CN109310737A - 治疗代谢疾病的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了通过给予该对象治疗有效量的衍生自乙肝病毒的多肽或含该多肽的药物组合物来治疗代谢疾病如糖尿病和高脂血症的组合物和方法。

Description

治疗代谢疾病的组合物和方法
本申请包括以电子形式提交的ASCII格式的序列表，其全部内容以引用的方式纳入本文。所述ASCII格式的文件产生于2016年4月14日，文件名为13230.0001_SL.txt，文件大小为56034字节。
本公开涉及用于治疗代谢疾病如糖尿病和高脂血症的组合物和方法。在某些实施方案中，本公开涉及使用衍生自乙肝病毒的多肽治疗代谢疾病。
代谢疾病由包括碳水化合物、脂肪、脂质和矿物质在内对于生物机体的健康起重要作用的代谢物的失衡导致。例如，II型糖尿病和高脂血症代表了两种最常见的代谢疾病。包括老化、行为、遗传以及环境影响等在内的多种因素可导致代谢物的失衡，且通常是多种因素一起导致疾病的发生。患有代谢疾病的患者会表现出各种症状，包括如高血糖、高胰岛素血症、高脂血症、胰岛素抵抗，以及其它代谢物如氨基酸和矿物质的失调。通常难以确定导致代谢疾病的根本原因，这使得这些疾病难以得到有效治疗。此外，患有代谢疾病的患者极有可能出现严重代谢疾病相关并发症，如高血压、心血管疾病、肾损伤以及神经损伤等疾病。
由于代谢疾病的差异性，患有这些疾病的患者需要大量的不同的药物，靶向多种代谢途径，以同时消除多种症状。例如，某项研究显示，该研究所调查的II型糖尿病患者平均每天服用8.4种不同的药物化合物(见，如Bauer等，Diabetic Medicine，31：1078-85(2014))。患有代谢疾病的患者必须服用几种不同药物的原因之一是因为这些药物通常专门用于治疗代谢疾病的某种特定症状或针对某个代谢通路，因此不能靶向其它相关症状。不幸的是，服用多种药物会影响到患者的生活质量，并最终使疾病进程恶化。实际上，统计显示，II型糖尿病患者很难坚持药物治疗方案用药，部分原因就是疾病用药方案过于复杂。(见例如García-Pérez等，Diabetes Therapy，4：175-94(2013))。
此外，代谢疾病通常涉及复杂的信号通路网络，因此使用一种制剂靶向一个特定通路并不总是在患者中产生治疗相关的效果。例如，广泛用于器官移植以预防移植排斥的免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)已被证明能抑制钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)介导的胆汁酸摄取和HBV进入培养的肝细胞，该NTCP是Na+依赖性胆汁酸转运蛋白，将胆汁酸从血中转运到肝细胞((Watashi等，Hpatology，59：1726-37(2014)))。但是，CsA对葡萄糖代谢产生有害影响，并损伤胰岛素反应(Dresner等，Surgery，106(2)：163-69(1989))。此外，CsA可通过增加总胆固醇水平(主要是由于低密度脂蛋白(LDL)胆固醇水平增加)而在患者中引起高脂血症(Ballantyne等，JAMA，262(1)：53-56(1989))。已显示多种其它化合物能结合NTCP，但它们对NTCP未产生相同的作用，因为其中一些化合物起到抑制剂的作用，而另外一些化合物起到增强剂的作用(Kim等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，291(3)：1204-09(1999))。虽然迄今为止这些药物中大多数在代谢疾病中的治疗效果尚未被证实，但NTCP的一些增强剂对葡萄糖或脂质代谢产生的是相反的作用(见例如Beaudoin等，Appl.Physiol.Nutr.Metab.38(2)：140-47(2013)；Thelle等，N.Engl.J.Med.308(24)：1454-57(1983)；Phillips等，Br.Med.J.292：1319-21(1986)；Boden等，Circulation，85(6)：2039-44(1992))。由于具有NTCP缺陷的对象并未显示出任何明显的临床表型，还不清楚体内调节NTCP是否能产生任何治疗相关的效果(见Vaz等，Hepatology，61(1)：260-267(2015))。因此，急需开发一种新的能够同时治疗多种代谢疾病症状且效果显著。
HBV病毒包膜蛋白含有三个表面抗原蛋白：大表面抗原蛋白(L)、中表面抗原蛋白(M)、和小表面抗原蛋白(S)。这些蛋白由S基因上的一个单一的开放读框编码，起始于三个不同的翻译起始位点，即L(Pre-S1+Pre-S2+S)，M(Pre-S2+S)和S(S)。基于其包膜蛋白上的抗原性表位，HBV分为四种主要血清型(adr、adw、ayr和ayw)，根据基因组中全部核苷酸序列的变异，HBV分为8种基因型(A-H)。已发现病毒感染期间，HBV的L蛋白上的Pre-Sl区域结合NTCP((Yan等，eLife，l：e00049(2012)))。
本公开提供使用衍生自HBV的多肽治疗代谢疾病的组合物和方法。在一些实施方案中，本文所述的多肽包括衍生自HBV任一基因型A、B、C、D、E、F、G和H中的pre-S1区域的多肽。本公开进一步提供衍生自HBV的能改变受试者(包括人以及药学上相关的动物模型)的代谢如葡萄糖代谢和脂质代谢的多肽。
在一些方面，本公开提供一种药物组合物，该组合物含有本文所述的多肽，其中，当给予需要的对象时，该药物组合物提供能使受试者中NTCP-介导的胆汁酸摄取进行双向调节的多肽血清浓度。
在一些方面，本公开提供治疗代谢疾病的方法，包括给予对象本文所述的治疗有效量的多肽或含有该多肽的药物组合物，使所给予的多肽的血清浓度能使NTCP-介导的胆汁酸摄取在受试者中进行双向调节，其中所述多肽含有衍生自HBV的氨基酸序列。
在一些方面，本公开涉及降低高血脂受试者的总血清脂质水平的方法，通过给予该对象本文所述的治疗有效量的多肽或含有该多肽的药物组合物，使所给予的多肽的血清浓度能允许对该对象中的NTCP-介导的胆汁酸摄取进行双向调节。在一些实施方案中，所述血清脂质可包括如总胆固醇(TC)、甘三酯(TG)和LDL-C。
在某些方面，本公开还涉及降低高血糖受试者中的血糖水平的方法，包括给予该受试者本文所述的治疗有效量的多肽或含有该多肽的药物组合物。
在一些实施方案中，当所述对象中给予的多肽的血清浓度为93nmol/L或以下时，该多肽增强该对象中NTCP-介导的胆汁酸摄取。在一些实施方案中，当所述对象中给予的多肽的血清浓度高于93nmol/L时，该多肽抑制该对象中NTCP-介导的胆汁酸摄取。在一些实施方案中，对象中多肽的血清浓度在给药后约20分钟时达到峰值浓度(即Cmax)。因此，在一些实施方案中，本文所述多肽的Tmax约为20分钟。在一些实施方案中，该峰值浓度为高于93nmol/L。
在一些实施方案中，给予本文所述多肽的用药对象患有代谢疾病，或存在患代谢疾病的风险。在一些实施方案中，所述代谢疾病涉及脂质代谢的失调。在一些实施方案中，所述代谢疾病是胆固醇紊乱相关的疾病。在一些实施方案中，所述代谢疾病是高脂血症(如高甘油三酯血症、高胆固醇血症或其组合)。在一些实施方案中，所述代谢疾病涉及葡萄糖代谢失调。在一些实施方案中，所述代谢疾病是高血糖症。在一些实施方案中，所述代谢疾病是糖尿病或肥胖。在一些实施方案中，所述对象患有心血管疾病(如动脉粥样硬化)，心脏疾病或肾脏损伤，或存在患心血管疾病(如动脉粥样硬化)，心脏疾病或肾脏损伤的风险。
在一些实施方案中，本文所述的多肽能降低或稳定对象体内与代谢相关的一种或多种化学或生物分子的水平或活性。所述与代谢相关的化学或生物分子选自葡萄糖、胆固醇，甘三酯、游离脂肪酸、氨基酸、激素、LDL-C、HDL-C、HbA1c、血尿素氮和矿物质。在一些实施方案中，本文所述的多肽还能降低或稳定用于衡量代谢变化的一种或多种生理参数的水平或值。所述生理参数选自血糖、血压、体重、脂肪量、体重指数(BMI)、炎症、动脉粥样硬化指数、心脏指数、肾脏指数、总脂肪指数和稳态模型评估(HOMA)指数。
在一些实施方案中，本文所述的多肽含有衍生自HBV基因型A、B、C、D、E、F、G或H的pre-S1区域的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文所述的多肽含有HBV基因型C的pre-S1区域的氨基酸13-59序列。在其它实施方案中，本文所述的多肽含有与HBV基因型C的pre-S1区域的氨基酸13-59的氨基酸序列相对应的衍生自任何其它基因型的HBV的pre-S1区域的序列。在一些实施方案中，所述多肽含有选自SEQ ID NO：21-40任一所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述多肽的一个或多个氨基酸残基被删除、取代或插入，但该多肽仍保留结合NTCP并双向调节NTCP介导的胆汁酸向肝细胞的转运的能力。在某些实施方案中，本文所述的多肽含有来自HBV基因型A、B、C、D、E、F、G或H的pre-S1区域的天然侧接氨基酸序列。在其它实施方案中，本文所述的多肽与SEQ ID NO：21-40所示的任一氨基酸序列具有至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％是相同的。在一些实施方案中，所述多肽含有对应于HBV基因型C的pre-S1区域氨基酸13的甘氨酸和/或对应于HBV基因型C的pre-S1区域氨基酸20的天冬酰胺。
在一些实施方案中，本文所述多肽含有能使该多肽稳定的N末端疏水基团修饰和/或C末端修饰。疏水基团可选自例如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、胆固醇和花生四烯酸。C末端修饰可选自如酰胺化(胺化)、异戊二醇化以及任何能稳定该多肽的C末端修饰。在某些实施方案中，本文所述的多肽N端具有肉豆蔻酸修饰，和/或C端具有胺化修饰。在一些实施方案中，本文所述的多肽含有选自SEQ ID NO：21-40的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的多肽含有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列。
一方面，本文所述的多肽能减少一种或多种与代谢疾病相关的症状。在一些实施方案中，在给予治疗有效量的至少一种第二药剂之前、同时或之后给予本文所述的多肽或含所述多肽的药物组合物。所述第二药剂可选自如抗高血脂药、抗高血糖药、抗糖尿病药、抗肥胖药和胆汁酸类似物。例如，所述第二药剂可选自如胰岛素、二甲双胍(metformin)、西他列汀(sitagliptin)、考来维仑(colesevelam)、格列甲嗪(glipizide)、辛伐他汀(simvastatin)、阿伐他汀(atorvastatin)、依泽替米贝(ezetimibe)、非诺贝特(fenofibrate)、烟酸、奥利斯特(orlistat)、氯卡色林(lorcaserin)、苯丁胺(phentermine)、托吡酯(topiramate)、奥贝胆酸和熊脱氧胆酸。
在一些实施方案中，本文所述的多肽或含该多肽的药物组合物通过包括例如肠胃外、肺内、鼻内、病灶内、肌肉、静脉、动脉、腹膜内以及皮下在内的至少一种给药方式给予到对象。在一些实施方案中，本文所述的多肽或含所述多肽的药物组合物皮下给药给予对象。
附图说明
图1A显示采用高压液相色谱法(HPLC)测得的Cmyr-47纯度的示图。图1B显示经质谱证实的Cmyr-47的分子量的示图。
图2A显示FIFC标记的Cmyr-47结合树鼩原代肝细胞。图2B显示FIFC标记的Cmyr-47结合人肝细胞衍生的HepG2细胞系。
图3阐述了FIFC标记的Cmyr-47结合表达NTCP的L02细胞(NTCP-L02)，但不结合作为对照的L02细胞(BLANK-L02)。
图4显示FIFC标记的Cmyr-47结合表达NTCP的HEK293细胞(NTCP-293)，不结合作为对照的HEK293细胞(BLANK-293)。FIFC标记的衍生自苍鹭HBV的多肽用作对照多肽。
