CN109311893B

CN109311893B - 含有取代环戊基的吡咯并嘧啶化合物

Info

Publication number: CN109311893B
Application number: CN201780037341.8A
Authority: CN
Inventors: 祝力; 刘洋健; 张传玉; 王鹤; 罗鸿; 孙颖慧; 韩永信
Original assignee: Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd; Lianyungang Runzhong Pharmaceutical Co Ltd; Shouyao Holdings Beijing Co Ltd
Current assignee: Capital Pharmaceutical Holdings Beijing Co ltd; Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd; Lianyungang Runzhong Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-06-16
Filing date: 2017-06-15
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2037-06-15
Also published as: US20190183899A1; US10617692B2; CN109311893A; WO2017215628A1; CN107513067A

Abstract

一种含有取代环戊基的吡咯并嘧啶化合物，具体涉及式A所示的化合物、其立体异构体、或其药学上可接受的盐。还涉及制备如式A所示的含有取代环戊基的吡咯并嘧啶化合物的方法、药物组合物、以及该化合物在治疗两面神激酶介导的疾病中的用途。

Description

含有取代环戊基的吡咯并嘧啶化合物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年06月16日向中国国家知识产权局提交的第201610427950.1号中国专利申请的优先权和权益，所述申请公开的内容通过引用整体并入本文中。

技术领域

本申请属于医药化学领域。本申请涉及含有取代环戊基的吡咯并嘧啶化合物、药物组合物以及其用于治疗两面神激酶介导的疾病的用途。

背景技术

蛋白激酶(Protein kinases，PK)又称蛋白质磷酸化酶(Proteinphosphakinase)，是一类催化蛋白质磷酸化反应的酶。蛋白激酶通过催化蛋白的磷酸化从而发挥其生理学功能，包括细胞生长、存活和分化、器官形成和形态变化、新血管的生成、组织修复和再生。除了正常生理功能外，许多蛋白激酶在人类的疾病(例如癌症)中起着重要的作用。蛋白激酶的一个亚组致癌蛋白激酶在失调时可引起肿瘤的形成和生长，并进一步导致肿瘤转移和发展。迄今，致癌蛋白激酶是癌症疾病治疗最重要的靶标之一。

蛋白激酶可分为受体型和非受体型。非受体型酪氨酸激酶(PTK)的亚家族中包括两面神激酶(JAK)，对于非受体型酪氨酸激酶的详细情况可参见Bolen JB.Nonreceptortyrosine protein kinases.Oncogene.1993，8(8)：2025-31。

两面神激酶(Janus kinase，JAK)是一类非受体型酪氨酸激酶(PTK)，其存在于细胞内，通过JAK-STAT通路传导细胞因子刺激信号。JAK-STAT通路将细胞外的化学信号经细胞膜传导入位于细胞核内DNA上的基因启动子上，最终影响细胞中DNA转录与活性水平发生改变。JAK-STAT通路由三个主要部分组成：1)受体；2)两面神激酶(JAK)和3)信号转导和转录激活蛋白(STAT)。所述受体可由干扰素、白细胞介素、生长因子或其它化学信使激活，激活导致JAK自身磷酸化；接下来STAT蛋白与磷酸化受体结合，使得STAT被JAK磷酸化；然后磷酸化STAT蛋白从受体上分离、二聚并易位到细胞核中，以结合到特异性DNA 位点并改变转录(Scott，M.J.，C.J.Godshall et al.(2002).“Jaks，STATs，Cytokines，and Sepsis”Clin Diagn Lab Immunol 9(6)：1153-9)。

JAK家族在涉及免疫应答的细胞增殖和功能性细胞因子依赖性调节中产生作用。目前，有四种已知的哺乳动物JAK家族成员：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2(Tyrosine kinase 2)。JAK蛋白的大小范围在120-140kDa，其包含7个保守的JAK同源性(JH)结构域；其中之一为功能性催化激酶结构域，而另一个为假性激酶(pseudokinase)结构域，其有效地发挥调节功能和/或作为STAT的停靠位点起作用(Scott，Godshall et al.2002，supra)。

目前，两面神激酶或相关激酶的抑制剂已有报道，例如参见WO9965909、US20040198737、 WO2004099204、WO2004099205、WO200142246、WO200472063、WO9962908、WO2007070514 等。

发明概述

本申请一方面提供如式A所示的化合物、其立体异构体、或其药学上可接受的盐：

其中，R₁和R₄各自独立地选自H、羟基或氧代；R₂和R₃各自独立地选自H或氧代；条件是R₁、R₂、R₃和R₄不同时选自H。

本申请的另一方面提供了药物组合物，其包含治疗有效量的如式A所示的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

本申请的另一方面提供了用于治疗两面神激酶介导的疾病的如式A所示的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐或者上述药物组合物。

本申请的再一方面提供了如式A所示的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐或者上述药物组合物在制备用于治疗两面神激酶介导的疾病的药物中的用途。

本申请的又一方面提供了用于治疗两面神激酶介导的疾病的方法，包括给予患者治疗有效量的如式A所示的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐或者上述药物组合物。

发明详述

定义和说明

术语“羟基”指-OH基团。

术语“氧代”指＝O基团。

术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

作为药学上可接受的盐，例如，可以包括金属盐、铵盐、与有机碱形成的盐、与无机酸形成的盐、与有机酸形成的盐、与碱性或者酸性氨基酸形成的盐等。金属盐的非限制性实例包括但不限于碱金属的盐，例如钠盐、钾盐等；碱土金属的盐，例如钙盐、镁盐、钡盐等；铝盐等。与有机碱形成的盐的非限制性实例包括但不限于与三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、2，6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己胺、二环己基胺等形成的盐。与无机酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等形成的盐。与有机酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、苹果酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲基苯磺酸等形成的盐。与碱性氨基酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等形成的盐。与酸性氨基酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与天冬氨酸、谷氨酸等形成的盐。

本申请的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备，然后从反应溶液中分离盐产物固体；也可以使用其他的盐形成方法。一般地，优选醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈等非水介质。

本申请的某些化合物可以以非溶剂化形式或者溶剂化形式存在，包括水合物形式。一般而言，溶剂化形式与非溶剂化的形式相当，都包含在本发明的范围之内。本申请的某些化合物可以以多晶或无定形形式存在。

