CN1093176C - 三羟基芪合酶基因及其制备方法 - Google Patents

Abstract

以不同栽培品种葡萄的茎、叶和叶柄组织总RNA为模板，利用RT-PCR得到了三羟基芪合酶基因(Resveratrol synthase gene)cDNA克隆2个。由此提供了编码三羟基芪合酶的新的结构基因，构建了原核表达质粒和植物组成性表达质粒。将所述的三羟基芪合酶结构基因转化到高效、稳定表达的微生物，借助生物转化可获得三羟基芪。并且获得了含有植物组成性表达质粒的转基因植物。植物可食部分也会含有三羟基芪，长期食用能起到预防癌症和心血管疾病的作用；不可食部分还可用于提取三羟基芪来制药。在转基因植物、微生物的培育和生产及其它们在药食兼用和制药上都将具有潜在的应用价值。

Description

三羟基芪合酶基因及其制备方法

(一)发明领域

本发明涉及三羟基芪合酶基因工程领域。具体地说，本发明涉及新的三羟基芪合酶，涉及在植物中具有组成性表达的重组质粒，和涉及其各组织在没有环境压情况下均能表达三羟基芪合酶的转基因植物。

(二)背景技术

三羟基芪(Resveratrol，也称为白藜芦醇)是植物的次生代谢产物，最初是以其植保素[1]功能被发现的。三羟基芪合酶(简称RS)基因只存在于花生、葡萄和松树等少数植物中[2]，它是植物本身的一种防御基因。据文献报道，只有在外部逆性条件(如病原菌侵染等)诱导下，才能激发该基因转录并转译成三羟基芪合酶，进而催化植物本身所含的前体物质(一般植物都有)生成三羟基芪。欧洲专利(EP-464461 A2)和有关文献描述了以真菌诱导的葡萄愈伤组织为来源构建cDNA文库，从cDNA文库中分离到三羟基芪合酶的调节基因和结构基因，用该调节基因和结构基因一起转化烟草，其转基因烟草只有在外部条件的诱导下，即特定波长紫外线或灰葡萄孢霉菌侵染情况下，其转基因组织中才能检测到三羟基芪合酶的mRNA积累、三羟基芪合酶和产物三羟基芪的存在，对灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea)感染有抗性。

上述和其它的现有技术由于它的结构基因的表达受到外界条件的限制，三羟基芪在植物各组织也不均一，它的发明的出发点也仅限于植保素的功能，其应用受到局限。而三羟基芪在医学、生物学方面的重要性和实际应用的价值也远远超出了植保素的功能。近几年来由于三羟基芪它的新的生物功能开始引起国外医、药学家的极大兴趣。1997年美国科学家从几百种植物提取液中发现了一种新的抗癌物质三羟基芪[3]。由于三羟基芪在生理代谢过程中的抗氧化和抗突变作用，它在癌细胞最初形成、生长、发展的三个阶段中均有抗癌活性，在小鼠乳腺癌和皮肤癌模式实验中也得到极好的抑制效果[3]。此外三羟基芪还可抑制ADP诱导的血小板凝集[4]。含三羟基芪的天然食品与纯的三羟基芪一样能起到预防癌症和心血管疾病的作用[3，5]。遗憾的是这种物质“三羟基芪”仅存在于少数可食植物中，且含量甚低。

(三)发明内容

针对上述存在的问题，本发明的目的是提供一种可获得三羟基芪合酶的新的结构基因、重组质粒、组成性表达的重组质粒。

本发明的另一个目的是通过新的组成性表达的三羟基芪合酶结构基因，培育出系列药食兼用、药用的转基因植物。

本发明的又一目的是将本发明的三羟基芪合酶结构基因转化到高效、稳定表达的微生物，借助生物转化可获得三羟基芪。

本发明人在研究中发现并非所有的葡萄品种都象EP-464461 A2和有关文献所述的那样，只有通过外部条件诱导的葡萄组织才可做为构建基因的材料。本发明人发现在未经诱导的情况下，从特定品种的健康葡萄组织中可以检测出三羟基芪合酶酶蛋白，而有的葡萄品种虽然经过诱导，但是在其组织中也未能检出三羟基芪合酶酶蛋白。于是本发明的特点是：利用中国特有的、古老的葡萄栽培品种龙眼和日本培育的欧美种的杂交后代藤稔为材料，采用脱毒的组培苗或田间栽培植株的茎、叶和叶柄组织的总RNA为模板，利用RT-PCR得到了二个三羟基芪合酶基因，这二个基因与欧洲专利(EP-464461 A2)相比，其核苷酸序列同源性分别为93％和95％，氨基酸序列同源性均为98％；本发明所得二个三羟基芪合酶基因其核苷酸同源性为92.5％，氨基酸序列同源性为98％；构建了能在植物中具有组成性表达的重组质粒。其优点是所得的转基因植物各组织在没有环境压情况下均能表达三羟基芪合酶，并催化植物本身所含的前体物质生成衡定量的三羟基芪；植物可食部分也会含有三羟基芪；不可食部分还可用于提取三羟基芪来制药；可将三羟基芪合成酶结构基因转化到高效、稳定表达的微生物后，借助生物转化将获得大量的三羟基芪，可精制成药，具有更高的应用价值。