图5A显示Cmyr-47对体外胆汁酸摄取的作用。环孢霉素A(CsA)用作阳性对照。图5B阐述了Cmyr-47对胆汁酸摄取的双向效果。图5C和5D显示CsA对体外胆汁酸摄取的作用，并证实CsA的抑制效果。图5E和5F分别显示HBV衍生多肽在相当于62.5ng/ml(11.58nmol/L)Cmyr-47的低浓度和相当于1μg/ml(185.23nmol/L)Cmyr-47的高浓度时对体外胆汁酸摄取的作用。
图6显示用Cmyr-47或CsA处理4周后高血脂黄金地鼠的血清总胆固醇(TC)的变化。PBS处理的正常饮食喂食的黄金地鼠作为“正常对照”，而PBS处理的高脂饮食喂食的金黄地鼠则用作“模型对照”。给予非诺贝特(“阳性处理”)的高脂血症金黄地鼠则用作阳性对照。
图7A显示用衍生自HBV的多肽处理之前血清TC的水平。图7B显示处理4周后血清TC的水平。
图8描述Cmyr-47处理4周期间高脂血症黄金地鼠血清甘三酯(TG)的变化。
图9A显示用衍生自HBV的多肽处理前血清TG的水平。图9B显示处理4周后血清TG的水平。
图10描述Cmyr-47处理4周后高血脂金仓鼠血清LDL-C的水平。
图11A显示用衍生自HBV的多肽处理前血清LDL-C的水平。图11B显示处理4周后血清LDL-C的水平。
图12显示Cmyr-47处理4周后高脂血症金黄地鼠血清HDL-C的水平。
图13描述Cmyr-47处理4周后高脂血症金黄地鼠的动脉粥样硬化指数(AI)。
图14描述Cmyr-47处理4周后高血脂金黄地鼠血清总胆汁酸(TBA)的变化。作为比较，也检测了非诺贝特和CsA处理后的结果。
图15显示用三种不同剂量的Cmyr-47(1mg/kg，3mg/kg和10mg/kg)处理4周的高脂症金黄地鼠血清TC的变化。PBS处理的正常饮食金黄地鼠用作“正常对照”，PBS处理的高脂血症金黄地鼠则用作“模型对照”。
图16显示用1mg/kg，3mg/kg或10mg/kg的Cmyr-47处理4周的高脂血症金黄地鼠血清TC的变化。
图17显示和用Cmyr-47或CsA处理4周期间Zucker糖尿病肥胖大鼠中血清葡萄糖(GLU)的变化。PBS处理的Zucker瘦大鼠用作“正常对照”，而PBS处理的Zucker糖尿病肥胖大鼠用作“模型对照”。用二甲双胍(阳性处理)处理的Zucker糖尿病肥胖大鼠则用作阳性对照。
图18A显示用衍生自HBV的多肽处理前血清GLU的水平。图18B显示处理4周后血清GLU的水平。
图19显示Cmyr-47处理4周期间Zucker糖尿病肥胖大鼠HbA1c的变化。
图20A显示用衍生自HBV的多肽处理前HbA1c的水平。图20B显示处理4周后HbAlc的水平。
图21显示Cmyr-47处理4周期间Zucker糖尿病肥胖大鼠胰岛素的变化。
图22显示Cmyr-47处理4周期间Zucker糖尿病肥胖大鼠血清TC的变化。
图23A显示用衍生自HBV的多肽处理前血清TC的水平。图23B显示处理4周后血清TC的水平。
图24显示Cmyr-47处理4周期间Zucker糖尿病肥胖大鼠血清TG的变化。
图25A显示用衍生自HBV的多肽处理前血清TG的水平。图25B显示处理4周后血清TG的水平。
图26显示Cmyr-47处理4周后Zucker糖尿病肥胖大鼠血尿素氮(BUN)的水平。
图27A-C描述Cmyr-47处理4周后Zucker糖尿病肥胖大鼠的心脏指数、肾脏指数和总脂肪指数。“Cmyr-47(Lo)”对应于10mg/kg/d的Cmyr-47剂量，而“Cmyr-47(Hi)”对应于30mg/kg/d的Cmyr-47剂量。
图28显示Cmyr-47处理4周后Zucker糖尿病肥胖大鼠血清TBA的水平。
具体实施方式
除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语与本公开所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义一致。出于本公开的目的，下述术语如下文所定义。
冠词“一”指一个或一个以上(即至少一个)的该冠词的语法宾语。例如，“一元件”指一个元件或一个以上的元件。
除非文中另有清楚说明，否则术语“或者”与术语“和/或”可互换使用。
就术语“含有”、“包括”、“具有”或其语法变体在本公开或权利要求书中使用的范畴而言，这些术语可以与术语“包含”于权利要求中被用作过渡词时所解释的相类似的方式使用。术语“包括”或其语法变体指“包括但不限于”，且可与“包括但不限于”互换使用。
术语“约”指一定量、水平、值、数值、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度，其相较于参比的量、水平、值、数值、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度具有差不多30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的变化。当术语“约”与一数值范围一起用时，该术语修饰该范围，将其界限扩大到高于或低于该数值。通常，术语“约”修饰一数值时，意指高于和低于该数值10％以内。
I、多肽
本公开的某些方面提供用于治疗代谢疾病(包括如糖尿病和高脂血症)的衍生自HBV的多肽。所述多肽可衍生自HBV的pre-S1区，并能体外结合NTCP，例如在溶液中或在无细胞体系中(如细胞裂解液或在重新构建的体系中)，或在细胞中，如离体培养的细胞(如表达NTCP的细胞，或肝细胞)中，或在对象的体内细胞中结合NTCP。所述的对象可以是哺乳动物。在一些实施方案中，所述的对象可以是人。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可交互使用，包括全长蛋白和片段，以及全长蛋白和片段的变体。本文所述多肽的这些片段和变体至少保留了所述多肽结合NTCP并双向调节NTCP介导的胆汁酸向肝细胞的转运的生物学活性。“多肽”、“肽”和“蛋白质”可包括天然的和/或非天然的氨基酸残基。这些术语还包括翻译后修饰的蛋白质，包括例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、和/或磷酸化的蛋白质。这些术语还包括在一个或多个氨基酸残基(例如N末端和/或在C末端的氨基酸残基)进行了化学修饰的蛋白质。例如，本文所述多肽的N末端可被疏水基团(如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、胆固醇和花生四烯酸)修饰。在一些实施方案中，本文所述的多肽的C末端可被修饰以稳定该多肽。C末端修饰可选自酰胺化(胺化)、异戊二醇化以及任何能稳定该多肽的C末端修饰。
本文所用术语“衍生自HBV的多肽”或“HBV衍生多肽”指多肽的起源或来源是HBV，可包括天然的、重组的、合成的或纯化的多肽。术语“衍生自HBV的多肽”或“HBV衍生多肽”指全长的天然HBV多肽或其片段，以及全长天然多肽或其片段的变体。在一些实施方案中，片段可由至少3-5个氨基酸、至少5-10个氨基酸、至少10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸、至少30-50个氨基酸组成，或由天然序列的全部氨基酸组成，或可由本领域普通技术人员鉴别为来源于所述天然序列。在一些实施方案中，本文所述的多肽可衍生自任何HBV亚型L蛋白的pre-S1区域。在一些实施方案中，本文所述的多肽可含有任意HBV亚型L蛋白的整个pre-S1区。在某些实施方案中，本文所述的多肽可衍生自HBV基因型A、B、C、D、E、F、G和H中的任意一种的L蛋白的pre-S1区。这些HBV基因型的基因组序列可分别见于GenBank登录号KC875260(SEQ ID NO：41)、AY220704(SEQ ID NO：42)、AF461363(SEQ ID NO：43)、AY796030(SEQ ID NO：44)、AB205129(SEQ ID NO：45)、DQ823095(SEQ ID NO：46)、HE981176(SEQ IDNO：47)和AB179747(SEQ ID NO：48)。在某些实施方案中，本文所述的多肽可衍生自HBV基因型C的L蛋白的pre-S1区。本文所述的衍生自HBV的多肽保留了相应天然HBV多肽的本文所述的一种或多种生物学活性，至少包括该多肽结合NTCP并双向调节NTCP介导的胆汁酸向肝细胞的转运的生物学活性。
本文所用的与本文所述多肽、衍生自HBV的多肽或HBV衍生多肽相关的“变体”指与给定多肽(即本文所述多肽，衍生自HBV的多肽或HBV衍生多肽)在氨基酸序列上存在差异但保留了给定多肽的本文所述的一种或多种生物学活性。本文所述的变体多肽至少保留了该多肽结合NTCP并双向调节NTCP介导的胆汁酸向肝细胞的转运的生物学活性。本文所述的变体多肽相对于给定多肽可具有一个或多个氨基酸增加(如插入)、删除或取代。在一些实施方案中，相对于给定多肽，本文所述的变体多肽可具有1-30、1-20、1-10、1-8、1-5或1-3个(包括这些范围内的所有整数)氨基酸增加(如插入)、删除或取代。例如，多肽序列可含有氨基酸的保守取代。氨基酸的保守取代，即用具有相似性质(如亲水性和带电程度和带电区域的分布)的不同氨基酸取代一氨基酸，通常涉及较小的变化，因此不会明显改变多肽的生物学活性。这些小变化可部分通过基于该氨基酸的疏水性和电荷来考虑氨基酸的亲水指数而得以鉴定。具有类似亲水指数和亲水性数值的氨基酸可相互取代，并仍然保留蛋白质功能。氨基酸的亲水指数和亲水性数值受该氨基酸的特定侧链的影响。与此观察一致，与生物学功能相匹配的氨基酸取代依赖于氨基酸的相对相似性，尤其是那些氨基酸的侧链，表现为疏水性、亲水性、带电情况、大小和其它特性。
术语“变体”还包括与给定多肽具有一定相同性，如具有至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％与给定多肽的相同性。本文所用的“变体”还包括含有给定多肽对应于HBV蛋白的天然序列的一部分的多肽。“变体”还可指融合蛋白或嵌合蛋白，含有衍生自两种或多种不同来源的蛋白的多肽。本文所述的融合蛋白的非限制性例子可包括如衍生自HBV的一条多肽与衍生自非HBV蛋白的另一条多肽的融合蛋白，衍生自不同的HBV亚型的两条多肽的融合蛋白，以及衍生自任一HBV亚型L蛋白的不同区域的两条多肽或衍生自任一HBV亚型L蛋白pre-S1区域内的不同序列的两条多肽的融合蛋白。
术语“变体”还包括含有与给定多肽(即本文所述多肽，衍生自HBV的多肽或HBV衍生多肽)相同的氨基酸序列，保留该给定多肽的一种或多种生物学活性，但以不同于该给定多肽的方式进行了化学和/或翻译后修饰的多肽。“变体”还可用于描述已被差别化处理，如蛋白质水解、磷酸化或其它翻译后修饰，但保留了结合NTCP和双向调节NTCP介导的胆汁酸向肝细胞的转运的生物学活性。本文中，除非另有说明，“变体”包括变体的片段。术语“变体”还包括在不同病毒种类、菌株或嗜肝病毒属亚型中发现的同源性多肽序列。基于其包膜蛋白上的抗原性表位，HBV分为四种主要血清型(adr、adw、ayr和ayw)，根据基因组中全部核苷酸序列的变异性，HBV分为8种基因型(A-H)。因此，术语“变体”包括这些发现于HBV亚型中的任意一种同源性多肽。“变体”还可包括在N和/或C末端添加有来自任一这些HBV亚型的天然侧接氨基酸序列的多肽。
术语“保守性氨基酸取代”和“保守取代”在本文中可交互使用，指一组氨基酸范围内的指定氨基酸交换，其中，一氨基酸与具有类似大小、结构、电荷和/或极性的不同氨基酸交换。具有类似侧链的氨基酸残基家族为本领域所周知，包括碱性侧链(如亮氨酸、精氨酸和组氨酸)，酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)，未带电极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在一些实施方案中，多肽中的氨基酸残基可用来自相同侧链家族的另一氨基酸残基替代。在其它实施方案中，一段氨基酸序列可用结构相似、但侧链家族成员的顺序和/或组成不同的一段氨基酸序列替代。在其它实施方案中，可在该多肽的全部序列或部分序列随机引入突变。保守性氨基酸取代的例子包括如用脂族或疏水氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的一个氨基酸替换该组4个氨基酸中的另一个氨基酸；含羟基残基Ser和Thr之间的替换；酸性残基Asp和Glu之间的替换；酰胺残基Asn和Gln之间的替换；碱性残基Lys、Arg和His之间的替换；芳族残基Phe、Tyr和Trp之间的替换；和小氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly之间的替换。可合理预见到保守性取代，如用类似的、结构相关的氨基酸取代一保守的氨基酸，将不会对多肽的生物学活性产生实质性影响。