本申请的某些化合物可以具有不对称碳原子(光学中心)或双键。外消旋体、非对映异构体、几何异构体和单个的异构体都包括在本发明的范围之内。

本文中消旋体、ambiscalemic and scalemic或者对映体纯的化合物的示法来自Maehr， J.Chem.Ed.1985，62：114-120。除非另有说明，用楔形键和虚线键表示一个立体中心的绝对构型。当本文所述化合物含有烯属双键或其它几何不对称中心，除非另有规定，它们包括E、Z 几何异构体。同样地，所有的互变异构形式均包括在本发明的范围之内。

本申请的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本申请设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、Z式和E式异构体、(-)-和(+)-对对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子。所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本发明的范围之内。

可以通过手性拆分、手性合成或手性试剂或者其他常规技术制备光学活性的(R)-和(S)-异构体以及D和L异构体。如果想得到本申请某化合物的一种对映体，可以通过不对称合成或者具有手性助剂的衍生作用来制备，其中将所得非对映体混合物分离，并且辅助基团裂开以提供纯的所需对映异构体。或者，当分子中含有碱性官能团(如氨基)或酸性官能团(如羧基)时，与适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构体的盐，然后通过本领域所公知的分步结晶法或色谱法进行非对映异构体拆分，然后回收得到纯的对映体。此外，对映异构体和非对映异构体的分离通常是通过使用色谱法完成的，所述色谱法采用手性固定相，并任选地与化学衍生法相结合(例如由胺生成氨基甲酸盐)。

本申请的化合物可以在一个或多个构成该化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素标记化合物，比如氚(3H)，碘-125(125 I)或C-14(14C)。本申请的化合物的所有同位素组成的变换，无论放射性与否，都包括在本发明的范围之内。

术语“患者”是指包括哺乳动物在内的任何动物，优选小鼠、大鼠、其它啮齿类动物、兔、狗、猫、猪、牛、羊、马或灵长类动物，最优选人。

本文中使用的短语“治疗有效量”是指研究人员、兽医、医师或其它临床医师正在组织、系统、动物、个体或人中寻找的引起生物学或医学反应的活性化合物或药物的量，它包括以下一项或多项：

(1)预防疾病：例如在易感染疾病、紊乱或病症但尚未经历或出现疾病病理或症状的个体中预防疾病、紊乱或病症。

(2)抑制疾病：例如在正经历或出现疾病、紊乱或病症的病理或症状的个体中抑制疾病、紊乱或病症(即阻止病理和/或症状的进一步发展)。

(3)缓解疾病：例如在正经历或出现疾病、紊乱或病症的病理或症状的个体中缓解疾病、紊乱或病症(即逆转病理和/或症状)。

优选地，R₁和R₂选自H。

优选地，R₃和R₄中的一个为H，另一个为羟基或氧代。

在本申请的部分实施方式中，式A所示的化合物选自如下表1所示化合物：

表1

本申请所述的两面神激酶介导的疾病包括但不限于肿瘤(例如，淋巴瘤、白血病)。本申请所述的淋巴瘤可以包括但不限于霍奇金病(Hodgkins disease)或非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkins lymphoma)，所述非霍奇金淋巴瘤包括但不限于B-细胞淋巴瘤(B-celllymphoma)或T-细胞淋巴瘤(Tcell lymphoma)。本申请所述的白血病包括但不限于急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia)、慢性淋巴细胞白血病(Chroniclymphocytic leukemia)、急性粒细胞白血病(Acute myeloid leukemia)、慢性粒细胞白血病(Chronic myelocytic leukemia)。

本申请的实施例化合物具有显著的JAK(例如JAK1、JAK2、JAK3或TYK2)抑制活性。例如，在本文所述的一种或多种测定中，具有小于1000nM的JAK抑制活性，优选具有小于200nM的JAK抑制活性，更优选具有小于100nM的JAK抑制活性，特别优选具有小于30nM 的JAK抑制活性。

本申请的实施例化合物优选为JAK2选择性抑制剂，即超过对JAK1、JAK3和TYK2的选择性，选择性可以是至少1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍等。

与其他JAK抑制剂相比，本申请的一些代表性化合物还具有特别优异的药代动力学性质，作为活性成分时可以较小的剂量给患者施用，从而降低患者的治疗成本。

作为药物时，可按药物组合物的形式给予本申请化合物。可按药剂领域中熟知的方式制备这些组合物，可通过多种途径给予它们，这取决于是否需要局部或全身治疗和所治疗的区域。可局部(例如，透皮、皮肤、眼和粘膜包括鼻内、阴道和直肠递药)、肺(例如，通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过喷雾器；气管内、鼻内)、口服或肠胃外给药。肠胃外给药包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内例如鞘内或脑室内给药。可按单次大剂量形式肠胃外给药，或可通过例如连续灌注泵给药。局部给予的药用组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体剂和散剂。常规药物载体、水、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必须的或需要的。包衣避孕套(Coatedcondoms)、手套等也可以是有用的。

本申请还包括含与一种或多种药学上可接受的载体组合的以一种或多种以上本申请化合物为活性成分的药用组合物。在制备本申请的组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，通过赋形剂稀释或装入例如胶囊、小药囊、纸或其它容器形式的这种载体内。当赋形剂用作稀释剂时，它可以是固体、半固体或液体物质，用作溶媒、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是以下形式：片剂、丸剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂(固体或溶于液体溶媒)；含例如高达10％重量活性化合物的软膏剂、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液和无菌包装粉末。

适宜的赋形剂的某些实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。制剂还可含有：润滑剂例如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂例如苯甲酸甲酯和苯甲酸羟基丙酯；甜味剂和矫味剂。可通过使用本领域中已知的方法配制本申请组合物，以便在给予患者后提供速释、缓释或延迟释放活性成分的作用。

可按单位剂型配制组合物，每一剂量含约5～1000mg，更通常约100～500mg活性成分。术语“单位剂型”是指物理上分离的适宜作为用于人患者和其它哺乳动物的单一剂量单位，各单位含有与适宜的药物赋形剂混合的经计算可产生所需疗效的预定量的活性物质。