本发明通过基因工程手段，为解决三羟基芪的资源找到了一条新的途径，从而为其实现在医药、保健上的应用提供了可能。

为达到上述目的，实现本发明的具体技术步骤如下：以不同栽培品种葡萄为起始材料，从脱毒组培苗或田间栽培植株的茎、叶、和叶柄组织中分别提取的总RNA为模板，以合成的Oligo(dT)为引物，用AMV逆转录酶逆转录成cDNA。根据已报道的三羟基芪合酶结构基因5’端和3’端保守序列[6]设计并合成一对引物，通过PCR扩增三羟基芪合酶结构基因(以下简称RS1和RS2)，并克隆三羟基芪合酶结构基因。纯化PCR产物连接到T-pBluescript载体上并转化大肠杆菌JM109，获得含三羟基芪合酶结构基因重组质粒pBRS1和pBRS2(见图1，2)及重组大肠杆菌JM109RS1和JM109RS2。测序表明三羟基芪合酶结构基因是1.189Kb的DNA。

从重组质粒pBRS1和pBRS2分离出含三羟基芪合酶结构基因的DNA片段，连接到大肠杆菌表达载体pBV221，并转化大肠杆菌JM109，获得能在大肠杆菌中表达的重组质粒pBV221-RS1和pBV221-RS2(见图3，4)及重组大肠杆菌JM109-221-RS1和JM109-221-RS2。在可使上述三羟基芪合酶结构基因表达的条件下培养该重组菌，菌体蛋白质的SDS-PAGE蛋白电泳分析证明有一条42KDa特异表达蛋白带(见图5)，其分子量与三羟基芪合酶一致。从凝胶中切出特异表达的蛋白带，免疫兔子制备抗血清。

从重组质粒pBRS1和pBRS2分离出含三羟基芪合酶结构基因的DNA片段分别连接到植物组成性表达载体pBin438，连接物分别转化大肠杆菌XLI-Blue和JM109，获得能在植物中组成性表达的重组质粒pBin438-RS1和pBin438-RS2(见图6，7)及重组大肠杆菌XLI-Blue-438-RS1和JM109-438-RS2。

从上述重组菌中提取重组质粒pBin438-RS1和pBin438-RS2，转化农杆菌LBA4404。获得重组农杆菌LBA4404-RS1和LBA4404-RS2。

经重组农杆菌LBA4404-RS1和LBA4404-RS2的介导转化烟草外植体，通过选择性分化培养基和选择性生根培养基培养，得到抗卡那霉素植株。植株叶组织总DNA的PCR分析表明得到了PCR阳性烟草植株(见图9)，即转三羟基芪合酶结构基因的烟草(见图8)。

(四)附图说明

图1：三羟基芪合酶结构基因重组质粒pBRS1构建模式图。

图2：三羟基芪合酶结构基因重组质粒pBRS2构建模式图。

图3：三羟基芪合酶结构基因大肠杆菌表达重组质粒pB221-RS1构建模式图。

图4：三羟基芪合酶结构基因大肠杆菌表达重组质粒pB221-RS2构建模式图。

图5：三羟基芪合酶结构基因在大肠杆菌中的表达。

图6：三羟基芪合酶结构基因植物组成性表达重组质粒pBin-438-RS1构建模式图。

图7：三羟基芪合酶结构基因植物组成性表达重组质粒pBin-438-RS2构建模式图。

图8：转三羟基芪合酶结构基因烟草。

图9：转三羟基芪合酶结构基因烟草叶组织总DNA的PCR分析。

图10：来自龙眼、藤稔和Opitima的三羟基芪合酶结构基因DNA序列及由此推导出的氨基酸序列同源性比较。

(五)实施方式实施例I

1.葡萄组织总RNA的提取

用原产于中国的古老葡萄栽培品种龙眼(Vitis vinefera var.LongYan)，取其脱毒生根组培苗茎和叶共3g，液氮研磨后，迅速加入15ml在65℃预热过的RNA提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0，含2％CTAB、2％PVP4000、25mmol/L EDTA、2.0M NaCl、0.5g/LSpermidine和2％β-巯基乙醇)。分别用等体积的氯仿、异戊醇混合溶液(V/V＝24∶1)抽提两次，取最后一次的上清溶液，加入1/4体积10mol/L LiCl，4℃放置过夜，次日4℃、10000rpm离心回收上述溶液中的RNA沉淀，沉淀再溶于500μl的SSTE溶液(10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1.0mol/L NaCl、0.5％SDS、1mmol/L EDTA)，用氯仿、异戊醇混合溶液再抽提两次，上清液加入两倍体积的乙醇，-70℃放置2小时后，于4℃、10000rpm离心20分钟，回收RNA沉淀，用70％的乙醇洗涤沉淀，干燥后沉淀用DEPC处理过的无离子水溶解。RNA溶液的紫外分光光度测定结果为A₂₆₀/A₂₈₀＝1.80，A₂₆₀/A₂₃₀＝2.0，电泳分析估计28S、18S的tRNA量的比大约为28S∶18S＝2∶1，此RNA溶液可作为RT-PCR反应的模板。