术语“序列相同性”(如与某序列具有50％的相同性)指在一比较窗口中以氨基酸对氨基酸的方式比较时序列相同的程度。在一些实施方案中，本文所述的多肽可含有一氨基酸序列，该氨基酸序列与给定多肽的序列的相同性至少约为30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，并仍然保留了该给定多肽的一种或多种生物学活性。通过在比较窗口中最优排列两条序列，测定两条序列中出现相同氨基酸的位置的数量、以获得匹配位置的数量，并将匹配位置的数量除以比较窗口中总的位置数量，将结果乘以100以得到序列相同性百分数，可计算得到“百分比相同性”或“％相同性”。用于排列于一比较窗口的最优序列排列可通过采用计算机执行本领域已知的算法，例如家族的程序，或通过肉眼观察来进行，采用所选的任一种方法产生最佳的排列(即，在比较窗口中产生最高同源性百分比)。对于序列比较，将一条序列用作参比序列，将测试序列与该参比序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参比序列输入电脑，如果有必要，可设计子序列坐标，并设定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于设定的程序参数计算该测试序列相对于该参比序列的当前的序列相同性。序列算法程序参数的设定为本领域所周知。例如，比较窗口可设定为涵盖任一或两条比较序列的全部长度，如涵盖参比序列的全部长度，同时允许存在达参比序列总氨基酸数量5％的差异。
如本文所用，本文所述多肽的“生物学活性”包括该多肽结合NTCP并双向调节NTCP介导的肝细胞中胆汁酸摄取的能力。如本文所用，分子或通路的“双向调节”指本文所述的HBV衍生多肽在某一浓度或在低于该浓度时增强该分子或通路的活性(即，起到增强剂的作用)，而在高于该浓度时抑制该分子或通路的活性(即起到抑制剂的作用)。例如，本文所述的多肽可在某个浓度或低于该浓度时结合NTCP并促进NTCP介导的肝细胞摄取胆汁酸(即，作为NTCP增强剂起作用)。在高于该浓度时，该相同的多肽还可结合NTCP，但抑制NTCP介导的胆汁酸摄取(即，作为NTCP抑制剂起作用)。在一些实施方案中，本文所述的多肽可在93nmol/L或低于93nmol/L时起到NTCP增强剂的作用，在高于93nmol/L时起到NTCP抑制剂的作用。例如，本文所述的Cmyr-47多肽可在500ng/ml或低于500ng/ml时起到NTCP增强剂的作用，在高于500ng/ml时起到NTCP抑制剂的作用。
在某些实施方案中，本文所述的多肽可在体外双向调节NTCP介导的肝细胞对胆汁酸的摄取。在某一浓度或低于该浓度时，本文所述的多肽可促进体外NTCP介导的胆汁酸摄取，而在高于该浓度时该多肽可抑制体外NTCP介导的胆汁酸摄取。在一些实施方案中，在93nmol/L或低于93nmol/L时，本文所述的多肽在体外可促进NTCP介导的胆汁酸摄取；而在高于93nmol/L时，该多肽在体外可抑制NTCP介导的胆汁酸摄取。例如，本文所述的Cmyr-47多肽可在500ng/ml或低于500ng/ml时在体外促进NTCP介导的胆汁酸摄取，在高于500ng/ml时在体外抑制NTCP介导的胆汁酸摄取。
在一些实施方案中，在用本文所述多肽处理的对象中，所给予多肽的浓度在某个血清浓度或低于该血清浓度时，该多肽可促进NTCP介导的胆汁酸摄取。所给予的多肽的血清浓度高于所述血清浓度时，则该多肽可抑制NTCP介导的胆汁酸摄取。在一些实施方案中，当用本文所述多肽处理的对象中该多肽的血清浓度为93nmol/L或低于93nmol/L时，该多肽能提高该对象中NTCP介导的胆汁酸摄取。在某些实施方案中，当用本文所述多肽处理的对象中该多肽的血清浓度高于93nmol/L时，该多肽能抑制该对象中NTCP介导的胆汁酸摄取。例如，本文所述的Cmyr-47多肽在血清浓度为500ng/ml或低于500ng/ml时能增强对象中NTCP介导的胆汁酸摄取，在血清浓度高于500ng/ml时能抑制对象中NTCP介导的胆汁酸摄取。
本文所述多肽的生物学活性还包括治疗代谢疾病或改善与代谢疾病相关的一种或多种症状的能力。生物学活性还可包括本文所述多肽预防代谢疾病发展的能力。在一些实施方案中，本文所述多肽的生物学活性可包括该多肽调节与代谢相关的一种或多种化学或生物分子的水平或活性，和/或调节衡量代谢变化的一个或多个生理学参数的水平或数值的能力。在一些实施方案中，本文所述多肽的“生物学活性”包括该多肽降低或稳定一个或多个所述化学分子或生物分子或生理参数的水平或活性的能力。在一些实施方案中，代谢指胆汁酸代谢、葡萄糖代谢、脂质代谢和/或氨基酸代谢。与代谢相关的化学或生物分子可包括如葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸、胆汁酸、氨基酸、激素如胰岛素、LDL-C、HDL-C、HbA1c、血尿素氮和矿物质。衡量代谢变化的生理参数可包括如血糖、血压、体重、脂肪量、体重指数(BMI)、炎症、动脉粥样硬化指数、心脏指数、肾脏指数、总脂肪指数和稳态模型评估(HOMA)指数。
在某些实施方案中，本文所述多肽的“生物学活性”包括该多肽增加对象血清胆汁酸水平的能力。在某些实施方案中，本文所述多肽的“生物学活性”包括该多肽通过肝细胞内的胆汁酸合成而提高胆固醇清除的能力。
在一些实施方案中，本文所述多肽的生物学活性可包括降低给予该多肽的对象中与脂质代谢相关的一种或多种化学或生物分子的血清水平的能力。在一些实施方案中，本文所述多肽的生物学活性可包括降低给予该多肽的对象血清脂质水平的能力，如甘油三酯、总胆固醇或LDL-C。
在一些实施方案中，本文所述多肽的生物学活性可包括降低给予该多肽的对象中与葡萄糖代谢相关的一种或多种化学或生物分子的血清水平的能力。在一些实施方案中，本文所述多肽的生物学活性可包括降低给予该多肽的对象中葡萄糖或HbA1c的血清水平的能力。在一些实施方案中，本文所述多肽能稳定对象中胰岛素的血清水平。
在某些实施方案中，本文所述多肽的“生物学活性”包括该多肽治疗对象的代谢紊乱的能力。在一些实施方案中，所述代谢紊乱涉及脂质代谢失衡。所述代谢疾病可包括胆固醇相关的紊乱，如高脂血症(包括高甘油三酯血症、高胆固醇血症或其组合)。在一些实施方案中，所述代谢紊乱涉及葡萄糖代谢失调。所述代谢疾病可包括如糖尿病和肥胖。
在某些实施方案中，本文所述多肽的“生物学活性”包括该多肽改善或预防所述疾病的一种或多种症状或并发症的能力。在某些实施方案中，本文所述多肽的“生物学活性”包括所述多肽减轻这些疾病对患者健康的负面影响或减少发生这些疾病的风险的能力。在某些实施方案中，本文所述多肽的“生物学活性”还包括所述该多肽降低其它相关疾病(如动脉粥样硬化和/或心血管疾病，心脏疾病，肾脏损伤，或肥胖)的严重程度或减少发展为其它相关疾病的风险的能力。
不受任何理论限制，据信本文所述多肽的这些生物学活性可能是该多肽在给予对象后依血清浓度对对象的NTCP介导的胆汁酸摄取进行的双向调节所致。在一些实施方案中，当给予本文所述多肽的对象的血中该多肽的浓度为某个浓度或低于该浓度时，该对象的胆汁酸摄取增加。在一些实施方案中，当给予本文所述多肽的对象的血中该多肽的浓度高于某个浓度时，该对象的胆汁酸摄取被抑制。在一些实施方案中，当给予本文所述多肽的对象的血中该多肽的浓度为93nmol/L或低于93nmol/L时，该对象的胆汁酸摄取增加。在一些实施方案中，当给予本文所述多肽的对象的血中该多肽的浓度高于93nmol/L时，该对象的胆汁酸摄取被抑制。例如，当给予本文所述Cmyr-47多肽的对象的血中该多肽的浓度为500ng/ml或低于500ng/ml时，该对象的胆汁酸摄取增加。当给予本文所述的Cmyr-47多肽的对象的血流中该多肽的浓度高于500ng/ml时，该对象的胆汁酸摄取被抑制。
本公开包括各种用于确定本文所述多肽的生物学活性的体内、体外和离体检测方法。本文所述多肽的体内生物学活性可通过从经该多肽处理的对象采集样品而确定。样品可以是从特定组织如肝脏、肌肉、脂肪和胰腺采集的活检样品，或者是从动物尸体解剖采集获得的速冻组织。在一些实施方案中，样品可以是从对象血液中采集的血清样品。从对象采集血清样品的各种方法为本领域所周知，包括如尾部采血、眶后穿刺(retro-orbitalpuncture)和心脏穿刺。在某些实施方案中，可通过将本文所述多肽与一细胞接触而体外确定本文所述多肽的生物学活性，所述细胞可以是转化的细胞系或是分离自动物的细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以是分离自动物的原代肝细胞。
可采用各种方法以定量的方式确定本文所述多肽双向调节NTCP的能力。例如，可用胆汁酸和逐渐增加的不同浓度梯度的本文所述多肽体外处理表达NTCP的细胞(如过表达NTCP的哺乳动物细胞或肝细胞)。加给细胞的胆汁酸可以是放射性标记的，或者是化学标记的，以用于检测。然后可收集细胞，测量被细胞摄取的胆汁酸的量。当本文所述多肽在某个浓度或低于该浓度时提高胆汁酸摄取而在高于该浓度时抑制胆汁酸摄取，则可证明该多肽具有双向调节NTCP的能力。
用于确定所述多肽的生物学活性的示例性检测方法还可包括使用采集自经本文所述多肽处理的对象的样品进行的功能分析，包括如葡萄糖生成检测，葡萄糖摄取检测，脂肪酸氧化检测，胆固醇检测，胆汁酸检测，尿素检测以及甘油三酯检测。在一些实施方案中，检测还可包括如多肽与NTCP之间的结合分析，NTCP转运胆汁酸的活性检测，或者涉及代谢中的分子因素如胆汁酸代谢、葡萄糖代谢、脂质代谢和氨基酸代谢的表达、定位或活性分析。前述确定本文所述多肽生物学活性的技术和方法可采用本说明书提供的下述本领域已知的方法进行。
在一些实施方案中，本文所述多肽可含有任一HBV亚型的pre-S1区域的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述多肽含有HBV基因型C的pre-S1区域的氨基酸13-59：GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANQVG(SEQ ID NO：23)。在其它实施方案中，本文所述的多肽可含有来自另一种HBV基因型(如来自基因型A、B、C、D、E、F、G和H中的任意一种)的相应的pre-S1序列。例如，在某些实施方案中，本文所述的多肽可含有：
HBV基因型A的pre-S1氨基酸13-59：
GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPVKDDWPAANQVG(SEQ ID NO：34)；
HBV基因型B的pre-S1氨基酸13-59：
GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFKANSENPDWDLNPNKDNWPDANKVG(SEQ ID NO：35)；
HBV基因型D的pre-S1氨基酸2-48：
GQNLSTSNPLGFFPDHQLDPAFRANTANPDWDFNPNKDTWPDANKVG (SEQ ID NO：36)；
HBV基因型E的pre-S1氨基酸12-58：
GKNISTTNPLGFFPDHQLDPAFRANTRNPDWDHNPNKDHWTEANKVG(SEQ ID NO：37)；
HBV基因型F的pre-S1氨基酸13-59：
GQNLSVPNPLGFFPDHQLDPLFRANSSSPDWDFNTNKDSWPMANKVG (SEQ ID NO：38)；