活性化合物的有效剂量的范围可很大，通常按药用有效量给药。但是，可以理解实际给予的化合物的量通常由医师根据相关情况决定，它们包括所治疗的病症、所选择的给药途径、所给予的实际化合物；患者个体的年龄、重量和反应；患者症状的严重程度等。

对于制备固体组合物例如片剂，将主要的活性成分与药物赋形剂混合，形成含本申请化合物的均匀混合物的固体预制剂组合物。当称这些预制剂组合物为均匀时，是指活性成分通常均匀地分布在整个组合物中，致使该组合物可容易地划分为同等有效的单位剂型例如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将该固体预制剂划分为上述类型的含例如约0.1～1000mg本申请活性成分的单位剂型。

可将本申请片剂或丸剂包衣或复合，得到提供长效作用优点的剂型。例如，片剂或丸剂含内剂量和外剂量组分，后者是前者的被膜形式。可通过肠溶层将两种组分隔离，肠溶层用于在胃中阻止崩解，以使内组分完整通过十二指肠或延迟释放。多种物质可用于此类肠溶层或包衣剂，此类物质包括多种高分子酸和高分子酸与此类物质如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的混合物。

其中可掺入本申请化合物和组合物，用于口服或注射给药的液体形式包括水溶液、适当矫味的糖浆剂、水或油混悬液；和用食用油例如棉子油、芝麻油、椰子油或花生油矫味的乳剂；以及酏剂和类似的药用溶媒。

用于吸入或吹入的组合物包括溶于药学上可接受的水或有机溶剂或其混合物的溶液剂和混悬液、散剂。液体或固体组合物可含有如上所述适宜的药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，通过口服或鼻呼吸途径给予组合物，实现局部或全身作用。可通过使用惰性气体，使组合物成雾化。可直接由雾化装置吸入雾化溶液，或雾化装置可与面罩帷或间歇正压呼吸机连接。可通过口服或由按适当方式递送制剂的装置通过鼻给予溶液、混悬液或粉末组合物。

给予患者的化合物或组合物的量不固定，取决于给予的药物、给药的目的例如预防或治疗；患者的状态、给药的方式等。在治疗应用时，可给予已患疾病的患者足够治愈或至少部分抑制疾病及其并发症症状的量的组合物。有效剂量应取决于所治疗的疾病状态和主治临床医师的判断，该判断取决于例如疾病的严重程度、患者的年龄、体重和一般状况等因素。

给予患者的组合物可以是上述药用组合物形式。可通过常规灭菌技术或可过滤灭菌，将这些组合物灭菌。可将水溶液包装原样使用，或冻干，给药前，将冻干制剂与无菌水性载体混合。化合物制剂的pH通常为3～11，更优选5～9，最优选7～8。可以理解，使用某些前述赋形剂、载体或稳定剂会导致形成药物盐。

本申请化合物的治疗剂量可根据例如以下而定：治疗的具体用途、给予化合物的方式、患者的健康和状态，以及签处方医师的判断。本申请化合物在药用组合物中的比例或浓度可不固定，取决于多种因素，它们包括剂量、化学特性(例如疏水性)和给药途径。例如可通过含约0.1～10％w/v该化合物的生理缓冲水溶液提供本申请化合物，用于肠胃外给药。某些典型剂量范围为约1μg/kg～约1g/kg体重/日。在某些实施方案中，剂量范围为约0.01mg/kg～约100mg/kg体重/日。剂量很可能取决于此类变量，如疾病或病症的种类和发展程度、具体患者的一般健康状态、所选择的化合物的相对生物学效力、赋形剂制剂及其给药途径。可通过由体外或动物模型试验系统导出的剂量-反应曲线外推，得到有效剂量。

本申请的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。

本申请具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本发明的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本发明的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。

本领域任何合成路线规划中的一个重要考量因素是为反应性官能团(如本发明中的氨基) 选择合适的保护基。对于经过训练的从业者来说，Greene and Wuts的(Protective Groups In Organic Synthesis，Wiley and Sons，1991)是这方面的权威。本发明引用的所有参考文献整体上并入本发明。

可按照本领域中已知的任何合适的方法，监测本文中所述反应。例如，可通过广谱方法例如核磁共振波谱(例如¹H或¹³C)、红外光谱、分光光度测定(例如UV-可见光)或质谱，或通过色谱例如高效液相色谱(HPLC)或薄层层析监测产物形成。

本申请化合物可依据文献中已知的许多制备途径制得。制备本申请化合物的合成方法的实例在以下方案中提供。

如方案1中所示，化合物I的合成由3-氧代环戊酸1开始。将3-氧代环戊酸1还原得到醇2，酯化得到乙酯3，将羟基进行保护得到酯4。将酯4用还原剂如DIBAL-H进行还原为醛5，再将醛5与化合物6进行H-W-E反应(Horner-Wadsworth-Emmons reaction)得化合物 7。化合物7再与吡唑8在碱如DBU的存在下进行Michael加成反应得到化合物9，酸性下脱除TBS保护基和SEM保护基后得到化合物I。

方案1

如方案2中所示，化合物II的合成由2-氧代环戊酸甲酯11开始。将2-氧代环戊酸甲酯 11还原得到醇12，再将羟基进行保护得到酯13。将酯13用还原剂如DIBAL-H进行还原为醛14，再将醛14与酯15进行Wittig反应得化合物16，化合物16脱除TBS保护得到化合物 17，化合物17再与吡唑8在碱如DBU的存在下进行Michael加成反应得到化合物18，最后除去SEM保护基后得到化合物II。

方案2

化合物III的合成如方案3中所示，化合物I在二氧化锰中进行氧化，即可得到化合物III。

方案3

化合物IV的合成如方案4中所示，化合物18在二氧化锰中进行氧化得到化合物19，最后脱除SEM即可得到化合物IV。

方案4

中间体氨基吡唑8的合成如流程1所述，吡咯并[2，3-b]嘧啶20作为起始原料，被合适的保护基团如SEM保护，得到化合物21，化合物21与氰基乙酸乙酯22反应生成化合物23，脱羧后得到化合物24，随后与N，N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(DMF-DMA)和水合肼一锅法生成氨基吡唑8。

