MK、p12F-MK载体的构建策略如图1所示，以pPIC9k载体为模板，设计6条引物(如表1所示)，在上游设计一条公共引物，在下游分别设计5条引物。为了便于克隆到载体上，在上游引物设计两个酶切位点，在下游引物上设计一个酶切位点，且设计为同尾酶酶切位点，使PCR产物经内切酶切割后产生相同的粘性末端，便于克隆到载体，构建好的p12S-MK、p12F-MK载体分别如图2和图3所示。
表1本发明所用引物信息
利用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。4.0kb及2.0kb片段PCR扩增条件为95℃变性2min后，然后进行PCR循环：94℃30s，55℃1min，72℃2min30s，进行40个循环，然后72℃延伸10min。1.0kb片段PCR扩增条件为95℃变性2min后，然后进行PCR循环：94℃30s，54℃1min，72℃2min30s，进行40个循环，然后72℃延伸10min。0.5kb及0.1kb片段PCR扩增条件为95℃变性2min后，然后进行PCR循环：94℃30s，53℃1min，72℃2min30s，进行40个循环，然后72℃延伸10min。
实施例2重组质粒载体的基因工程改造
质粒载体pPIC9k用BamH I酶切后，对质粒载体去磷酸化处理，然后用XholI和SaII双酶切片段后与载体质粒相连接，此处应用了同尾酶原理：片段酶切后产生两个相同的粘性末端，再连接上载体质粒后，Sa II酶切位点消失而XholI酶切位点依然存在。将连接产物转化的大肠杆菌JM109在含氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂培养基中筛选培养。挑取若干个单个白色菌落置含Amp的LB培养液中37℃振摇过夜培养，用试剂盒提取质粒DNA进行EcoR I酶切及电泳分析鉴定。鉴定得到的重组子再次用XholI酶切后，对重组子进行去磷酸化处理，然后再与用XholI和Sa II双酶切后的另一个片段相连接，将新连接产物转化的大肠杆菌JM109在含氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂培养基中筛选培养，挑取若干单菌落置含Amp的LB培养液中37℃振摇过夜培养，运用菌体电泳的方法筛选出滞后菌落，用试剂盒提取质粒DNA进行EcoR I酶切及电泳分析鉴定选出新的重组子。如此反复进行酶切、去磷酸化、连接、转化、筛选、再酶切验证直到最后一个片段连接上载体构成如图1所示的含多个EcoR I酶切位点的
DNA-Maker载体。
实施例3
前期重组质粒载体构建好之后，通过建立不同的酶切体系，对酶切体系尽心优化，找寻酶切效果好、胶回收试剂盒纯化DNA得率高的酶切体系，具体过程如下：
(1)以底物即质粒浓度为单一变量进行酶切。
(1.1)试酶切：因完全酶切需要大量的质粒和酶，如果酶切失败则会造成经济浪费，于是在完全酶切之前，使用20ul酶切体系进行试酶切，能切开就扩大体系进行完全酶切步骤。酶切体系如下表2所示：
表2底物梯度酶切梯度
电泳检验效果如图5所示。
根据电泳图所示，其中效果最好的是第五组即：质粒18ul、Cutsmart buffer 2ul、EcoR I 1ul。
(1.2)以20ul最优体系为基准扩大至100ul体系完全酶切，酶切体系如下表3所示：
表3底物最优体系测试(100ul)
电泳检验效果如图6所示。
根据电泳图所示，扩大至100ul体系后1号、2号和3号没有明显差别，所以为降低生产成本选择1号体系，即：质粒70ukCutsmart buffer 10ul、EcoR I 6 2ul、ddH2O 18ul。
(2)以酶浓度为单一变量进行酶切。
在上述最优体系下进行酶浓度测试，酶切体系如下表4所示：
表4酶梯度酶切体系
电泳检验效果如图7所示。
根据电泳图所示，2号相较于1号和3号酶切效果最优，所以选择2号体系，即：质粒70ul、Cutsmart buffer 10ul、EcoR I 5ul、ddH2O 15ul。
(3)在最优体系下，以时间为单一变量进行酶切。时间长度分别为：30分钟(EcoR I说明书要小时求最少时间)、8小时、12小时即过夜。电泳检验效果如图8所示。
根据电泳图所示，酶切30分钟酶切不完全，酶切效果十分不好，而酶切8小时和12小时则酶切完全，酶切效果好且两者相差不多，所以为了提高效率，酶切8小时即可。
综上所述，最优酶切体系为：质粒70ul、Cutsmart buffer 10ul、EcoR I 5ul、ddH2O 15ul，酶切时间为8个小时。
实施例4DNA-Maker的储存：
纯化回收的DNA-marker用EB溶解后，加5％甘油、总体积十分之一的10×Loadingbuffer，混匀后放在-20℃冰箱即可长期保。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 广东石油化工学院
<120> 一种DNA-Maker的简易制备方法
<130> 2018
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
atattcaacg ggaaacgaat tcctcgat 28
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
cttcctcgct cactgactcg ctgcgcgtcg ac 32
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
cttcctcgct cactgactcg ctgcgcgtcg ac 32
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
gacgagccaa ggcgataaat acccaagtcg ac 32
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
gtgtcttgag gtctcctatc agattagtcg ac 32
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
tcaccgatgg ggaagatcgg gctcggtcga c 31