HBV基因型G的pre-S1氨基酸12-58：
GKNLSASNPLGFLPDHQLDPAFRANTNNPDWDFNPKKDPWPEANKVG (SEQ ID NO：39)；或
HBV基因型H的pre-S1氨基酸13-59：
GQNLSVPNPLGFFPDHQLDPLFRANSSSPDWDFNTNKDNWPMANKVG(SEQ ID NO：40)。
在一些实施方案中，本文所述多肽可含有HBV的pre-S1区的一部分，所述部分含有选自SEQ ID NO：23和34-40所示的至少一条氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述多肽可含有HBV的完整pre-S1区域。
在一些实施方案中，本文所述多肽长度可为10-100个氨基酸。例如，所述多肽的长度可为15-100、15-80、20-100、20-80、20-60、25-60、30-60、35-60或40-60个(包括这些范围之间的所有整数)氨基酸。在一些实施方案中，本文所述多肽的长度可以为至少20个氨基酸，例如至少25、30、35或40个氨基酸。在一些实施方案中，本文所述多肽的长度可以为20、25、30、35、40、47、55或60个氨基酸。在一些实施方案中，本文所述多肽的长度可以为47个氨基酸。本文所述多肽的长度不同的变体保留了与相应多肽相关的一种或多种生物学活性，至少包括结合NTCP并双向调节NTCP介导的胆汁酸向肝细胞转运的生物学活性。
在一些实施方案中，本文所述多肽的N末端可含有疏水基团修饰。例如，疏水基团可选自例如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、胆固醇和花生四烯酸。在一些实施方案中，所述疏水基团可选自肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和胆固醇。在一些实施方案中，所述疏水基团可以是肉豆蔻酸。在某些实施方案中，本文所述多肽可含有选自SEQ ID NO：23和34-40任一所示的氨基酸序列，其中，所述多肽的N末端可被选自肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和胆固醇的疏水基团修饰。在某些实施方案中，本文所述多肽可含有选自SEQ ID NO：23和34-40任一所示的氨基酸序列，其中，所述多肽的N末端可以被肉豆蔻酰化。在一些实施方案中，本文所述多肽可含有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，其中，所述多肽的N末端可以被肉豆蔻酰化。在一些实施方案中，本文所述多肽可含有C末端修饰，用以使多肽稳定。例如，C末端修饰可选自如酰胺化(胺化)、异戊二醇化以及任何能稳定本文所述多肽的C末端修饰。在一些实施方案中，所述C末端修饰可以是酰胺化(胺化)。例如，本文所述的多肽可含有SEQ IDNO：23所示的氨基酸序列，其N端可被肉豆蔻酰化，和/或C端可被酰胺化(胺化)。在一些实施方案中，本文所述多肽可含有SEQ ID NO：23(Cmyr-47)所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述多肽可含有选自SEQ ID NO：34-40中任一所示的氨基酸序列，其中所述多肽的N段可被肉豆蔻酰化，和/或C末端可被酰胺化(胺化)修饰。在一些实施方案中，本文所述多肽可含有选自SEQ ID NO：14-20中任一所示的氨基酸序列。本文所述多肽的在N末端和/或C末端被修饰的变体保留了未以相同方式修饰的相应多肽的一种或多种生物学活性，至少包括结合NTCP并双向调节NTCP介导的胆汁酸向肝细胞的转运的生物学活性。
本文所述多肽的变体也包括在本公开中，包括具有一个或多个氨基酸删除、取代或插入，同时保留了所述多肽的一种或多种生物学活性，所述生物学活性至少包括结合NTCP并双向调节NTCP介导的胆汁酸向肝细胞的转运的生物学活性。本文所述多肽优选保留有对应于HBV基因型C的pre-S1区域氨基酸13的甘氨酸(即SEQ ID NO：23的N末端甘氨酸)。在一些实施方案中，本文所述多肽保留了对应于HBV基因型C的pre-S1区域氨基酸20的天冬酰胺。在一些实施方案中，本文所述多肽可在HBV的pre-S1区域中具有一个或多个天然产生的突变。在一些实施方案中，相对于来自HBV的pre-S1区域的序列，本文所述多肽可具有1-30个，例如1-20个、1-10个、1-8个、1-5个或1-3个(包括这些范围内的所有整数)氨基酸缺失、取代或插入。在一些实施方案中，本文所述多肽相对于选自SEQ ID NO：23和34-40任一所示的氨基酸序列可具有1-30个，例如1-20个、1-10个、1-8个、1-5个或1-3个(包括这些范围内的所有整数)氨基酸缺失、取代或插入。在一些实施方案中，本文所述多肽相对于SEQID NO：23的氨基酸序列具有1-30个，例如1-20个、1-10个、1-8个、1-5个或1-3个(包括这些范围内的所有整数)氨基酸缺失、取代或插入。在一些实施方案中，本文所述多肽相对于SEQID NO：23的氨基酸序列具有1-3个氨基酸缺失、取代或插入。在某些实施方案中，本文所述多肽相对于选自SEQ ID NO：23和34-40任一所示的氨基酸序列在C末端具有1-30个，例如1-20个、1-10个、1-8个、1-5个或1-3个(包括这些范围内的所有整数)氨基酸缺失或插入。例如，本文所述多肽可含有选自SEQ ID NO：21、22和24-28任一所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述多肽可含有表1所列任一多肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述多肽可选自表1所列的任一翻译后修饰多肽。
表1：示例性多肽列表
在各种实施方案中，本文所述多肽与本文所述的任一多肽可具有至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。例如，所述多肽可含有一氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：21-40中任一序列具有至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在一些实施方案中，所述多肽可含有一氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：23和34-40中任一序列具有至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在一些实施方案中，所述多肽可含有一氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQID NO：23具有至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。与本文所述多肽具有一定序列相同性的变体保留了相应多肽的一种或多种生物学活性，至少包括结合NTCP并双向调节NTCP介导的胆汁酸向肝细胞转运的生物学活性。
本公开的各方面还包括本文所述多肽的具有来自HBV的L蛋白(如来自L蛋白的pre-S1区)的天然侧接氨基酸序列的变体，所述侧接氨基酸序列在所述变体的N和/或C端。所述天然侧接氨基酸序列指侧接相应HBV基因型或任意其它HBV基因型的pre-S1区域中本文所述多肽的N或C末端的天然序列。在一些实施方案中，本文所述多肽可含有选自SEQ IDNO：23和34-40所示的氨基酸序列，以及衍生自HBV基因型A-H中任一基因型的pre-S1区域侧接于N和/或C末端的天然氨基酸序列。在一些实施方案中，所述天然侧接氨基酸序列可衍生自GenBank登录号为KC875260(基因型A；SEQ ID NO：41)、AY220704(基因型B；SEQ ID NO：42)、AF461363(基因型C；SEQ ID NO：43)、AY796030(基因型D；SEQ ID NO：44)、AB205129(基因型E；SEQ ID NO：45)、DQ823095(基因型F；SEQ ID NO：46)、HE981176(基因型G；SEQ IDNO：47)或AB179747(基因型H；SEQ ID NO：48)的HBV株的共有序列。例如，本文所述多肽可含有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，并在其N和/或C端含有来自HBV基因型C的pre-S1区域的天然侧接氨基酸序列。或者，本文所述多肽可含有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，并在其N和/或C端含有来自HBV基因型A、B、D、E、F、G和H中的任一基因型的pre-S1区域的天然侧接氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述多肽的N和/或C末端可独立含有长度为1-10个，如1-8个、1-5个或1-3个(包括这些范围内的所有整数)氨基酸的天然侧接氨基酸序列。例如，本文所述多肽可含有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，并在其N端含有来自HBV基因型C的pre-S1区域的长10个氨基酸的天然侧接氨基酸序列。换言之，该多肽可含有HBV基因型C的pre-S1区域的氨基酸2-59(SEQ ID NO：29)。另一例子是，本文所述多肽可含有SEQ IDNO：23所示的氨基酸序列，并在其N端含有来自HBV基因型E或G的pre-Sl区域的长9个氨基酸的天然侧接氨基酸序列。换言之，该多肽可含有HBV基因型C的pre-Sl区域氨基酸13-59和HBV基因型E或G的pre-S1区域的氨基酸2-11(SEQ ID NO：30)。应理解的是，本文所述的任何一种多肽可具有从其N和/或C末端延伸的任意长度的天然侧接氨基酸序列，且所产生的多肽保留了原始多肽的一种或多种生物学活性，至少包括结合NTCP并双向调节NTCP介导的胆汁酸向肝细胞转运的生物学活性。
在一些实施方案中，本文所述多肽能双向调节NTCP介导的胆汁酸向肝细胞的转运。当肝细胞与某一浓度或低于该浓度的本文所述多肽接触时，与肝细胞未接触该多肽的情形相比，NTCP介导的胆汁酸向肝细胞的转运可被增加。当肝细胞与高于该浓度的本文所述多肽接触时，与肝细胞未接触该多肽的情形相比，NTCP介导的胆汁酸向肝细胞的转运可被抑制。在一些实施方案中，当肝细胞与93nmol/L或低于93nmol/L的本文所述多肽接触时，与肝细胞未接触该多肽的情形相比，NTCP介导的胆汁酸向肝细胞的转运可被增加。在一些实施方案中，当肝细胞与高于93nmol/L的本文所述多肽接触时，与肝细胞未接触该多肽的情形相比，NTCP介导的胆汁酸向肝细胞的转运可被抑制。例如，当肝细胞与500ng/ml或低于500ng/ml的本文所述的Cmyr-47多肽接触时，与肝细胞未接触该多肽的情形相比，NTCP介导的胆汁酸向肝细胞的转运可被增加。在一些实施方案中，当肝细胞与高于500ng/ml的本文所述的Cmyr-47多肽接触时，与未接触该多肽的肝细胞相比，NTCP介导的胆汁酸向肝细胞的转运可被抑制。
在一些实施方案中，本文所述多肽能调节(如降低或使之稳定)对象中与代谢相关的一种或多种化学或生物分子的水平或活性。在一些实施方案中，代谢可包括如胆汁酸代谢、葡萄糖代谢、脂质代谢或氨基酸代谢。在一些实施方案中，所述化学或生物分子选自葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸、胆汁酸、氨基酸、激素、LDL-C、HDL-C、HbA1c、血尿素氮以及矿物质。在一些实施方案中，本文所述多肽能调节(如降低或使之稳定)衡量代谢变化的一个或多个生理参数如血糖、血压、体重、脂肪量、体重指数(BMI)、炎症、动脉粥样硬化指数、心脏指数、肾脏指数、总脂肪指数和稳态模型评估(HOMA)指数的水平或值。在一些实施方案中，本文所述多肽能提高对象的血清胆汁酸水平。在一些实施方案中，本文所述多肽可降低对象血清脂质水平。在一些实施方案中，本文所述多肽可降低对象血清总胆固醇水平。在进一步的实施方案中，本文所述多肽可降低对象的血清LDL-胆固醇水平。在一些实施方案中，本文所述多肽能降低对象的血清甘油三酯水平。在一些实施方案中，本文所述多肽能降低对象的血清葡萄糖水平。在一些实施方案中，本文所述多肽能降低对象的血清HbA1c水平。在一些实施方案中，本文所述多肽能使对象血清胰岛素水平稳定。在一些实施方案中，所述对象可以是哺乳动物。在一些实施方案中，所述对象是人。在一些实施方案中，所述对象患有代谢疾病或存在患这些疾病的风险。