2.cDNA合成和扩增

在9μl的总RNA溶液中，加入1μl的Oligo(dT)₁₈(0.4884μg/μl)引物，置90℃放2分钟后立刻在冰浴上再放置2分钟，瞬间离心。向上述溶液中依次加入dNTPs(每种dNTP为10mmol/L)1.5μl、ddH₂O 3μl、核糖核酸酶抑制剂0.5μl(20u/μl)、5 AMV缓冲液4μl、AMV逆转录酶1μl。该溶液于42℃放置30分钟后，再在95℃温浴5分钟，立即置冰浴放2分钟，瞬时离心。

上述反应液1000倍稀释后取出2μl作PCR反应。PCR反应的体系有dNTP 1μl(每种dNTP各为10mmol/L)、5’端引物：5’-ATCCATGGCTTCAGT(C/T)G-3’和3’端引物：5’-CTTCACTTAATTTGT(A/C)AC-3’各为1μl(25pmol/μl)、10 Taq酶缓冲液5μl、Taq酶0.3μl(5u/μl)、用水补充至50μl。PCR反应的条件为：94℃ 3分钟；94℃ 30秒、51℃ 1分钟、72℃ 1分钟20秒(30个循环)；72℃ 10分钟。PCR产物的琼脂糖电泳分析显示一条较为明显的约1.189Kb的DNA带。用乙醇纯化PCR产物，溶于25μl的水。

3.含三羟基芪合酶结构基因的克隆及序列分析

取1μl的PCR产物与1μl的T-pBluescript作10μl连接体系反应，其中含1μl(10连接缓冲液)、6μl水、1μl的T₄DNA连接酶。连接体系在16℃反应8小时，取0.8μl电击转化感受态大肠杆菌JM109后，涂于含Amp(氨苄青霉素)的LB固体培养基上。挑取单菌落，利用以上的PCR系统，直接以菌落为模板进行PCR。对PCR阳性的菌落，用煮沸法提质粒。利用载体上的SalI和PCR产物上NcoI的酶切位点，对1μl的质粒作NcoI、SalI的双酶切反应。根据电泳结果选择含约1.189Kb DNA片段重组质粒的菌落(JM109-RS1)，提取质粒(pBRS1)，通过USB的T4Sequenase Version2.0测序试剂盒测序，测序结果见图10的RS1。

4.含三羟基芪合酶结构基因重组大肠杆菌表达载体和重组大肠杆菌的制备

取10μl的质粒pBRS1在100μl体系中，进行NcoI，SalI的双酶切反应，37℃温浴3.5小时，加入1μl Rnase(1μg/μl)继续温浴半小时后，取5μl的反应液电泳检查。100μl反应液用乙醇沉淀，沉淀溶于10μl水后全部进行电泳，打孔法回收含1.189KbDNA片段于10μl水中。取1μl的约1.189Kb DNA片段溶液和0.5μl同样双酶切pBV221后回收的大片段作连接反应，体系同上。取0.8μl电击转化大肠杆菌JM109感受态细胞后，涂于含Amp的LB固体培养基上。通过PCR和重组质粒的NcoI、SalI双酶切方法，挑取含重组质粒pBV221-RS1的JM109-221-RS1菌体。

含重组质粒pBV221-RS1的JM109菌体在含50μg/ml Amp的LB液体培养基中37℃培养至OD＝0.5后，在42℃、250rpm再培养3.5小时。取1.5ml菌液于12000rpm离心30秒回收菌体。菌体重悬于100μlpH7.0的TE和100μl的2 SDS蛋白裂解缓冲液中，煮沸3分钟，再12000rpm离心5分钟。取上清液5μl进行SDS-PAGE蛋白电泳，显示一条42KDa特异蛋白带。

5.芪合酶的抗体制备

与以上类同，SDS-PAGE蛋白电泳后的凝胶经4℃ 0.1N KCl浸泡5分钟，蛋白带显乳白色，挖取42KDa特异表达蛋白带凝胶；用无菌水浸泡5分钟分别两次，用液氮研磨后用无菌水或PBS或生理盐水悬浮，用悬浮液免疫兔子，一个月后采集抗血清。