流程1

具体实施例

通过具体的实施例更详细地说明本发明。为说明目的提供以下实施例，它们不应以任何方式限制本发明。本领域技术人员应容易认识到，可改变或修改多种非关键性参数，得到基本上相同的结果。按照一种或多种本文中所述的测定，发现以下实施例化合物是JAK抑制剂。

中间体8的制备

步骤A：4-氯-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶

冰浴搅拌下，在盛有4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(20.0g，130.4mmol，1.0eq.)的干燥DMF 溶液中，加入NaH(6.6g，57％含量，156.8mmol，1.2eq)。反应物室温搅拌1小时，再在冰浴冷却下滴加SEMCl(26.1g，156.5mmol，1.2eq.)。加毕，反应物冰浴搅拌1小时，加水淬灭，用乙酸乙酯萃取，合并的有机相用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，柱层析硅胶柱分离得到4-氯-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(33.4g，90％收率)。

¹HNMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ8.67(s，1H)，7.39(d，J＝3.6Hz，1H)，6.67(d，J＝3.6Hz，1H)， 5.65(s，2H)，3.53(dd，J＝9.2Hz，J＝8.0Hz，2H)，0.91(t，J＝8.4Hz，2H)，0.00(s，9H).m/z＝284[M+1]⁺。

步骤B：2-氰基-2-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)乙酸乙酯

室温搅拌下，4-氯-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(33.5g，118 mmol，1.0eq.)加入到氰基乙酸乙酯(40.1g，354.0mmol，3.0eq.)和碳酸钾(33.0g，238mmol， 2.0eq.)的混合物中。反应物升温到60℃反应0.5小时，然后升温至130℃反应1.0小时。冷却至室温，加水淬灭，用乙酸乙酯萃取，合并的有机相用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，柱层析硅胶柱分离得到2-氰基-2-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-4-基)乙酸乙酯(30.6g，72％收率)。

¹HNMR(400MHz，CDCl₃-d₃)：δ13.87(brs，1H)，8.05(s，1H)，7.44(d，J＝4.0Hz，1H)，7.20(d，J＝3.6Hz，1H)，5.57(s，2H)，4.30(dd，J＝14.4Hz，J＝7.2Hz，2H)，3.5(t，J＝8.4Hz，2H)，1.37(t，J ＝7.2Hz，3H)，0.92(t，J＝8.4Hz，2H)，0.00(s，9H).m/z＝361[M+1]⁺。

步骤C：2-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)乙腈

室温搅拌下，氯化钠(49.7g，849.0mmol，10.0eq.)加入到2-氰基-2-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)乙酸乙酯(30.6g，84.9mmol，1.0eq.)的DMSO和水的混合溶剂中。反应液氮气保护下150℃反应5天。冷却至室温，加水淬灭，用乙酸乙酯萃取，合并的有机相用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，柱层析硅胶柱分离得到 2-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)乙腈(18.4g，75％收率)。

¹HNMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ8.87(s，1H)，7.40(d，J＝3.6Hz，1H)，6.80(d，J＝3.6Hz，1H)， 5.67(s，2H)，4.15(s，2H)，3.53(t，J＝8.4Hz，2H)，0.92(t，8.4Hz，2H)，0.01(s，9H).m/z＝289[M+1]⁺。

步骤D：4-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-3-氨基-1H-吡唑

室温搅拌下，水合肼(85％，1802g，28.8mol，10.0eq.)加入到2-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)乙腈(830g，2.88mol，1.0eq.)和DMF-DMA(1029g， 8.64mol，3eq.)的DMF溶液(2.5L)中。反应液氮气保护下90℃搅拌回流3小时。冷却至室温，加1L水搅拌，抽滤，干燥得4-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 -4-基)-3-氨基-1H-吡咯(365g，39％收率)。

¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ12.20(brs，1H)，8.75(s，1H)，8.30(brs，1H)，7.71(d，J＝3.2 Hz，1H)，7.11(d，J＝3.6Hz，1H)，6.66(brs，2H)，5.70(s，2H)，3.62(t，J＝8.0Hz，2H)，0.93(t，J＝8.0 Hz，2H)，0.00(s，9H).m/z＝331[M+1]⁺。

实施例1 3-[3-氨基-4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-(3-羟基环戊基)丙腈

步骤A：3-羟基环戊烷羧酸

冰浴下，向3-羰基环戊烷羧酸(3.7g，28.9mmol)的甲醇溶液中分批加入硼氢化钠(1.64g， 43.2mmol)，加完常温搅拌，待反应完毕，向反应液中加入1M盐酸溶液，淬灭反应，除去溶剂，得粗品直接进行下一步。

步骤B：3-羟基环戊烷甲酸乙酯

向步骤A中所得粗品的乙醇溶液中，加入1.5mL浓硫酸，90℃反应过夜。待反应完，加入饱和碳酸氢钠淬灭反应，除去乙醇，浓缩物加入水，乙酸乙酯萃取，柱层析(乙酸乙酯/石油醚＝1/5)，得到消旋的3-羟基环戊烷甲酸乙酯(2.27g，50％收率)。

¹HNMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ4.30-4.34(m，1H)，4.10-4.18(m，2H)，2.82-2.90(m，1H)， 1.60-2.20(m，7H)，1.20-1.29(m，3H)。

步骤C：3-叔丁基二甲硅烷氧基环戊烷甲酸乙酯

向1H-咪唑(1.96g，28.73mmol)和叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物(2.17g，14.37mmol)的 DMF溶液中，加入3-羟基环戊烷甲酸乙酯(2.27g，14.37mmol)。混合物搅拌过夜，待原料反应完，用正己烷萃取反应液，萃取物用水洗三次，经硫酸钠干燥，除去溶剂得外消旋的3-叔丁基二甲硅烷氧基环戊烷甲酸乙酯(3.92g，100％)。

¹HNMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ4.10-4.19(m，1H)，4.05-4.09(m，2H)，2.64-2.68(m，1H)， 2.00-2.07(m，2H)，1.62-1.86(m，4H)，1.19-1.23(m，3H)，0.82-0.87(m，9H)，-0.02-0.06(m，6H)。