Claims (6)

1.一种DNA-Maker的简易制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、构建重组质粒载体；
步骤2、对重组质粒载体进行基因工程改造；
步骤3、重组质粒的提取；
步骤4、重组质粒质粒酶切；
步骤5、酶切产物的纯化回收；
步骤6、纯化回收产物与储存液、Loading buffer混合储存。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的构建重组质粒载体具体为：以pPIC9k载体为模板，设计7条引物，在上游设计一条公共引物，在下游分别设计5条引物，在上游引物设计两个酶切位点，两个酶切位点分别为GAATTC和CTCGAT，在下游引物上设计一个酶切位点，酶切位点为GTCGAC，且设计为同尾酶酶切位点，使PCR产物经内切酶切割后产生相同的粘性末端，便于克隆到载体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2- SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的对重组质粒载体进行基因工程改造具体为：质粒载体pPIC9k用BamH I酶切后，对质粒载体去磷酸化处理,然后用XholI和SaⅡ双酶切片段后与载体质粒相连接；将连接产物转化的大肠杆菌 JM109在含氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂培养基中筛选培养；挑取若干白色单菌落置含Amp的 LB培养液中37℃振摇过夜培养，用试剂盒提取质粒DNA进行EcoR I 酶切及电泳分析鉴定；鉴定得到的重组子再次用 XholI 酶切后,对重组子进行去磷酸化处理，然后再与用XholI和SaⅡ双酶切后的另一个片段相连接，将新连接产物转化的大肠杆菌JM109在含氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂培养基中筛选培养,挑取若干单菌落置含Amp的LB培养液中37℃振摇过夜培养,运用菌体电泳的方法筛选出滞后菌落,用试剂盒提取质粒DNA进行EcoR I酶切及电泳分析鉴定选出新的重组子；如此反复进行酶切、去磷酸化、连接、转化、筛选、再酶切验证直到最后一个片段连接上载体构成含多个 EcoR I 酶切位点的 DNA-Maker 载体。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中的重组质粒质粒酶切，为完全酶切，即100ul完全酶切体系为：质粒70ul、Cutsmart buffer 10ul、EcoR Ⅰ 5ul、ddH2O15ul，酶切时间为8个小时。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5中的纯化回收产物与储存液、Loading buffer混合储存具体为：纯化回收的DNA-Maker用EB 溶解后，加5%甘油、总体积十分之一的10ⅩLoading buffer，混匀后放在-20℃冰箱即长期保存。
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陈新军等: "《大洋性经济柔鱼类分子系统地理学》", 31 March 2017, 海洋出版社 *
韦柳静等: "一种新型可用于DNA分子量标准的质粒构建", 《生物技术》 *

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