6.含三羟基芪成酶结构基因重组植物组成性表达载体和重组农杆菌的制备

BamHI、SalI双酶切质粒pBRS1，回收DNA小片段。同样双酶切植物组成性表达载体pBin438，且乙醇纯化溶于少量的水，取该酶切产物与上述DNA小片段连接。电击转化大肠杆菌XLI-Blue感受态细胞后，涂于含Kan(卡那霉素)的LB固体培养基上。利用PCR和BamHI、SalI双酶切的鉴定并挑取含重组质粒pBin438-RS1的XLI-Blue菌体。

经煮沸法提取质粒pBin438-RS1并转化农杆菌LBA4404感受态细胞后、涂于含50μg/ml Kan和50μg/ml Rif(利副平)的YEP固体培养基上，挑取单菌落提质粒，PCR显示获得了含pBin438-RS1的农杆菌LBA4404-RS1。

挑取含pBin438-RS1的LBA4404单菌落，于5ml的含50μg/mlKan和50μg/ml Rif的YEP培养基中，于28℃、250rpm培养过夜。此菌液用液体MS培养基作100倍的稀释，以备烟草转化。

7.转三羟基芪合酶结构基因烟草的培育

取烟草K326种子，于70％酒精浸泡2分钟，再用0.1％HgCl₂表面消毒15分钟，用无菌水冲洗5次，然后置于MSO培养基上萌发，25℃每日光照16小时。取二十天苗龄的烟草无菌苗的叶片，用刀片切去主脉及叶梗，整个叶片被切为1cm²的小片，然后置于以上的农杆菌稀释液中，浸泡4分钟。取出叶片用无菌滤纸吸干菌液，将叶片置于MS1固体培养基上，使叶片切口接触培养基，28℃暗培养48小时。

将共培养的叶片转移到含300μg/ml Kan、500μg/ml Cab(羧苄青霉素)的MS2培养基上，25℃每日光照16小时进行选择性培养。当愈伤组织上长出0.5~1cm高新生芽时，将新生芽切下置于含300μg/ml Kan、500μg/ml Cab的MS3选择性生根培养基上，25℃每日光照16小时。当幼芽长出根并苗高约3~5cm时取出幼苗，并彻底清除根部培养基，将幼苗移入土壤中培养。

取上述转基因烟草叶片50mg，加入150μl的CTAB缓冲溶液(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0，含1.4mol/L  NaCl，20mmol/L EDTA，2％CTAB)后研磨，再另加入350μl CTAB缓冲溶液，轻轻搅匀，65℃温浴半小时。然后加入500μl在4℃预冷过的氯仿，轻微摇匀，室温10000rpm离心5分钟，取出400μl水相移入另一个Eppendorf管。向移出的水相中加入400μl在4℃预冷过的异丙醇，轻微摇匀，室温10000rpm离心5分钟，弃上清液，用乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于100μl的无离子水中。取2μl该溶液作模板，按上述PCR系统进行PCR反应。电泳结果显示为一条1.189Kb DNA带，说明此植株为PCR阳性株即为转RS基因的烟草。附注：LB培养基：5g/L NaCl；10g/LTrypton；10g/LYeast ExtractpH7.0(3NNaOH调)；15g/L琼脂；15磅灭菌30分钟。YEP培养基：5g/L NaCl；10g/L Polypepton；10g/LYeast ExtractpH7.0(3NKOH调)；15g/L琼脂；15磅灭菌30分钟。MS培养基：如文献[8]所述。MS1培养基：在MS培养基中加入过滤灭菌的IAA和6BA终浓度分别为0.1mg/L和1.2mg/L。MS2培养基：含0.1mg/L IAA和1.0mg/L 6BA的MS培养基。MS3培养基：含0.1~1mg/L IBA的MS培养基。实施例2

1.葡萄组织总RNA的提取

称取3g在田间生长四年的葡萄栽培品种藤稔(Fujiminori，欧美杂交种)的叶和叶柄，液氮研磨后迅速加入15ml经65℃预热的RNA提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl pH8.0，含2％CTAB、2％PVP4000、25mmol/L EDTA、2.0mol/L NaCl、0.5g/L Spermidine和2％β-巯基乙醇)。分别用等体积的氯仿、异戊醇混合溶液(V/V＝24∶1)抽提两次，取最后一次的上清溶液，加入1/4体积的10mmol/L LiCl，4℃放置过夜，次日4℃、10000rpm离心回收上述溶液中的RNA沉淀。沉淀再溶于500ul的SSTE溶液(10mmol/L Tris-HCl，pH8.0含1.0mol/L NaCl、0.5％SDS和1mmol/L EDTA)，同样用氯仿、异戊醇混合溶液抽提两次，加入两倍体积的乙醇，-20℃放置2小时。4℃、10000rpm、离心20分钟回收RNA沉淀，用70％的乙醇洗涤沉淀，干燥后沉淀溶于用DEPC处理过的无离子水中。对此总RNA溶液进行A₂₆₀/A₂₈₀、A₂₆₀/A₂₃₀及琼脂糖电泳的分析，A₂₆₀/A₂₈₀＝1.85，A₂₆₀/A₂₃₀＝2.1，电泳分析显示明显的28s、18s的tRNA带，且二者量的比大约为28S∶18S＝2∶1，可作为RT-PCR反应的模板。