步骤D：3-叔丁基二甲硅烷氧基环戊烷甲醛

在-78℃下，向外消旋的3-叔丁基二甲硅烷氧基环戊烷甲酸乙酯(3.92g)的正己烷溶液中，滴加1.2M二异丁基氢化铝的甲苯溶液，反应一小时，待反应完，加入甲醇淬灭反应。饱和碳酸氢钠洗，硫酸钠干燥。柱层析(乙酸乙酯/石油醚＝1∶30)，得目标产物(2.34g，65％产率)。

¹HNMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ9.64(s，1H)，4.29-4.31(m，1H)，2.64-2.68(m，1H)，1.56-2.13(m，6H)，0.82-0.87(m，9H)，0.00-0.15(m，6H)。

步骤E：3-[3-(叔丁基二甲硅烷氧基)环戊基]丙烯腈

在冰浴下，向叔丁醇钾(246.8mg，2.2mmol)的四氢呋喃溶液中，加入氰甲基磷酸二乙酯 (426.0mg，2.4mmol)，撤去冰浴，常温搅拌15min，再重新冷却至0℃，向溶液中逐滴加入3- 叔丁基二甲硅烷氧基环戊烷甲醛(458.0mg，2.0mmol)，常温反应1h左右，反应完全，柱层析 (乙酸乙酯/石油醚＝1/60)，得到目标产物(435mg，87％产率)。

¹HNMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ6.50-6.80(m，1H)，5.16-5.29(m，1H)，4.27-4.33(m，1H)， 2.64-2.68(m，1H)，1.40-2.13(m，6H)，0.85-0.89(m，9H)，0.00-0.07(m，6H)。

步骤F：3-[3-氨基-4-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-[3-(叔丁基二甲硅烷氧基)环戊基]丙腈

3-[3-(叔丁基二甲硅烷氧基)环戊基]丙烯腈(0.8g，3.0mmol)，4-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基] 甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-3-氨基-1H-吡唑(1.0g，3.0mmol)，DBU(0.9g，6.0mmol)溶于10mL乙腈，65℃下搅拌过夜(约15h)。冷却至室温，加入20mL水，用乙酸乙酯萃取(50 mL x 3)，合并有机相后再用饱和的氯化钠溶液洗涤(100mL x 2)，最后加入无水硫酸钠干燥有机相。减压蒸馏除去有机溶剂，残余物硅胶柱层析分离(淋洗剂为二氯甲烷∶甲醇＝30∶1的混合溶剂)，分离得到3-[3-氨基-4-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4- 基)-1H-吡唑-1-基]-3-[3-(叔丁基二甲硅烷氧基)环戊基]丙腈(530mg，30％收率)，为非对映异构体混合物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ8.82(1H，s)，8.03(0.2H，s)，8.02(0.2H，s)，8.01(0.3H，s)， 8.00(0.3H，s)，7.37-7.38(1H，m)，6.68-6.71(1H，m)，5.66-5.71(4H，m)，4.26-4.40(1H，m)， 3.99-4.23(1H，m)，3.56(2H，t，J＝8.4Hz)，3.05-3.14(1H，m)，2.86-2.95(1.4H，m)，2.56-2.71(0.6 H，m)，1.40-2.16(5H，m)，0.94(2.7H，s)，0.90(2.7H，s)，0.90(1.8H，s)，0.87(1.8H，s)，0.06(2H，t，J ＝5.6Hz)，-0.03(6H，s)，-0.06(9H，s).m/z＝582[M+1]⁺。

步骤G：3-[3-氨基-4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-(3-羟基环戊基)丙腈

冰浴搅拌下，三氟乙酸(5mL)加入到3-[3-氨基-4-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H- 吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-(2-羟基环戊基)丙腈(500mg，0.86mmol)的二氯甲烷溶液(50mL)中。反应液氮气保护下室温搅拌过夜。真空浓缩，残余物用二氯甲烷溶解后，真空再次浓缩两遍。浓缩物溶于甲醇(50mL)中，加入乙二胺(5mL)，室温搅拌1小时，真空浓缩。加水和乙酸乙酯稀释，用乙酸乙酯萃取，合并的有机相用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。浓缩物经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)分离得到3-[3-氨基-4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-(3-羟基环戊基)丙腈(200mg，69％收率)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ9.38-9.46(1H，brs)，8.79(0.4H，s)，8.78(0.6H，s)，8.02-8.05 (1H，m)，7.29-7.32(1H，m)，6.64-6.67(1H，m)，5.70(1.2H，s)，5.68(0.8H，s)，4.34-4.48(1H，m)， 4.18-4.25(0.6H，m)，4.02-4.07(0.4H，m)，3.05-3.14(1H，m)，2.79-2.97(1.4H，m)，2.55-2.72(0.6H， m)，1.52-2.22(7H，m).m/z＝338[M+1]⁺。

实施例2 3-[3-氨基-4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-(2-羟基环戊基)丙腈

步骤A：2-羟基环戊烷甲酸甲酯

2-氧代环戊烷甲酸甲酯(35.0g，246.2mmol)溶于无水甲醇(300ml)，在液氮-乙醇浴中冷却至-20℃，少量分批加入硼氢化钠(10.2g，270.1mmol)，加毕，在-20℃下继续反应30分钟。随后加入600mL水淬灭反应，加入饱和柠檬酸水溶液调节pH值至4，然后用乙酸乙酯萃取产物两次(500ml/次)。合并有机相，并用饱和食盐水洗涤两次(500ml/次)。有机相用100g无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂得到淡黄色油状物为2-羟基环戊烷甲酸甲酯(22.4 g，63.2％产率)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ4.36-4.46(1H，m)，3.73(1.8H，s)，3.71(1.2H，s)，3.00(0.6H， d，J＝2.8Hz)，2.64-2.72(1H，m)，2.14(0.4H，d，J＝3.6Hz)，1.87-2.15(3H，m)，1.76-1.82(2H，m)， 1.59-1.71(1H，m).