如本文所用，“调节”或“改变”交换使用，包括任选地以一定的量和/或统计学显著的量“降低”、“减少”、“下降”、“下调”或“抑制”一种或多种可定量参数。术语“调节”还包括任选地以一定的量和/或统计学显著的量“提高”、“增加”、“升高”、“上调”或“促进”一种或多种可定量参数。
术语“降低”、“减少”、“下降”、“下调”或“抑制”在本文中可互换使用，指与代谢相关的一种或多种化学或生物分子的水平或活性降低到低于不存在本文所述多肽时所观察到的水平或活性，或低于对照多肽产生的水平或活性，如葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸、胆汁酸、氨基酸、激素包括如胰岛素、LDL-C、HDL-C、HbA1c、血尿素氮以及矿物质。在一些实施方案中，“降低”可指衡量代谢变化的一种或多种生理参数的水平或值降低到低于不存在本文所述多肽时观察到的水平或活性，或低于对照多肽产生的水平或活性，如血糖、血压、体重、脂肪量、体重指数(BMI)、炎症、动脉粥样硬化指数、心脏指数、肾脏指数、总脂肪指数和稳态模型评估(HOMA)指数。在某些实施方案中，本文所述多肽产生的降低是低于存在无活性或减毒(attenuated)分子时所观察到的水平或活性。在一些实施方案中，本文所述多肽能降低血清和/或其它组织或器官如肝脏、心脏、肌肉、内脏脂肪、皮下脂肪、肠和大脑中葡萄糖、胰岛素、胆固醇或甘油三酯的水平。
如本文所用，对象的体重指数(BMI)值可用下式计算：BMI＝(以千克计的对象体重)/〔(以米计的该对象身高)2〕。炎症的水平可采用本领域已知的以下各种临床实验测定。例如，可测量血液中C反应蛋白(CRP)的水平，以定量测量对象炎症情况。红细胞沉降率(ESR)测试是另一测量对象炎症情况的例子。ESR测试测量一个定时间内红细胞沉降的速率。得到对象的总胆固醇(TC)和HDL-C的水平(如以mmol/L计)后，可采用下式计算动脉粥样硬化指数(AI)：AI＝(TC-HDL-C)/HDL-C。如本文所用，稳态模型评估(HOMA)指数可指HOMA-IR(定量胰岛素抵抗的水平)指数和/或HOMA-β指数(定量β-细胞功能的水平)。HOMA-IR的值可采用下式计算：HOMA-IR＝[(以mmol/L计的血糖)×(以mU/L计的血清胰岛素)]/22.5。HOMA-β的值可采用下式计算：HOMA-β＝[(20×以mU/L计的血清胰岛素)/(以mmol/L计的血糖-3.5)]％。心脏指数的值指心脏重量与总体重之比，可采用下式计算：心脏指数(g/kg)＝以克计的心脏重量/以千克计的体重。肾脏指数的值指肾脏重量与总体重之比，可采用下式计算：肾脏指数(g/kg)＝以克计的肾脏重量/以千克计的体重。总脂肪指数的值指脂肪重量(如腹部和/或肩胛脂肪)与总体重之比。如本文所用，该脂肪指数可采用下式计算：总脂肪指数(g/kg)＝以克计的腹部脂肪和肩胛脂肪总重/以千克计的体重。
同样地，术语“提高”、“增加”、“升高”、“上调”和“促进”可互换使用，指与代谢相关的一种或多种化学或生物分子的水平或活性增加到高于不进行本文所述多肽处理时所观察到的水平或活性，或高于对照多肽产生的水平或活性，如葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸、胆汁酸、氨基酸、激素包括如胰岛素、LDL-C、HDL-C、HbA1c、血尿素氮以及矿物质。在一些实施方案中，“提高”可指衡量代谢变化的一种或多种生理参数的值的水平增加到高于不存在本文所述多肽时观察到的水平或活性，或高于对照多肽产生的水平或活性，如血糖、血压、体重、脂肪量、体重指数(BMI)、炎症、动脉粥样硬化指数、心脏指数、肾脏指数、总脂肪指数和稳态模型评估(HOMA)指数。在某些实施方案中，本文所述多肽产生的增加高于存在无活性或减毒分子时所观察到的水平或活性。在一些实施方案中，本文所述多肽能提高血清和/或其它组织或器官如肝脏、心脏、肌肉、内脏脂肪、皮下脂肪、肠和大脑中胆汁酸的水平。
术语“稳定”、“保留”、“保持”和“维持”可交换使用于一种或多种与代谢相关的化学或生物分子，指所述与代谢相关的一种或多种化学或生物分子如葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸、胆汁酸、氨基酸、激素包括如胰岛素、LDL-C、HDL-C、HbA1c、血尿素氮以及矿物质的水平或活性，与在健康对象或未患代谢疾病的对象中观察到的水平或活性相比或与阳性对照多肽存在下观察到的水平或活性相比显示最小的差异。在一些实施方案中，“稳定”可指衡量代谢变化的一种或多种生理参数如血糖、血压、体重、脂肪量、体重指数(BMI)、炎症、动脉粥样硬化指数、心脏指数、肾脏指数、总脂肪指数和稳态模型评估(HOMA)指数的水平或值，与在健康对象或未患代谢疾病的对象中观察到的水平或值相比或与阳性对照多肽存在下观察到的水平或值相比显示最小的差异。在一些实施方案中，本文所述多肽能使血清中的胰岛素水平和/或胰腺的胰岛素生产稳定。
本文所述多肽可采用化学合成或重组技术制备。
当选择重组方法时，可从头构建一合成基因，或可采用例如盒式诱变来突变天然基因。本文所述多肽可采用重组DNA技术制备。简要的说，这些技术包括获得编码该多肽的天然或合成的基因，将其插入合适的载体中，将载体转入合适的宿主细胞中，培养该宿主细胞以使该基因表达，以及回收或分离所产生的肽。在一些实施方案中，将所回收的肽纯化到合适的纯度。
例如，克隆并操作编码本文所述多肽的DNA序列，以使其可在合适的宿主中表达。可从HBV基因组文库中衍生自表达该多肽的细胞的mRNA的cDNA获得编码亲本多肽的DNA，或者采用合成方法构建该DNA序列而获得编码亲本多肽的DNA。然后将该亲本DNA插入用于转化宿主细胞的合适的质粒或载体中。通常，来源于与宿主细胞相容的物种质粒载体且含有复制和控制序列用于这些宿主中。载体通常携带复制位点以及编码能为转化的细胞提供表型选择的蛋白质或肽的序列。载体可以是本领域常用的那些载体，或使用标准技术并结合本领域常用的载体的功能性片段来构建。
宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。例如，原核宿主细胞可以包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和其它肠杆菌科如鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcesans)，以及各种假单胞菌。除了原核生物，也可使用真核生物，如酵母培养物，或来源于多细胞生物的细胞，如昆虫或哺乳动物细胞培养物。这类真核宿主细胞系的例子包括VERO和Hela细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，W138，293，BHK，COS-7和MDCK细胞系。
在一些实施方案中，可采用固相合成或本领域已知的同等化学合成方法制备本文所述多肽。在一些实施方案中，通过将预先保护的α-氨基酸偶联到合适的树脂上而开始多肽C末端的固相合成。可通过将α氨基受保护的氨基酸经由酯键连接到氯甲基化树脂或羟基甲基化树脂，或经由酰胺键连接到BHA树脂或MBHA树脂而制备所述起始材料。使用本领域熟知的用于形成肽键的技术将氨基酸连接到肽链上。一种方法涉及将氨基酸转化成一衍生物，该衍生物将提供更易于与肽片段的游离N末端氨基反应的羧基。例如，可通过受保护的氨基酸与氯甲酸乙酯，氯甲酸苯酯，氯甲酸叔丁基酯，氯甲酸异丁酯，新戊酰氯或类似的酰基氯之间的反应而将氨基酸转化成混合的酸酐。或者，可将氨基酸转化成活性酯，例如2，4，5-三氯苯酯，五氯苯酯，五氟苯酯，对硝基苯酯，N-羟基琥珀酰亚胺酯，或由1-羟基苯并三唑形成的酯。另外一种偶联方法涉及使用合适的偶联剂，如N，N′-二环己基碳二亚胺或N，N′-二异丙基碳二亚胺。
在一些实施方案中，肽合成中使用的各氨基酸的α氨基在偶联反应中被保护，以阻止涉及它们的活性α氨基功能的副反应。例如，可用合适的保护基保护含反应性侧链官能团(如巯基，氨基，羧基和羟基)的某些氨基酸，以防止在最初以及之后的偶联步骤中在该位点发生化学反应。本领域技术人员知道该如何选择合适的侧链保护基。在获得所需氨基酸的肽之后，在不会改变肽链结构的反应条件下即可容易地除去保护基。
除去α氨基保护基之后，以所需的顺序逐步将剩余的α氨基和侧链受保护的氨基酸偶联。除了在合成中分别加入各氨基酸外，作为替代，一些氨基酸可在被加到固相合成仪之前先相互偶联。本领域技术人员熟知该如何选择合适的偶联剂。
各受保护的氨基酸或氨基酸序列过量加到固相反应器中，偶联适宜于在介质二甲基甲酰胺(DMF)或CH2Cl2或其混合物中进行。如果偶联不完全，则在偶联下一个氨基酸前，在N-氨基保护基存在时先重复该偶联过程。监控合成各阶段的偶联反应是否成功。可使用周知的方法如BIOSEARCH 9500TM肽合成仪自动进行偶联反应。
获得所需的肽序列之后，必须从树脂支持物上切割下受保护的肽，且必须除去所有保护基。保护基的切割和去除可以同时或依次进行。当树脂支持物是氯甲基化的聚苯乙烯树脂时，将肽锚定到该树脂的键是C末端残基的游离羧基基团与该树脂基质上众多氯甲基基团中的一个形成的酯键。应理解的是，可采用已知能断裂酯键并能渗入树脂基质的试剂切割该锚定用的键。也应认识到的是，可在从支持物上切割多肽之前或之后修饰该多肽，如用疏水基团(包括如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、胆固醇和花生四烯酸)来修饰N末端，或用酰胺化(胺化)、异戊二醇化或其它能稳定C末端的修饰来修饰C末端。
可采用常规的方法如制备HPLC(包括反相HPLC)或其它已知的层析技术(如凝胶渗透，离子交换，分配色谱法，亲和层析(包括单克隆抗体柱)或反流分布法)纯化本发明的多肽。
II、药物组合物
本公开还提供组合物，包括药物组合物，该组合物含有本文所述的多肽。在某些实施方案中，该组合物可含有本文所述的任意一条或多条多肽。在一些实施方案中，该组合物还可含有合适的药学上可接受的载体。在一些实施方案中，当给予需要的对象时，该药物组合物使本文所述多肽的血清浓度使得该多肽能双向调节该对象中NTCP介导的胆汁酸摄取。
“药学上可接受的载体”指无活性成分，如固体，半固体，或液体填充剂，稀释剂，包衣材料，制剂佐料，赋形剂或载体，与治疗剂合用，一起构成用于给予对象的“药物组合物”。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度对于受试者而言是无毒的，且与制剂中的其他成分相容。药学上可接受的载体对于所采用的制剂而言是适当的。例如，如果治疗剂将口服给药，则载体可以是凝胶胶囊。如果治疗剂将皮下给药，则理想的是，载体对皮肤无刺激，且不引起注射位点反应。
可将具有所需纯度的本文所述多肽与一种或多种任选的药学上可接受的载体混合而制备所述多肽的药物组合物。药学上可接受的载体可包括如缓冲剂(如磷酸盐，柠檬酸盐和其它有机酸)；抗氧化剂(如抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基苄基二甲基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和m-甲酚)；低分子量(如低于约10个残基)的多肽；蛋白质(如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白)；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸)；单糖；二糖；和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；金属复合物，如Zn-蛋白复合物；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