2.cDNA合成和扩增

在9ul的总RNA溶液中，加入1μl的Oligo(dT)₁₈(0.4884μg/μl)引物，置于90℃保温2分钟后于冰浴上再放2分钟，瞬间离心后再向上述溶液中依次加入dNTPs(每种dNTP为10mmol/L)1.5μl、ddH₂O 3μl、核糖核酸酶抑制剂0.5μl(20u/μl)、5 AMV缓冲液4μl、AMV逆转录酶1μl。该溶液于42℃反应30分钟，再于95℃温浴5分钟后立即置冰浴，2分钟后瞬时离心。

以上反应液1000倍稀释后，取出2μl作PCR反应。PCR反应的体系为dNTP 1μl(每种dNTP各为10mmol/L)、RS引物1和2(25pmol/ul)各1μl、10 Taq酶缓冲液5μl、Taq酶0.3μl(5u/μl)、用水补充至50μl。PCR反应的条件为：94℃ 3分钟；94℃30秒、51℃ 60秒、72℃ 1分钟20秒，(循环30次)；72℃ 10分钟。PCR产物的琼脂糖电泳分析显示一条较为明显的1.189Kb的DNA带。用乙醇纯化PCR产物，溶于25μl的水。

3.含三羟基芪合酶结构基因的克隆及序列分析

取1μl的PCR产物与1μl的T-pBluescript到10μl连接体系，其中含1μl 10连接缓冲液、6μl水、1μl T₄DNA连接酶。连接体系在16℃反应8小时，取0.8μl电击转化大肠杆菌JM109感受态细胞后，涂于含Amp的LB固体培养基上。挑取单菌落，利用以上的PCR系统，直接以菌落为模板进行PCR。对于PCR阳性的菌落，用煮沸法提质粒。利用载体上的SalI和PCR产物上NcoI的酶切位点，对1μl的质粒作NcoI、SalI的双酶切反应。选择电泳结果表明有一约1.189KbDNA片段的含重组质粒的菌落JM109-RS2。提取质粒(pBRS2)，通过USB的T4-Sequenase Version2.0测序试剂盒测序，测序结果见图10的RS2。

4.含三羟基芪合酶结构基因重组大肠杆菌表达载体和重组大肠杆菌的制备

取10μl的质粒pBRS2在100μl体系中，进行NcoI，SalI的双酶切反应，37℃温浴3.5小时，加入1μl Rnase(1μg/μl)继续温浴半小时后，取5μl的反应液电泳检查。100μl反应液用乙醇沉淀，沉淀溶于10μl水后全部进行电泳，打孔法回收含1.189KbDNA片段于10μl水中。取1μl的1.189KbDNA片段溶液和0.5μl同样双酶切pBV221后回收的大片段作连接反应，体系同上。取0.8μl电击转化大肠杆菌JM109感受态细胞后，涂于含Amp的LB固体培养基上。通过PCR和重组质粒的NcoI、SalI双酶切方法，挑取含重组质粒pBV221-RS2的JM109-221-RS2菌体。

含重组质粒pBV221-RS2的JM109菌体在含50μg/ml Amp的LB液体培养基中培养至OD＝0.5后，在42℃、250rpm再培养3.5小时。取1.5ml菌液于12000rpm离心30秒回收菌体。菌体重悬于100μl pH7.0的TE和100μl 2 SDS蛋白裂解缓冲液中，煮沸3分钟再于12000rpm离心5分钟。取上清液5μl进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。

5.含三羟基芪合酶结构基因重组植物组成性表达载体和重组农杆菌的制备

用BamHI、SalI双酶切质粒pBRS2，回收DNA小片段。同样双酶切植物组成性表达载体pBin438，且乙醇纯化溶于少量水，取该酶切产物与上述DNA小片段连接。电击转化大肠杆菌JM109感受态细胞后，涂于含Kan的LB固体培养基上。利用PCR和BamHI、SalI双酶切鉴定并挑取含重组质粒pBin438-RS2的JM109菌体。

经煮沸法提取质粒pBin438-RS2并转化农杆菌LBA4404感受态细胞后、涂于含50μg/ml Kan和50μg/ml Rif的YEP固体培养基上，PCR显示获得了含pBin438-RS2的农杆菌LBA4404-RS2。

挑取含pBin438-RS2的LBA4404单菌落，于5ml的含50μg/mlKan和50μg/ml Rif的YEP培养基中，于28℃、250rpm培养过夜。此菌液用液体MS培养基作100倍的稀释，以备烟草转化。