步骤B：2-叔丁基二甲硅烷氧基环戊烷甲酸甲酯

向1H-咪唑(23.2g，342mmol)和叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物(25.7g，171mmol)的DMF 溶液(600mL)中，加入2-叔丁基二甲硅烷氧基环戊烷甲酸甲酯(22.4g，155mmol)。混合物搅拌过夜，待原料反应完，加入1.2L水，用乙酸乙酯萃取反应液(500mL x3)，有机相再用饱和的食盐水洗涤(500mLx 2)，无水硫酸钠干燥，除去溶剂得外消旋的2-叔丁基二甲硅烷氧基环戊烷甲酸甲酯(36.1g，90％)，为淡黄色油状液体。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ4.46-4.49(0.6H，m)，4.37-4.41(0.4H，m)，3.68(1.2H，s)， 3.66(1.8H，s)，2.65-2.78(1H，m)，2.14-2.23(0.6H，m)，1.98-2.04(0.4H，m)，1.84-1.94(1H，1m)， 1.65-1.80(3H，m)，1.52-1.61(1H，m)，0.87(3.6H，s)，0.85(5.4H，s)，0.04(3.6H，s)，0.02(2.4H，s).

步骤C：2-叔丁基二甲硅烷氧基环戊烷甲醛

在-78℃下，向外消旋的2-叔丁基二甲硅烷氧基环戊烷甲酸甲酯(20.0g，77.4mmol)的正己烷溶液中，滴加1.0M二异丁基氢化铝的甲苯溶液(80mL，80mmol)，反应一小时，待反应完，加入45mL甲醇淬灭反应。撤去冷浴，自然恢复至室温，然后加入浓度为10％的罗谢尔盐水溶液800mL，剧烈搅拌2h。静置分层，收集正己烷相，再用正己烷萃取水相(500mL x 2)，合并有机相。有机相用饱和的食盐水溶液洗涤(500mL x 2)，然后用无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去有机溶剂，得到2-叔丁基二甲硅烷氧基环戊烷甲醛(15.5g，87.6％)，为淡黄色油状液体。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ9.76(0.6H，d，J＝2.4Hz)，9.72(0.4H，d，J＝2.0Hz)，4.63-4.66(0.6H，m)，4.42-4.46(0.4H，m)，2.63-2.79(1H，m)，2.14-.2.23(0.6H，m)，1.56-2.04(5.4H， m)，0.89(5.4H，s)，0.87(3.6H，s)，0.07(3.6H，s)，0.06(2.4H，s).

步骤D：3-[2-(叔丁基二甲硅烷氧基)环戊基]丙烯腈

2-叔丁基二甲硅烷氧基环戊烷甲醛(12.0g，52.5mmol)和三苯基膦乙腈(31.6g，105mmol) 溶于甲苯(400mL)，氮气保护下加热至110℃，反应过夜(15h)。待反应完全，将反应冷却至室温，加水800mL淬灭反应。然后用乙酸乙酯萃取产物(600mL x 2)。合并有机相，有机相再用饱和的食盐水洗涤(700mL x 2)，然后使用无水硫酸钠干燥有机相。减压浓缩，残余物用石油醚打浆除去三苯氧膦，滤液浓缩后硅胶柱层析(淋洗剂为乙酸乙酯∶石油醚＝50∶1) 分离得到3-[2-(叔丁基二甲硅烷氧基)环戊基]丙烯腈(8.0g，60.6％收率)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ6.82(0.4H，dd，J＝16.8Hz，8.4Hz)，6.58-6.65(0.6H，m)， 5.29-5.36(1H，m)，4.19-4.26(1H，m)，2.87-2.95(0.4H，m)，2.44-2.52(0.6H，m)，1.57-1.94(6H，m)， 0.88(3.6H，s)，0.87(5.4H，s)，0.04(2.4H，s)，0.03(3.6H，s).

步骤E：3-(2-羟基环戊基)丙烯腈

3-[2-(叔丁基二甲硅烷氧基)环戊基]丙烯腈(4.0g，15.9mmol)溶于无水甲醇(40mL)，12 2M盐酸(12mL)和水(15mL)的混合溶剂中，室温下搅拌半个小时。反应完成后，加入80mL 水，然后用乙酸乙酯萃取水相(100mL x 2)，合并有机相后再用饱和的食盐水溶液洗涤(100mL x 2)，最后加入无水硫酸钠干燥有机相。减压蒸馏除去有机溶剂，硅胶柱层析分离得到3-(2- 羟基环戊基)丙烯腈(2.18g，100％)，为淡黄色油状液体。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ6.74(1H，dd，J＝11.2Hz，10.0Hz)，5.40(1H，d，J＝11.2Hz)，4.34-4.36(1H，m)，2.94-3.00(1H，m)，1.90-2.04(3H，m)，1.69-1.78(3H，m)，1.28-1.44(1H， brs).

步骤F：3-[3-氨基-4-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-(2-羟基环戊基)丙腈

3-(2-羟基环戊基)丙烯腈(1.4g，10.2mmol)，4-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-3-氨基-1H-吡唑(2.2g，6.8mmol)，DBU(2.1g，13.6mmol)溶于30mL乙腈， 70℃下搅拌过夜(约15h)。冷却至室温，加入60mL水，用乙酸乙酯萃取(60mL x 3)，合并有机相后再用饱和的氯化钠溶液洗涤(100mL x 2)，最后加入无水硫酸钠干燥有机相。减压蒸馏除去有机溶剂，残余物硅胶柱层析分离(淋洗剂为二氯甲烷∶甲醇＝100∶1的混合溶剂)，分得3-[3-氨基-4-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1- 基]-3-(2-羟基环戊基)丙腈(1.3g，40％收率)，为非对映异构体混合物。该混合物经硅胶板薄层层析分离(二氯甲烷∶甲醇＝30∶1)，分得三对异构体，分别为A1，A2及A3。

异构体A1：¹H NMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ8.80(1H，s)，8.15(1H，s)，7.34(1H，d，J＝3.6 Hz)，6.68(1H，d，J＝3.6Hz)，5.56-5.96(2H，brs)，5.66(2H，s)，4.54-4.59(1H，m)，3.87-3.93(1H， m)，3.53(2H，t，J＝8.0Hz)，3.11(1H，dd，J＝16.8Hz，8.4Hz)，2.92(1H，dd，J＝16.8Hz，2.4Hz)， 2.32-2.45(1H，m)，1.90-2.02(1H，m)，1.54-1.87(6H，m)，0.91(2H，t，J＝8.4Hz)，-0.06(9H，s). m/z＝468[M+1]⁺。