示例性的药物载体还可包括粘合剂，如预糊化的玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等；填充剂，如乳糖或其它糖类，微晶纤维素，果胶，明胶，硫酸钙，乙基纤维素，聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等；润滑剂，如硬脂酸镁，滑石粉，二氧化硅，胶态二氧化硅，硬脂酸，金属硬脂酸盐，氢化植物油，玉米淀粉，聚乙二醇，苯甲酸钠，乙酸钠等；崩解剂，如淀粉，羟基乙酸淀粉钠等；和润湿剂，如十二烷基硫酸钠等。
示例性的药学上可接受的载体还可包括间质性药物分散剂，如可溶性的中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(Baxter International，Inc.)。在一些实施方案中，sHASEGP可以混合到含有一种或多种其它粘多糖酶(glycosammoglycanases)如软骨素酶的药物组合物中。
药物组合物还可含有一种以上适于所治疗的特定适应症的活性成分，这类活性剂可以是例如无不利影响的互补活性的活性剂。这类活性剂可适宜地以有效满足预期目的的量组合存在。
在一些实施方案中，活性剂可被包裹在采用如凝聚技术或界面聚合所制备的微胶囊(如羟甲基纤维素或凝胶微胶囊或聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊)中，或包裹在胶态药物递送系统(如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或包裹在粗乳液中。
在一些实施方案中，该药物组合物可包括缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括如含本文所述多肽的固体疏水聚合物的半透性基质，其中，该基质可以是成形制品的形式，如膜或微胶囊。
在一些实施方案中，所述药物组合物可用于体内给药，且可以是无菌的。可采用例如通过无菌滤膜过滤的方式容易地实现无菌。
所述药物组合物可被制备成多种可能的剂型中的任意一种，如片剂，胶囊，凝胶胶囊，粉末或颗粒。所述药物组合物还可被制备成溶液、悬液、乳液或混合介质。在一些实施方案中，所述药物组合物可被制备成冻干制剂或水性溶液。
在一些实施方案中，所述药物组合物可被制备成溶液。例如，可将本文所述的多肽加入到非缓冲的溶液(如盐水或水)中施用。在一些实施方案中，也可将多肽加入合适的缓冲溶液中施用。例如，缓冲溶液可含有乙酸盐，柠檬酸盐，醇溶谷蛋白，碳酸盐或磷酸盐，或其任意组合。在一些实施方案中，缓冲溶液可以是磷酸盐缓冲液(PBS)。可将含所述多肽的缓冲溶液的pH和渗透压调到适于给予对象的水平。
在一些实施方案中，所述药物组合物可被制备成水性悬液、非水性悬液或混合基质悬液。水性悬液还可含有增加悬液粘度的物质，包括如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬液还可含有稳定剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物可被制备成乳液。示例性的乳液包括一种液体以通常超过0.1μm直径的液滴分散在另一种液体中形成的非均质系统。除分散相和可存在于水相溶液、油相溶液或自身作为独立相存在的活性药物外，乳液可含有其它成分。还可包括微乳液，作为本公开的一个实施方案。在一些实施方案中，所述药物组合物还可被制备成脂质体制剂。
III、使用方法
本公开的实施方案包括本文所述多肽的治疗用途。一方面，提供了本文所述多肽作为药物的用途。另一方面，提供了本文所述多肽治疗代谢疾病的用途。在一些实施方案中，本文所述多肽用于治疗代谢疾病涉及脂质代谢失调。在某些实施方案中，代谢疾病可以是胆固醇相关的疾病。在一些实施方案中，胆固醇相关的疾病可以是高脂血症。在一些实施方案中，高脂血症可以是高甘油三酯血症，高胆固醇血症或其组合。在一些实施方案中，提供了本文所述多肽在治疗与总甘油三酯，总胆固醇和LDL-C血清水平升高相关的任一种病症中的用途。
在一些实施方案中，代谢疾病涉及葡萄糖代谢失调。在一些实施方案中，该代谢疾病是糖尿病。在一些实施方案中，该代谢疾病是II型糖尿病。在一些实施方案中，该代谢疾病是肥胖。在一些实施方案中，提供了本文所述多肽在治疗与葡萄糖或HbA1c血清水平升高相关的病症中的用途。
另一方面，提供了一种治疗对象的代谢疾病的方法，包括给予该对象治疗有效量的本文所述多肽或该多肽的药物组合物。在某些实施方案中，该对象可患有代谢疾病或有患代谢疾病的风险。在一些实施方案中，该对象可以是哺乳动物。在一些实施方案中，该对象可以是人。在某些实施方案中，本文所述方法和用途还可包括给予该对象治疗有效量的至少一种其他治疗剂。
在一些实施方案中，所述代谢疾病涉及脂质代谢失调。在一些实施方案中，所述代谢疾病可以是胆固醇相关的疾病。在一些实施方案中，胆固醇相关的疾病可以是高脂血症。在一些实施方案中，高脂血症可以是高甘油三酯血症，高胆固醇血症或其组合。
另一方面，提供了降低有代谢疾病对象中血清脂质水平如总胆固醇，总甘油三酯或LDL胆固醇水平的方法，包括给予该对象治疗有效量的本文所述多肽或该多肽的药物组合物。在一些实施方案中，该对象患有涉及脂质代谢失调的代谢疾病，或有患所述代谢疾病的风险。在一些实施方案中，所述对象患有胆固醇相关疾病，或有患胆固醇相关疾病的风险。在一些实施方案中，所述对象患有高脂血症，或有患高脂血症的风险。在一些实施方案中，所述对象患有高甘油三酯血症，高胆固醇血症或其组合，或存在患有高甘三酯血症，高胆固醇血症或其组合的风险。
在一些实施方案中，所述代谢疾病涉及葡萄糖代谢失调。在一些实施方案中，该代谢疾病是糖尿病。在一些实施方案中，该代谢疾病是II型糖尿病。在一些实施方案中，该代谢疾病是肥胖。
在某些方面，提供了降低高血糖受试者中血糖或HbA1c水平的方法，包括给予该受试者治疗有效量的本文所述多肽或该多肽的药物组合物。在一些实施方案中，提供了使目标受试者的血清胰岛素水平稳定的方法，包括给予该对象治疗有效量的本文所述多肽或该多肽的药物组合物。在一些实施方案中，该对象患有涉及葡萄糖代谢失调的代谢疾病，或有患上该代谢疾病的风险。在一些实施方案中，该对象患有糖尿病，或有患上糖尿病的风险。在一些实施方案中该对象患有II型糖尿病，或有患上II型糖尿病的风险。在一些实施方案中，该对象患有肥胖症，或有患上肥胖症的风险。
不受任何理论限制，据信本文所述多肽在给予对象后能通过双向调节NTCP介导的胆汁酸摄取而达到能治疗代谢疾病或调节代谢相关分子的血清水平的能力。在一些实施方案中，当给予本文所述多肽的对象血液中所述多肽的浓度在某个浓度或低于某个浓度时，该对象的胆汁酸摄取提高。在一些实施方案中，当该对象血液中本文所述多肽的浓度高于某个浓度时，该对象的胆汁酸摄取被抑制。在一些实施方案中，当给予本文所述多肽的对象血液中所述多肽的浓度为93nmol/L或低于93nmol/L时，该对象的胆汁酸摄取提高。在一些实施方案中，当该对象血液中本文所述多肽的浓度高于93nmol/L时，该对象的胆汁酸摄取被抑制。例如，当给予本文所述Cmyr-47多肽的对象血液中所述多肽的浓度为500ng/ml或低于500ng/ml时，该对象的胆汁酸摄取提高。当该对象血液中本文所述Cmyr-47多肽的浓度高于500ng/ml时，该对象的胆汁酸摄取被抑制。在某些实施方案中，可在给予本文所述多肽后至少约10，20，40，60，90，120，180，240或360分钟后测量所述多肽的血清浓度。在一些实施方案中，给予本文所述多肽后一段时间，该多肽的血清浓度高于93nmol/L。给予本文所述多肽后同样时间，该多肽的血清浓度为93nmol/L或以下。例如，给予本文所述Cmyr-47多肽后一段时间，该多肽的血清浓度高于500ng/ml。在一些实施方案中，给予本文所述Cmyr-47多肽后同样时间，该多肽的血清浓度为500ng/ml或以下。在一些实施方案中，该多肽的上述血清浓度阈值在给药后约20分钟出现。
如本文所用，“代谢疾病”或“代谢紊乱”包括代谢途径(如涉及胆汁酸代谢，葡萄糖代谢，脂质代谢和氨基酸代谢的途径)失调导致的任何疾病。在一些实施方案中，代谢疾病指涉及脂质代谢失调的疾病。在某些实施方案中，代谢疾病指包括脂质代谢物(包括如胆汁酸，胆固醇，甘三酯和脂肪酸)的生产，清除和/或利用失调的疾病。因此，本文所述的代谢疾病可指胆固醇相关的疾病。因此，本文所述的代谢疾病可指高脂血症，如高甘油三酯血症，高胆固醇血症，或其组合。在一些实施方案中，代谢疾病指涉及葡萄糖代谢失调的疾病。在某些实施方案中，代谢疾病指包括脂葡萄糖代谢物(包括如葡萄糖，丙酮酸盐，和葡萄糖-6-磷酸盐)的生产，清除和/或利用失调的疾病。因此，本文所述的代谢疾病可指糖尿病和肥胖症。
本文所述的代谢疾病可选自：高血糖症，低血糖症，高胰岛素血症，肥胖症，高脂血症，高甘油三酯血症，高胆固醇血症，心脏疾病，代谢综合症，动脉粥样硬化的疾病，冠心病，冠状动脉疾病，外周动脉疾病，心绞痛，脑血管疾病，急性冠状综合征，心肌梗塞，中风，心血管疾病，阿尔茨海默病，血脂异常，家族性复合高脂血症，家族性高甘油三酯血症，家族性高胆固醇血症，异型高胆固醇血症(heterozygous hypercholesterolemia)，同型高胆固醇血症(homozygous hypercholesterolemia)，家族性载脂蛋白B-100缺陷，多基因性高胆固醇血症，残粒清除障碍病(remnant removal disease)，肝脂酶缺乏症，由暴饮暴食、甲状腺机能减退、雌激素和孕激素药物、β阻断剂和噻唑类利尿剂在内的药物引起的血脂异常，肾病综合征，慢性肾衰竭，库欣(Cushing’s syndrome)综合征，原发性胆汁性肝硬化，糖原贮积症，肝细胞瘤，胆汁郁积，肢端肥大症，胰岛瘤，单一性生长素缺乏症，肾脏损伤，肥胖，和酒精引起的高油甘三酯血症。
术语“代谢疾病”包括I型糖尿病，II型糖尿病，高血糖，低血糖，高胰岛素血症，肥胖症，高脂血症，高甘油三酯血症，高胆固醇血症，心脏疾病，代谢综合征，冠心病，中风，心血管疾病，阿尔茨海默病，以及常见的表现为例如升高的血清总胆固醇、LDL、甘油三酯、VLDL和/或HDL水平的血脂异常。可单独采用本文所述多肽或使其与一种或多种其它制剂一起治疗的原发和继发性血脂异常的一些非限制性例子包括代谢综合征，糖尿病，高脂血症，家族性复合高脂血症，家族性高甘油三酯血症，家族性高胆固醇血症(包括异型高胆固醇血症，同型高胆固醇血症)，家族性载脂蛋白B-100缺陷，多基因性高胆固醇血症，残粒清除障碍病，肝脂酶缺乏症，继发于暴饮暴食、甲状腺机能减退、雌激素和孕激素用药、β阻断剂和噻唑类利尿剂在内的药物引起的的血脂异常，肾病综合征，慢性肾衰竭，库欣综合征(Cushing’s syndrome)，原发性胆汁性肝硬化，糖原过多症，肝细胞瘤，胆汁郁积，肢端肥大症，胰岛瘤，单一性生长素缺乏症，和酒精引起的高甘三酯血症。
在某些实施方案中，本文所述多肽可用于预防或治疗一种或多种代谢疾病。在某些实施方案中，本文所述多肽还可用于预防或治疗与代谢疾病相关的一种或多种症状或并发症。例如，该多肽可用于预防或治疗心血管疾病，包括动脉粥样硬化的疾病，如冠心病，冠状动脉疾病，外周动脉疾病，中风(缺血性和失血性)，心绞痛，或脑血管疾病和急性冠状综合征，心肌梗塞。在某些实施方案中，本文所述多肽也可用于预防或治疗心脏病，肾脏损伤，或与代谢紊乱有关的肥胖症。
术语“糖尿病”指通常表征为葡萄糖的生产和/或利用存在代谢缺陷，导致体内无法维持适当的血糖水平的疾病或状态。这些缺陷的结果包括升高的血糖，指“高血糖”。糖尿病的两种主要形式是I型糖尿病和II型糖尿病。I型糖尿病通常由胰岛素的绝对缺乏(如胰腺β细胞的胰岛素生产极低或完全不生产)而导致，因此无法调节葡萄糖利用。II型糖尿病通常表现为正常或甚至是升高的胰岛素水平，可由组织无法正常地响应胰岛素调节导致。大多数II型糖尿病患者具有胰岛素抵抗，由于胰岛素分泌不能代偿外周组织对胰岛素的抵抗反应，具有胰岛素的相对不足。