6.转三羟基芪合酶结构基因烟草的培育

取烟草K326种子，于70％酒精浸泡2分钟，再用0.1％HgCl₂表面消毒15分钟，用无菌水冲洗5次，然后置于MSO培养基上萌发，25℃每日光照16小时，取二十天苗龄的烟草无菌苗的叶片，用刀片切去主脉及叶梗，整个叶片被切为1cm²的小片，然后置于以上的农杆菌稀释液中，浸泡4分钟。取出叶片用无菌滤纸吸干菌液，将叶片置于MS1固体培养基上，使叶片切口接触培养基，28℃暗培养48小时。

将共培养的叶片转移到含300μg/ml Kan、500μg/ml Cab的MS2培养上，25℃每日光照16小时进行选择性培养。当愈伤组织上长出0.5~1cm高新生芽时，将新生芽切下置于含300μg/ml Kan、500μg/ml Cab的MS3选择性生根培养基上，25℃每日光照16小时。当幼芽长出根并苗高约3~5cm时，取出幼苗，并彻底清除根部培养基，将幼苗移入蛭石置温室培养10天左右后再移入土壤中培养。

取上述转基因烟草叶片50mg，加入150μl的CTAB缓冲溶液(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0，含1.4mol/L  NaCl，20mmol/L EDTA和2％CTAB)后研磨，再另加入350μl的CTAB缓冲溶液，轻轻摇匀，65℃温浴半小时后加入500μl在4℃预冷过的氯仿，轻微摇匀，室温10000rpm离心5分钟，取出400μl水相并移入另一个Eppendorf管。向移出的水相中加入400μl在4℃预冷过的异丙醇，轻微摇匀，室温10000rpm离心5分钟，弃上清液，用乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于100μl的无离子水中。取2μl该溶液作模板，按上述PCR系统进行PCR反应。电泳结果显示为一条1.189Kb DNA带，说明此植株为PCR阳性株，即为转RS基因的烟草。附注：LB培养基：5g/L NaCl；10g/LTrypton；10g/LYeast ExtractpH7.0(3NNaOH调)；15g/L琼脂；15磅灭菌30分钟。YEP培养基：5g/L NaCl；10g/L Polypepton；10g/LYeast ExtractpH7.0(3NKOH调)；15g/L琼脂；15磅灭菌30分钟。MS培养基：如文献[8]所述。MS1培养基：在MS培养基中加入过滤灭菌的IAA和6BA终浓度分别为0.1mg/L和1.2mg/L。MS2培养基：含0.1mg/L IAA和1.0mg/L 6BA的MS培养基。MS3培养基：含0.1~1mg/L IBA的MS培养基。

主要参考文献[1]  Langcake，P et al.(1979) Phytochemistry 18：1025-1027[2]  Hain，R et al.(1993) Nature 361：153-156[3]  Meishiang，J et al.(1997) Science 275：218-220[4]  Mei-Ing Chung et al.(1992) Planta Med.58：274-276[5]  Siemam，E.H et al.(1992) Am.J.Enol VITIc.43：49-52[6]  Molchior，F et al.(1991) Arch Biochem Biophys.288：552-557[7]  Shujun Chang et al.(1993) Plant Molecular Biology Report 11：113[8]  Murashige，T et al.(1962) Physiol.Plant.15：473-497

Claims (12)