异构体A2：¹H NMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ8.80(1H，s)，8.15(1H，s)，7.35(1H，d，J＝3.6 Hz)，6.70(1H，d，J＝3.6Hz)，5.58-5.99(2H，brs)，5.66(2H，s)，4.13-4.18(1H，m)，4.00-4.05(1H， m)，3.53(2H，t，J＝8.4Hz)，3.01(1H，dd，J＝16.8Hz，8.4Hz)，2.90(1H，dd，J＝16.8Hz，3.6Hz)， 2.50-2.56(1H，m)，2.07-2.14(1H，m)，1.79-1.92(2H，m)，1.65-1.71(2H，m)，1.28-1.33(2H，m)， 0.92(2H，t，J＝8.0Hz)，-0.06(9H，s).m/z＝468[M+1]⁺。

异构体A3：¹H NMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ8.80(1H，s)，8.05(1H，s)，7.35(1H，d，J＝4.0 Hz)，6.68(1H，d，J＝4.0Hz)，5.41-5.80(2H，brs)，5.66(2H，s)，4.28-4.38(1H，m)，3.90-4.00(1H， m)，3.53(2H，t，J＝8.4Hz)，3.19(1H，dd，J＝16.8Hz，8.8Hz)，3.10(1H，dd，J＝16.8Hz，4.0Hz)， 2.33-2.43(1H，m)，2.05-2.13(1H，m)，1.56-1.87(4H，m)，1.31-1.42(2H，m)，0.92(2H，t，J＝8.0 Hz)，-0.06(9H，s).m/z＝468[M+1]⁺。

步骤G：3-[3-氨基-4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-(2-羟基环戊基)丙腈

冰浴搅拌下，三份三氟乙酸(0.5mL)分别加入到3-[3-氨基-4-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基] 甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-(2-羟基环戊基)丙腈的三对异构体A1，A2 及A3(13-57mg，1.0eq.)的二氯甲烷溶液(5mL)中。三份反应液氮气保护下室温搅拌过夜。真空浓缩，残余物用二氯甲烷溶解后，真空再次浓缩两遍。三份浓缩物分别溶于甲醇(5mL) 中，加入乙二胺(0.5mL)搅拌1小时，真空浓缩。加水和乙酸乙酯稀释，用乙酸乙酯萃取，合并的有机相用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。三份浓缩物分别经硅胶柱层析分离得到3-[3-氨基-4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-(2-羟基环戊基)丙腈 (41％-69％收率)的三对异构体2a，2b和2c。

异构体2a：¹H NMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ9.24-9.30(1H，brs)，8.80(1H，s)，8.17(1H，s)， 7.32(1H，d，J＝2.4Hz)，6.68(1H，d，J＝2.4Hz)，5.64-5.81(2H，brs)，4.55-4.61(1H，m)，3.94(1H， t，J＝4.4Hz)，3.13(1H，dd，J＝16.8Hz，8.8Hz)，2.94(1H，dd，J＝16.8Hz，3.6Hz)，2.37-2.46(1H， m)，1.94-2.05(1H，m)，1.54-1.88(6H，m).m/z＝338[M+1]⁺。

异构体2b：¹H NMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ9.77-9.88(1H，brs)，8.77(1H，s)，8.14(1H，s)， 7.29-7.30(1H，m)，6.63(1H，d，J＝2.4Hz)，6.45-5.90(2H，brs)，4.11-4.20(1H，m)，4.02-4.09(1H， m)，3.03(1H，dd，J＝16.8Hz，8.8Hz)，2.90(1H，dd，J＝16.8Hz，3.6Hz)，2.51-2.59(1H，m)， 2.08-2.15(1H，m)，1.79-1.99(2H，m)，1.57-1.73(4H，m).m/z＝338[M+1]⁺。

异构体2c：¹H NMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ9.25-9.30(1H，brs)，8.84(1H，s)，8.09(1H，s)， 7.36-7.38(1H，m)，6.71-6.73(1H，m)，5.68-5.88(2H，brs)，4.33-4.38(1H，m)，4.01-4.06(1H，m)， 3.24(1H，dd，J＝16.8Hz，9.2Hz)，3.15(1H，dd，J＝16.8Hz，4.0Hz)，2.40-2.49(1H，m)，2.13-2.20 (1H，m)，1.86-1.97(1H，m)，1.65-1.82(4H，m)，1.44-1.51(1H，m).m/z＝338[M+1]⁺。

实施例3 3-[3-氨基-4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-(3-氧代环戊基)丙腈

3-[3-氨基-4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-(3-羟基环戊基)丙腈(38mg， 0.11mmol)溶于10mL干燥的二氯甲烷溶液中，室温搅拌下加入活性二氧化锰(294mg，3.38 mmol)。反应液回流搅拌下反应3天。冷却至室温，硅藻土过滤，减压浓缩，浓缩物经硅胶板薄层层析(二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)分离，得到3-[3-氨基-4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H- 吡唑-1-基]-3-(3-氧代环戊基)丙腈(13mg，34％收率)。

¹H NMR(400MHz，CD₃OD-d₄)δ8.67(0.6H，s)，8.66(0.4H，s)，8.50(0.6H，s)，8.47(0.4H，s)， 7.42-7.43(1H，m)，6.88(0.6H，d，J＝3.6Hz)，6.87(0.4H，d，J＝3.6Hz)，4.41-4.50(1H，m)， 3.03-3.24(2H，m)，2.76-2.97(1H，m)，2.47-2.54(0.6H，m)，2.05-2.32(3.4H，m)，1.62-1.85(2H，m). m/z＝336[M+1]⁺。