术语“高脂血症”指表征为血清脂质异常升高的病症。循环血液中的脂质部分包括如总胆固醇，某些脂蛋白和甘油三酯。血清脂蛋白在循环中用作脂质的载体，根据其密度分包括：乳糜微粒，极低密度脂蛋白(LDL)，中密度脂蛋白(IDL)，低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)。术语“高脂血症”包括原发性和继发性高脂血症。原发性高脂血症通常由基因缺陷导致，而继发性高脂血症通常由其它因素导致，如各种疾病状态，药物和饮食因素。例如，继发性高脂血症可由糖尿病引起。或者，高脂血症可由原发性因素和继发性因素共同导致。高脂血症可包括高甘油三酯血症、高胆固醇血症或其组合。本文所用术语“高甘油三酯血症”指血清总甘油三酯水平高于期望水平的病症。本文所用术语“高胆固醇血症”指血清胆固醇水平高于期望水平的病症。在某些实施方案中，高胆固醇血症中血清总胆固醇，HDL胆固醇(HDL-C)或LDL胆固醇(LDL-C)高于期望的水平。高脂血症还会导致患心血管疾病和动脉粥样硬化疾病的风险，并可促使心血管疾病和动脉粥样硬化疾病的发生。术语“心血管疾病”包括血管中异常高浓度的脂质导致的循环系统的血管疾病。术语“动脉粥样硬化”指动脉的一种疾病，其中在内壁上形成脂肪斑，最终阻挡血流。
“患者”和“对象”可互换使用，指待治疗或评估是否患有疾病、失调或病症的动物(如哺乳动物或人)，或评估是否有患上疾病、失调或病症的风险，或患上了疾病、失调或病症的动物(如哺乳动物)或人。在一些实施方案中，这些疾病、失调或病症可包括代谢疾病。在一些实施方案中，该代谢疾病可涉及脂质代谢失调。在一些实施方案中，该代谢疾病可以是胆固醇相关的病症，如高脂血症，如高胆固醇血症、高甘油三酯血症或其组合。在一些实施方案中，该代谢疾病可涉及葡萄糖代谢失调。在一些实施方案中，该代谢疾病可以是糖尿病，包括I型和II型糖尿病。
本文所述多肽或含该多肽的组合物的“治疗有效量”或“有效量”指在疾病的预防或治疗中能有效进行治疗的所述多肽或组合物的量。该术语可包括本文所述多肽在患有代谢疾病或有患上代谢疾病风险的对象中有效提高胆汁酸血清水平的量。该术语可包括本文所述多肽在患有代谢疾病如糖尿病或肥胖或有患上所述代谢疾病风险的对象中有效降低血糖或HbAlc水平或使胰岛素的血清水平稳定的量。该术语还可包括本文所述多肽在患有代谢疾病如高脂血症(包括高胆固醇血症、高甘三酯血症或两者)或有患上所述代谢疾病风险的对象中有效降低血清脂质水平如总胆固醇、总甘油三酯、LDL胆固醇水平的量。该术语还包括本文所述多肽在给予对象用于治疗代谢疾病如糖尿病和高脂血症(包括高胆固醇血症、高油甘三酯血症或两者)时足以实现疾病治疗，如减少、改善、或维持现有疾病或该疾病的一种或多种症状、或抑制疾病加剧的量。“治疗有效量”或“有效量”可根据多肽、给药方式、疾病及其严重程度、健康、年龄、体重、家族史、基因组成、病理发展阶段、用药前的和同时进行的治疗的类型等，以及待治疗对象的其它个体特征而变化。
本文所述多肽的“治疗有效量”可使得所给予的多肽在对象的血液中达到一浓度，在该浓度该多肽能抑制该对象中NTCP介导的胆汁酸摄取。在一些实施方案中，治疗有效量的本文所述多肽可允许所给予的多肽在以该量给予的对象的血中达到至少约93nmol/L的浓度。例如，治疗有效量的本文所述Cmyr-47多肽可允许所给予的多肽在以该量给予的对象的血中达到至少约500ng/ml的浓度。
在某些实施方案中，本文所述多肽的治疗有效量指使给予的多肽的血清浓度能对对象中NTCP介导的胆汁酸摄取进行双向调节的量。例如，当给予对象治疗有效量的本文所述多肽时，该对象中该多肽的起始血清浓度可高于某个浓度，在该浓度该多肽抑制NTCP介导的胆汁酸摄取。该对象中该多肽的血清浓度可逐渐降低，并达到或低于一个值，这时该多肽开始提高NTCP介导的胆汁酸摄取。给予的多肽的血清浓度可在给药至少约10，20，40，60，90，120，180，240或360分钟后测量。在一些实施方案中，给予本文所述多肽一段时间后，治疗有效量的该多肽允许其达到高于93nmol/L的血清浓度。给予本文所述多肽一段时间后，治疗有效量的该多肽允许该多肽达到93nmol/L或以下的血清浓度。例如，给予本文所述Cmyr-47多肽一段时间后，治疗有效量的该多肽能够达到高于500ng/ml的血清浓度。在一些实施方案中，给予本文所述Cmyr-47多肽一段时间后，治疗有效量的该多肽能够达到500ng/ml或以下的血清浓度。在一些实施方案中，治疗有效量的本文所述多肽的上述血清浓度阈值在给药后约20分钟出现。
在各实施方案中，术语“治疗”包括对对象(如哺乳动物，如人)或细胞进行处理，以改变该对象或细胞的当前进程。治疗包括例如给予本文所述多肽或含该多肽的药物组合物，治疗可以预防性的方式进行，或可在发生了病理性事件或与发病物质接触后开始进行。治疗也包括“预防性”治疗，该治疗指向降低待治疗疾病或病症的进展速度，延缓该疾病或病症的发作，或降低其发作的严重性。“治疗”或“预防”并不必须指完全根除、治愈，或防止疾病或病症或相关症状的发生。在各实施方案中，术语“治疗”可包括减轻、缓和或反转患代谢疾病如糖尿病和高脂血症(如高胆固醇血症、高甘三酯血症或两者)的病理学进程。在一些实施方案中，术语“治疗”可包括改善代谢疾病的至少一种症状或至少一种可测量参数。对于本领域技术人员而言显而易见的是，可使用生物学和/或生理参数评估代谢疾病的病理进程。这些病理进程或症状可包括如与健康对象相比过量或增加的一种或多种与代谢相关的化学或生物分子，如葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸、胆汁酸、氨基酸、激素(包括胰岛素)、LDL-C、HDL-C、HbA1c、血尿素氮和矿物质，或过量或增加的一种或多种衡量代谢变化的生理参数，如血糖、血压、体重、脂肪量、体重指数(BMI)、炎症、动脉粥样硬化指数(AI)、心脏指数、肾脏指数、总脂肪指数和稳态模型评估(HOMA)指数。
术语“给予”或“给药”包括将本文所述多肽以局部或全身给药的方式给药。给药可以是局部的(包括眼部或阴道和直肠的粘膜给药)，肺部(如通过粉末或气雾剂的吸入或吹入，包括采用喷雾器，气管内，鼻内给药)，表皮，经皮，口服或肠胃外。肠胃外给药包括静脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注，或颅内，如鞘内或心室内给药。
在某些实施方案中，本公开提供本文所述多肽在调节(如降低或稳定)对象中与代谢相关的一种或多种化学或生物分子(如葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸、胆汁酸、氨基酸、激素、LDL-C、HDL-C、HbA1c、血尿素氮和矿物质)的水平或活性中的用途。在一些实施方案中，本公开提供本文所述多肽在调节(如降低或稳定)衡量代谢变化的一种或多种生理参数(如血糖、血压、体重、脂肪量、体重指数(BMI)、炎症、动脉粥样硬化指数(AI)、心脏指数、肾脏指数、总脂肪指数和稳态模型评估(HOMA)指数)的水平或值中的用途。
在一些实施方案中，本公开提供本文所述多肽在降低对象血清脂质水平中的用途。在一些实施方案中，本公开提供本文所述多肽在降低对象血清总胆固醇水平中的用途。在进一步的实施方案中，本公开提供本文所述多肽在降低对象LDL-胆固醇血清水平中的用途。在一些实施方案中，本公开提供本文所述多肽在降低对象甘油三酯血清水平中的用途。在一些实施方案中，本公开提供本文所述多肽在降低对象葡萄糖血清水平中的用途。在一些实施方案中，本公开提供本文所述多肽在稳定对象胰岛素血清水平中的用途。在一些实施方案中，对象可以是哺乳动物。在一些实施方案中，对象可以是人。
在一些实施方案中，本公开提供本文所述多肽在降低患上代谢疾病的风险中的用途。在某些实施方案中，本公开还提供本文所述多肽在降低患上与代谢疾病相关的一种或多种症状或并发症风险中的用途。在一些实施方案中，所述代谢疾病涉及脂质代谢失调。在一些实施方案中，所述代谢疾病是胆固醇相关的疾病。在一些实施方案中，所述代谢疾病是高脂血症。高脂血症可包括高甘油三酯血症，高胆固醇血症，或两者。在一些实施方案中，所述代谢疾病涉及葡萄糖代谢失调。在一些实施方案中，所述代谢疾病是糖尿病。在一些实施方案中，所述糖尿病是I型和II型糖尿病。在一些实施方案中，所述代谢疾病是肥胖症。与代谢疾病相关的症状或并发症可包括患这类代谢疾病(如糖尿病；高脂血症，包括高甘三酯血症，高胆固醇血症，或两者)的患者中发展出例如心血管疾病，如动脉粥样硬化；心脏疾病；肾脏损伤；或肥胖症。
本公开还提供实施本文所述多肽在对象中的上述用途的方法。这些方法可包括给予所述对象治疗有效量的本文所述多肽或含所述多肽的药物组合物。在一些实施方案中，所述对象可以是哺乳动物。在一些实施方案中，所述对象可以是人。在一些实施方案中，所述对象可患有代谢疾病或有患上所述疾病的风险。
在进一步的方面，本公开提供本文所述多肽在制备或制造药物中的用途。在一些实施方案中，所述药物可用于治疗代谢疾病。所述代谢疾病可涉及脂质代谢失调。在一些实施方案中，所述药物可也用于治疗胆固醇相关疾病。在一些实施方案中，所述胆固醇相关疾病可以是高脂血症。该高脂血症可以是高甘油三酯血症，高胆固醇血症，或其组合。在又一实施方案中，所述药物用于降低对象的血清脂质水平如总胆固醇，总甘油三酯或LDL胆固醇水平的方法，包括给予该对象治疗有效量的所述药物。
在一些实施方案中，所述代谢疾病可涉及葡萄糖代谢失调。在一些实施方案中，所述药物可用于治疗糖尿病，如I型或II型糖尿病。在一些实施方案中，所述药物可用于治疗肥胖。在另一实施方案中，所述药物用于降低对象的血糖或HbA1c水平的方法，包括给予该对象治疗有效量的所述药物。
在某些实施方案中，所治疗的疾病可以是可由双向调控NTCP活性而得以改善，好转，抑制或预防该疾病或病症。在某些实施方案中，也可采用本文所述的多肽治疗可受益于肝细胞对胆汁酸摄取的调节的病症或疾病。在某些实施方案中，可采用本文所述的多肽和方法和用途治疗的对象可包括显示LDL分离的对象，患糖尿病的对象，患原发性高脂血症(包括高胆固醇血症、高甘油三酯血症或其组合)且对其它治疗剂不耐受或无法用其它治疗剂控制的对象，以及有患上高脂血症的风险但可预防性治疗的对象。其它适应症包括与继发因素如II型糖尿病、胆汁淤积性肝病(原发性胆汁性肝硬化)、肾病综合征、甲状腺机能减退、肥胖症，以及心血管疾病(如动脉粥样硬化疾病)、心脏病和肾脏损伤的引起的血脂异常。
在某些实施方案中，本文所述的方法和用途可进一步包括给予对象有效量的至少一种其它治疗剂。在某些实施方案中，所述其它治疗剂可用于预防和/或治疗与本文所述的代谢疾病相关的一种或多种疾病，例如与糖尿病或高脂血症相关的一种或多种疾病。在某些实施方案中，所述其它治疗剂可用于预防和/或治疗心血管疾病，如动脉粥样硬化疾病。在某些实施方案中，所述其它治疗剂可用于降低复发心血管事件的风险。在某些实施方案中，所述其它治疗剂可用于预防和/或治疗心脏病，肾脏损伤或肥胖症。治本文所述多肽可单独使用，或可与其它制剂一起使用。例如，可在给予所述其它治疗剂之前、同时或之后给予本文所述多肽中的任一条。在某些实施方案中，所述其它治疗剂可选自例如降血脂药，降糖药，抗糖尿病药，抗肥胖药，和胆汁酸类似物。