1.一种在宿主中组成性表达的三羟基芪合酶基因，其特征在于长度为具有1.189Kb，其编码的氨基酸序列分别选自于下列RS1和RS2之一：

RS1：M   A   S   V   E   E   F   R   N   A   Q   R   A   K   G   P

RS2：M   A   S   V   E   E   i   R   N   A   Q   R   A   K   G   P

     A   T   I   L   A   I   G   T   A   T   P   D   H   C   V   Y

     A   T   I   L   A   I   G   T   A   T   P   D   H   C   V   Y

     Q   S   D   Y   A   D   Y   Y   F   R   V   T   K   S   E   H

     Q   S   D   Y   A   D   Y   Y   F   R   V   T   K   S   E   H

     M   T   E   L   K   K   K   F   N   R   I   C   D   K   S   M

     M   s   E   L   K   K   K   F   N   R   I   C   D   K   S   M

     I   K   K   R   Y   I   H   L   T   E   E   M   L   E   E   H

     I   K   K   R   Y   I   H   L   T   E   E   M   L   E   E   H

     P   N   I   G   A   Y   M   A   P   S   L   N   I   R   Q   E

     P   N   I   G   A   Y   M   A   P   S   L   N   I   R   Q   E

     I   I   T   A   E   V   P   R   L   G   R   D   A   A   L   K

     I   I   T   A   E   V   P   k   L   G   k   e   A   A   L   K

     A   L   K   E   W   G   Q   P   K   S   K   I   T   H   L   A

     A   L   K   E   W   G   Q   P   K   S   K   I   T   H   L   vF   C   T   T   S   G   V   E   M   P   G   A   D   Y   K   LF   C   T   T   S   G   V   E   M   P   G   A   D   Y   K   LA   N   L   L   G   L   E   T   S   V   R   R   V   M   L   YA   N   L   L   G   L   E   T   S   V   R   R   V   M   L   YH   Q   G   C   Y   A   G   G   T   V   L   R   T   A   K   DH   Q   G   C   Y   A   G   G   T   V   L   R   T   A   K   DL   A   E   N   N   A   G   A   R   V   L   V   V   C   S   EL   A   E   N   N   A   G   A   R   V   L   V   V   C   S   EI   T   V   V   T   F   R   G   P   S   E   D   A   L   D   PI   T   V   V   T   F   R   G   P   S   E   D   A   L   D   sL   V   G   Q   A   L   F   G   D   G   S   S   A   V   I   VL   V   G   Q   A   L   F   G   D   G   S   a   A   V   I   VG   S   D   P   D   V   S   I   E   R   P   L   F   Q   L   VG   S   D   P   D   V   S   I   E   R   P   L   F   Q   L   VS   A   A   Q   T   F   I   P   N   S   A   G   A   I   A   GS   A   A   Q   T   F   I   P   N   S   A   G   A   I   A   GN   L   R   E   V   G   L   T   F   H   L   W   P   N   V   PN   L   R   E   V   G   L   T   F   H   L   W   P   N   V   PT   L   I   S   E   N   I   E   K   C   L   T   Q   A   F   DT   L   I   S   E   N   v   E   K   C   L   T   Q   A   F   DP   L   G   I   S   D   W   N   S   L   F   W   I   A   H   PP   L   G   I   S   D   W   N   S   L   F   W   I   A   H   PG   G   P   A   I   L   D   A   V   E   A   K   L   N   L   EG   G   P   A   I   L   D   A   V   E   A   K   L   s   L   dK   K   K   L   E   A   T   R   H   V   L   S   E   Y   G   NK   q   K   L   n   A   T   R   H   i   L   S   E   Y   G   NM   S   S   A   C   V   L   F   I   L   D   E   M   R   K   KM   S   S   A   C   V   L   F   I   L   D   E   M   R   K   KS   L   K   G   E   K   A   T   T   G   E   G   L   D   W   GS   h   K   G   E   K   A   T   T   G   E   G   L   D   W   GV   L   F   G   F   G   P   G   L   T   I   E   T   V   V   LV   L   F   G   F   G   P   G   L   T   I   E   T   V   V   LH   S   I   P   M   V   T   NH   S   I   P   M   V   T   N