实施例4 3-[3-氨基-4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-(2-氧代环戊基)丙腈

步骤A：3-[3-氨基-4-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-(2-氧代环戊基)丙腈

3-[3-氨基-4-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1- 基]-3-(2-羟基环戊基)丙腈(328mg，0.701mmol)溶于50mL干燥的二氯甲烷溶液中，室温搅拌下加入活性二氧化锰(2.1g，24mmol)。反应液回流搅拌下反应5天。冷却至室温，硅藻土过滤，减压浓缩，浓缩物经硅胶板薄层层析(二氯甲烷∶甲醇＝30∶1)分离，得到3-[3-氨基 -4-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-(2-氧代环戊基)丙腈(50mg，15％收率)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ8.79(1H，s)，8.02(0.5H，s)，7.97(0.5H，s)，7.33-7.39(1H， m)，6.65-6.69(1H，m)，5.58-6.01(2H，brs)，5.66(2H，s)，4.59-4.67(0.5H，m)，4.45-4.55(0.5H，m)， 3.53(2H，t，J＝8.0Hz)，3.43(0.5H，dd，J＝16.8Hz，4.8Hz)，3.33(0.5H，dd，J＝16.8Hz，9.2Hz)，3.21(0.5H，dd，J＝16.8Hz，9.2Hz)，3.11(0.5H，dd，J＝16.8Hz，5.6Hz)，2.63-2.78(1H，m)， 2.27-2.44(2H，m)，1.90-2.17(2H，m)，1.63-1.81(2H，m)，0.92(2H，t，J＝8.0Hz)，-0.06(9H，s). m/z＝466[M+1]⁺。

步骤B：3-[3-氨基-4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-(2-氧代环戊基)丙腈

冰浴搅拌下，三氟乙酸(1mL)加入到3-[3-氨基-4-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H- 吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-(2-氧代环戊基)丙腈(50mg，0.107mmol)的二氯甲烷溶液(5mL)中。反应液氮气保护下室温搅拌过夜。真空浓缩，残余物用二氯甲烷溶解后，真空再次浓缩两遍。浓缩物溶于甲醇(5mL)中，加入乙二胺(0.5mL)，室温搅拌0.5小时，真空浓缩。加水和乙酸乙酯稀释，用乙酸乙酯萃取，合并的有机相用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。浓缩物经硅胶板薄层层析分离得到3-[3-氨基-4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4- 基)-1H-吡唑-1-基]-3-(2-氧代环戊基)丙腈(6mg，17％收率)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃-d₃)δ9.89-9.98(1H，brs)，8.77(1H，s)，8.03(0.4H，s)，7.98(0.6H， s)，7.30-7.36(1H，m)，6.62-6.67(1H，m)，5.55-5.90(2H，brs)，4.62-4.68(0.4H，m)，4.48-4.53(0.6H， m)，3.11-3.49(3H，m)，2.61-2.80(1H，m)，2.27-2.45(2H，m)，1.89-2.17(2H，m)，1.63-1.82(1H，m). m/z＝336[M+1]⁺。

生物活性实验

1.化合物酶学活性(IC₅₀)检测

采取匀相时间分辨荧光(HTRF)方法建立了JAK2的激酶活性检测平台，进行化合物活性的测定。将化合物从1mM开始用100％DMSO进行3倍的梯度稀释(共11个浓度)，每个浓度取4μL加入到96μL的反应缓冲液中(50mM HEPES，pH7.4，10mM MgCl₂，1mM EGTA， 0.01％Tween-20，0.005％BAS，2mM DTT)混匀，然后取2.5μL加入到384孔板(OptiPlate-384，购买于PerkinElmer)，然后加入5μL的JAK2激酶(购买于Carna)，离心混匀，再加入2.5μL 的ATP(终浓度为相应的K_m值)与TK peptide(

KinEASE^TM-TK，购买于Cisbio)混合物启动反应(总反应体积为10μL)。将384孔板放于孵育箱中23℃反应120分钟，然后加入5μL 的Eu3+cryptate-labled anti-phosphotyrosine antibody(购买于Cisbio)，5uL的Streptavidin-XL-665(

KinEASE^TM-TK，购买于Cisbio)停止反应。在孵育箱中孵育1小时后，在Envision(购买于PerkinElmer)上读取荧光值(320nm激发，检测665nm与620nm的发射光，二者比值为酶活性)。每个化合物分别在11个浓度下测定酶的活性，使用GraFit6.0软件(Erithacus Software)计算数据，得到该化合物的IC₅₀值。

根据本文所述的生物学方法对上述制备的所选化合物进行分析，其结果如下：

表2化合物对JAK2激酶的抑制活性(IC₅₀)

化合物	JAK2 IC<sub>50</sub>(nM)
		Ruxolitinib	＜10
化合物II	＜10
		化合物III	＜10
化合物IV	＜30

2.化合物的血浆蛋白结合及人肝微粒体稳定性试验

游离部分测定：

应用Rapid Equilibrium Dialysis(RED)Device系统，通过平衡透析测定实验化合物的蛋白结合。该透析在37℃人血浆中进行5小时。将化合物II、化合物III和化合物IV在10μM孵育，化合物1在1和10μM孵育。通过LC-MS/MS分析，测定透析后化合物在血浆和缓冲液中的浓度。游离部分定义为缓冲液与血浆浓度的比率。

固有清除率测定：

通过在37℃、1.25mM NADPH存在下，将1μM试验化合物在人混合性别的肝微粒体(0.4 mg/mL蛋白质)中共同孵育1小时，测定固有清除率。试验化合物的消失通过LC-MS/MS在0、 10、20、30、45和60分钟进行了监测。通过应用文献中报告的标准方法，将化合物浓度下倾的斜率用于计算人的固有清除率。

表3化合物的血浆蛋白结合及人肝微粒体稳定性试验结果

注a)化合物1是(3R)-3-[3-氨基-4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-环戊基丙腈。

如表3所示，在人血浆蛋白结合实验中，与化合物1相比，化合物II、化合物III和化合物IV的游离部分更高；在人肝微粒体中，化合物II、化合物III和化合物IV比化合物1更加稳定，半衰期(T_1/2)更长，血浆清除率(CL)更低。

Claims

1.式A所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，R₁和R₂选自H；R₄选自H、羟基或氧代；R₃选自H或氧代；条件是R₁、R₂、R₃和R₄不同时选自H。

2.如权利要求1所述的式A所示的化合物，其中R₃为H，R₄为羟基或氧代；或者R₄为H，R₃为氧代。

3.化合物，选自：

4.药物组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或者权利要求4所述的药物组合物在制备治疗两面神激酶介导的疾病的药物中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述两面神激酶介导的疾病为肿瘤。