RS1：来自龙眼；RS2：来自藤稔。

2.根据权利要求1所述的编码三羟基芪合酶氨基酸的核苷酸序列分别选自于下列RS1和RS2之一。

RS1：ATCC                                                4

RS2：ATCC

     ATG GCT TCA GTC GAG GAA TTT AGA AAC GCT CAA CGT GCC AAG GGT CCG 52

     ATG GCT TCA GTC GAG GAA aTc AGA AAt GCT CAA CGT GCC AAG GGT CCGGCC ACC ATC CTA GCC ATT GGC ACA GCT ACC CCC GAC CAC TGT GTC TAC  100GCC ACC ATC CTA GCC ATT GGC ACA GCT ACC CCC GAC CAC TGT GTC TACCAG TCT GAT TAT GCT GAT TAC TAT TTC AGG GTC ACT AAG AGC GAG CAC  148CAG TCT GAT TAT GCT GAT TAC TAT TTC AGG GTC ACT AAG AGC GAG CACATG ACT GAG TTG AAG AAG AAG TTC AAT CGC ATA TGT GAC AAA TCA ATG  196ATG tCT GAG TTG AAG AAG AAG TTC AAT CGC ATA TGT GAC AAA TCA ATGATC AAG AAG CGT TAC ATT CAC TTG ACC GAA GAA ATG CTT GAG GAG CAC  244ATC AAG AAG CGT TAC ATT CAT TTG ACg GAA GAA ATG CTT GAG GAG CACCCA AAC ATT GGT GCT TAT ATG GCT CCA TCT CTT AAC ATA CGC CAA GAG  292CCA AAC ATT GGg GCT TAT ATG GCT CCA TCT CTT AAC ATA CGC CAA GAGATT ATC ACT GCT GAG GTA CCT AGA CTT GGT AGA GAT GCA GCA TTG AAG  340ATT ATC ACT GCT GAG GTA CCc AaA CTT GGg Aag GAa GCA GCA TTG AAGGCT CTT AAA GAG TGG GGC CAA CCA AAG TCC AAG ATC ACC CAT CTT GCA  388GCT CTT AAg GAG TGG GGC CAA CCc AAa TCa AAG ATC ACC CAT CTT GtATTT TGT ACA ACC TCC GGT GTA GAA ATG CCC GGT GCG GAT TAC AAA CTC  436TTT TGT ACC ACC TCG GGT GTA GAA ATG CCt GGT GCa GAT TAt AAA CTCGCT AAT CTC TTA GGT CTT GAA ACA TCG GTT AGA AGG GTG ATG TTG TAC  484GCT AAT CTC TTA GGT CTc GAA ACA TCG GTT AGA AGa GTG ATG TTG TACCAT CAA GGG TGC TAT GCA GGT GGA ACT GTC CGG CGA ACT GCT AAG GAT  532CAT CAA GGG TGC TAT GCA GGT GGA ACT GTC Ctt aGA ACa GCT AAG GATCTT GCA GAA AAT AAT GCA GGA GCA CGA GTT CTT GTG GTG TGC TCT GAG   580CTT GCA GAg AAT AAT GCA GGA GCA aGA GTT CTT GTG GTG TGC TCT GAGATC ACT GTT GTT ACA TTC CGT GGG CCT TCC GAA GAT GCT TTG GAC CCT   628ATC ACa GTT GTT ACA TTt CGT GGg CCT TCC GAA GAT GCT TTG GAC tCTTTA GTT GGC CAA GCC CTT TTT GGT GAT GGG TCT TCA GCT GTG ATT GTT   676TTA GTT GGC CAA GCC CTT TTT GGT GAT GGG TCT GCA GCT GTa ATT GTaGGA TCA GAT CCA GAT GTC TCG ATT GAA CGA CCA CTC TTC CAA CTT GTT   724GGA TCA GAT CCA GAT GTC TCa ATT GAA CGA CCA CTC TTC CAg CTT GTtTCA GCA GCC CAA ACA TTT ATT CCT AAT TCA GCA GGA GCC ATT GCC GGA   772TCA GCA GCC CAA ACA TTT ATT CCT AAT TCt GCA GGt GCa ATT GCa GGAAAC TTA CGT GAG GTG GGG CTC ACC TTT CAT TTG TGG CCC AAT GTG CCT   820AAC TTA CGT GAG GTG GGa CTC ACC TTT CAT TTG TGG CCC AAT GTG CCcACT TTG ATT TCT GAG AAC ATA GAG AAA TGC TTG ACT CAG GCT TTT GAC   868ACT TTG ATT TCT GAG AAC gTA GAG AAA TGt TTG ACT CAG GCT TTT GACCCA CTT GGT ATT AGC GAT TGG AAC TCG TTA TTT TGG ATT GCT CAC CCA   916CCA CTT GGT ATT AGC GAT TGG AAC TCC TTA TTT TGG ATT GCT CAC CCAGGT GGC CCT GCA ATT CTC GAT GCA GTT GAA GCA AAA CTC AAT TTA GAG   964GGT GGC CCT GCA ATT CTt GAT GCg GTT GAA GCA AAA CTC AgT TTA GAtAAA AAG AAA TTG GAA GCA ACT AGG CAT GTG TTA AGT GAG TAC GGT AAC  1012AAg cAa AAA cTc aAt GCA ACa AGG CAT aTt cTA AGT GAa TAt GGa AACATG TCA AGT GCA TGT GTG TTG TTT ATT TTG GAT GAG ATG AGA AAG AAA  1060ATG TCA AGc GCA TGT GTG TTG TTT ATT TTG GAT GAG ATG AGA AAG AAATCC CTA AAG GGG GAA AAA GCC ACC ACT GGT GAA GGA TTG GAT TGG GGA  1108TCC Cat AAG GGG GAg AAg GCC ACC ACa GGT GAA GGA TTG GAT TGG GGAGTA CTA TTT GGT TTT GGG CCA GGC TTG ACC ATC GAA ACT GTT GTG CTA  1156GTA tTA TTc GGT TTT GGa CCA GGC TTG ACt ATt GAA ACT GTT GTG tTgCAT AGC ATT CCT ATG GTT ACA AAT TAA GTG AAG                      1189CAT AGC ATT CCT ATG GTT ACA AAT TAA GTG AAGRS1：来自龙眼；RS2：来自藤稔。

3.一种重组质粒，它含有权利要求1所述的三羟基芪合酶结构基因。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，它是pBRS1和pBRS2。

5.根据权利要求3所述的重组质粒，它是pBV221-RS1和pBV221-RS2

6.一种重组微生物，是由权利要求3所述重组质粒转化原核微生物获得的。

7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于所述微生物是大肠杆菌。

8.能在植物中组成性表达的重组质粒，其特征在于将权利要求1所述的三羟基芪合酶结构基因与pBin438连接获得的。

9.重组原核微生物，含有权利要求8所述的重组质粒。

10.根据权利要求9所述的重组微生物，其中所述微生物是大肠杆菌。

11.根据权利要求9所述的重组微生物，  其中所述微生物是农杆菌。

12.制备组成性表达三羟基芪的转基因植物的方法，其特征在于将权利要求11所述的含有能在植物中组成性表达的重组质粒的农杆菌与植物外植体共培养，然后由外植体再生为植株。

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