在一些实施方案中，降糖药可选自如双胍类(如二甲双胍、苯乙双胍和丁双胍)，胰岛素(如常规人胰岛素，NPH胰岛素，门冬胰岛素、赖脯胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素(insulin detemir)和地特胰岛素(insulin levemir))，胰高血糖素样肽1受体激动剂〔GLP-1RA，如阿必鲁肽(albiglutide)、杜拉鲁肽(dulaglutide)、艾塞那肽(exenatide)、利拉鲁肽(1iraglutide)、利西拉来(1ixisenatide)和延长释放的胰高血糖素〕，钠-葡萄糖共转运子2抑制剂〔SGLR2I，如卡格列净(canagliflozin)、艾帕列净(empagliflozin)、达格列净(dapagliflozin)、恩格列净(empagliflozin)和伊格列净(ipragliflozin)〕，二肽基肽酶4抑制剂〔DPP4I，如溴隐亭(bromocriptine)、西格列汀(sitagliptin)、维格列汀(vildagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、利格列汀(linagliptin)、阿那列汀(anagliptin)、特力利汀(teneligliptin)、阿格列汀(alogliptin)、曲格列汀(trelagliptin)、吉格列汀(gemigliptin)、度格列汀(dutogliptin)、奥格列汀(omarigliptin)、黄连素(berberine)、和羽扇豆醇〕，α-葡糖苷酶抑制剂〔AGI，如米格列醇(miglitol)、阿卡波糖和伏格列波糖〕，噻唑烷二酮〔TZD，如匹格列酮、罗西格列酮、洛贝格列酮(1obeglitazone)、曲格列酮、环格列酮、达格列酮、恩格列酮(englitazone)、内格列酮(netoglitazone)、利格列酮(rivoglitazone)、和米非司酮〕，氯茴苯酸(如格列奈、那格列奈和米格列奈)，磺脲〔SU；如氨磺丁脲、乙酰苯磺酰环己脲、氯磺丙脲、甲苯磺丁脲、甲磺氮草脲、格列甲嗪(利糖妥片)、格列齐特、格列本脲、优降糖(如Micronase)、格列波脲、格列喹酮、格列派特、格列吡脲、格列美脲、亚莫利阿玛尔、和glimiprime〕，淀粉不溶素类似物(如普兰林肽)，前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin-9型抑制剂〔PCSK9I；如evolocumab、bococizumab、alirocumab、1D05-IgG2、RG-7652、LY3015014、RNAi治疗性ALN-PCS02、AMG-145、和REGN727/SAR236553〕，葡糖激酶活化剂〔GKA，如MK-0941、RO-28-1675、和AZD1656〕，PPAR激动剂/调节剂，胰高血糖素受体拮抗剂，C-C趋化因子受体2型(CCR2)拮抗剂，白介素-1调节剂，G-蛋白偶联受体激动剂，GLP-1以外的胃肠肽激动剂，SGLT1和SGLT1/SGLT2双抑制剂(不包括仅针对SGLT2的抑制剂)，11β-HSDl抑制剂，二酰甘油酰基转移酶(DGAT)-1抑制剂，大麻素，肝脏肉碱棕榈酰转移酶1(CPT1)抑制剂，成纤维细胞生长因子(FGF)-21激动剂，糖皮质激素受体拮抗剂，热激蛋白(HSP)诱导剂，黑皮质素-4受体(MC4R)激动剂，含四氢三嗪环的口服抗糖尿病药，glimin类，蛋白酪氨酸磷脂酶lB(PTPlB)抑制剂，去乙酰化酶1(SIRTl)活化剂，和微生物群系调节剂。
在某些实施方案中，其它治疗剂是降血脂药，可选自如他汀类〔如HMG-CoA还原酶抑制剂，如辛伐他汀(simvastatin)、阿伐他汀(atorvastatin)、罗苏伐他汀(Rosuvastatin)、普伐他汀(pravastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、阿伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、美伐他汀(mevastatin)、泛硫乙胺(pantethine)、弹性蛋白酶(elastase)、和普罗布考〕，苯氧酸〔如，苯扎贝特(如Bezalip)、环丙贝特(如Modalim)、降固醇酸、吉非贝齐(如Lopid)、非诺贝特(如TriCor)、克利贝特(如Lipoclin)、利贝特、氯贝丁酯铝、双贝特、益多酯和吉非贝齐)，烟酸(如尼克酸、烟酸肌醇酯、烟酰胺和阿西莫司)，胆汁酸螯合剂(如消胆胺(如)，考来维仑(如)、考来替泊(如)、降胆葡胺、消胆胺(dholestyramine)、和地维烯胺)，依泽替米贝(如Zetia)，前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin-9型抑制剂〔PCSK9I，如evolocumab、bococizumab、alirocumab、1D05-IgG2、RG-7652、LY3015014、RNAi治疗性ALN-PCS02、AMG-145、和REGN727/SAR236553〕，微粒体甘三酯转运蛋白抑制剂(MTTPI，如洛美他派和JTT-130)，载脂蛋白B抑制剂(apoBI，如米泊美生(如Kynamro))，二酰甘油酰基转移酶1(DGAT1)抑制剂(如pradigastat)，血管生成素样蛋白3抑制剂(如REGN1500)，胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂〔如安塞曲匹(anacetrapib)和易塞曲匹(evacetrapib)〕，过氧化物酶体增生物激活受体(PPAR)α/γ激动剂，酰基-CoA抑制剂，肠促胰岛素类似物抑制剂，血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)抑制剂，血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)抑制剂，靶向apoC-III的抑制剂，以及选择性过氧化物酶体增生物激活受体调节剂(SPPARM)。
在一些实施方案中，其它治疗剂是抗肥胖药，可选自如奥利司他(如Xenical)，氯卡色林(lorcaserin)(如Belviq)，苯丁胺，托吡酯，二乙胺苯丙酮，苯二甲吗啉，苄非他明，以及苯二甲吗啉和苄非他明的混合物。
在一些实施方案中，所述其它治疗剂是胆汁酸类似物，可选自如奥贝胆酸，熊脱氧胆酸和胆酰肌氨酸(cholylsarcosine)。
在一些实施方案中，所述其它治疗剂还可选自如法尼酯衍生物X受体(FXR)激动剂，FXR抑制剂，跨膜G蛋白偶联受体5(TGR5)激动剂和TGR5抑制剂。
在一些实施方案中，所述其它治疗剂可选自胰岛素，二甲双胍、西他列汀、考来维仑、格列甲嗪、辛伐他汀、阿伐他汀、依泽替米贝、非诺贝特、烟酸、奥利斯特、氯卡色林、苯丁胺、托吡酯、奥贝胆酸和熊脱氧胆酸。
本文所述的这些组合治疗可包括联合给药(其中，两者或多种治疗剂可以是同一制剂或分开的制剂)，以及分别给药，这种情况下，本文所述多肽可在其它治疗剂之前、同时或之后给予。
可以合适的方式给予本文所述多肽(和任意其它治疗剂)，包括肠胃外，肺内和鼻内；也可局部治疗或可病灶内给药。在一些实施方案中，本文所述多肽可肠胃外给药。肠胃外给药可包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一些实施方案中，本文所述多肽可皮下给药。在一些实施方案中，本文所述多肽可静脉内给药。可以任何合适的手段给药，如通过注射或输注，如静脉内或皮下注射或输注，这部分取决于给药是短暂的还是长期的。还考虑各种剂量方案，包括如在各时间点上的单次或多次给药，大剂量给药，以及脉冲注射。
本文所述多肽将以常规医学实践一致的方式进行配制、计量和给药。此处需要考虑的因素可包括如待治疗的具体病症，待给药的具体哺乳动物，患者个体的临床情况，病因，给药位点，给药方法，给药方案，以及药师熟知的其它因素。本文所述多肽不需要、但可任选地与其它一种或多种当前用于预防或治疗待处理病症的药剂一起配制。这些其它药剂的有效量取决于制剂中存在的本文所述多肽的量，病症或治疗的类型，以及上文所述的其它因素。
对于疾病的预防或治疗，本文所述多肽(单独使用时，或与一种或多种其它治疗剂联用时)的合适剂量可取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程，该多肽是用于预防性还是治疗性目的，先前的治疗情况，患者的临床病史以及对多肽的应答，以及主治医师的判断。可将本文所述多肽合适的一次性或一系列给药于患者。根据疾病的类型和严重程度，本文所述多肽可例如通过一次给药或分多次给药，或通过连续输注而给予患者。对于几天或更长时间内的重复给药，根据病症情况，治疗可持续至期望的疾病症状出现抑制为止。本文所述多肽可间歇给予，例如每天、每两天、每三天、每周、或每两或三周(如，这样患者将接受一剂以上，如约2剂到约20剂，如约6剂所述多肽)。起始剂量可较高，接着可给予一剂或多剂较低剂量的药剂。
在某些实施方案中，可采用固定剂量方案，将本文所述多肽给予对象。但是，根据上述讨论的因素，也可采用其它剂量方案。可采用常规的用于所治疗疾病或病症的技术和检测容易地监控疾病或治疗的进展。
下述实施例可用于阐述性目的，不应理解为限缩本发明的范围。
实施例1
实施例1.1：多肽的合成
根据用于多肽合成的标准Fmoc方案合成表1所示多肽。通常，起始于MBHA树脂，单个氨基酸残基从羧基端向氨基端延伸。然后对N末端实施肉豆蔻酰化。肽合成完成后，采用切割液将多肽从树脂上切下，并进一步对多肽的C末端进行胺化修饰。用G6砂芯漏斗滤除树脂，真空抽干含多肽的滤液。将多肽产物溶解在去离子水中，用装备了C18柱的explorer 100型高压液相色谱仪进行纯化，分步收集主峰。从目标峰收集的样品采用装配了C18柱的Agilent 1100型反相高压液相色谱(HPLC)分析纯度，采用质谱仪鉴定它们的分子量。中压液相色谱纯化所收集的溶液进行冻干保存。将干燥样品溶解在PBS中，用0.20μM膜过滤。溶解于PBS的多肽储备液保存在-80℃备用。图1A显示描述采用HPLC测得的合成多肽Cmyr-47纯度的示图。图1B显示经质谱鉴定的Cmyr-47的准确分子量(5398.8Da)的示例性图。
实施例1.2：Cmyr-47与NTCP的结合试验
为了证明衍生自HBV的多肽能结合NTCP，用Cmyr-47处理各种表达NTCP的细胞系。为使Cmyr-47肉眼可见，用FITC标记该多肽。由于NTCP在肝脏中高表达，来自树鼩的原代肝细胞和人肝细胞系HepG2细胞用于本研究。如图2A和2B所示，FITC标记的Cmyr-47结合来自两个物种的肝细胞(图2A描述了Cmyr-47与树鼩原代肝细胞的结合，图2B描述了Cmyr-47与HepG2细胞的结合)。为证明Cmyr-47特异性结合NTCP，通过转染NTCP表达载体而建立了表达NTCP的L02细胞(NTCP-02)。以不表达NTCP的载体转染的L02细胞(BLANK-L02)用作阴性对照。如图3所示，标记FITC的Cmyr-47结合NTCP-L02细胞，但不结合BLANK-L02细胞。为了证实Cmyr-47的特异性，制备了非肝脏来源的HEK293细胞用于本研究。通过用NTCP表达载体转染细胞而建立了表达NTCP的HEK293细胞(NTCP-293)。以不表达NTCP的对照载体转染L02细胞(BLANK-293)用作阴性对照。如图4所示，标记FITC的Cmyr-47结合NTCP-293细胞，但不结合BLANK-293细胞。相反，与先前报道的鸟类HBV不感染哺乳动物(Gripon等，J.Virol.79(3)：1613-22(2005))的发现一样，衍生自苍鹭HBV的pre-S1区域的47个氨基酸残基的对照多肽(肉豆蔻酰化-GLNQSTFNPLGFFPSHQLDPLFKANAGSADWDKNPNKDPW PQAHDTA-酰胺化，SEQ IDNO：49)不结合NTCP-293细胞。这些结果证明Cmyr-47特异性结合NTCP。
实施例1.3：Cmyr-47的体外胆汁酸试验
为了进一步研究衍生自HBV的多肽对胆汁酸转运的影响，用标记有3H(3H-TA；牛磺胆酸)的胆汁酸孵育NTCP-293细胞。通过使用3H-TA，可通过测量细胞的放射水平而对被细胞吸收的胆汁酸进行定量。由于HEK293细胞在不表达NTCP的情况下无法吸收胆汁酸，NTCP-293细胞摄取的任何胆汁酸都可认为是NTCP所介导。将10umol/L的TA(放射性标记为3H-TA，0.5uCi/ml)和一定浓度梯度的Cmyr-47同时加到培养的细胞中10分钟。已知抑制胆汁酸转运的环孢霉素A(CsA)用作阳性对照，浓度为50μM。如图5A所示，与BLANK-293细胞相比，NTCP-293细胞能吸收大量的胆汁酸。当NTCP-293细胞经Cmyr-47处理时，胆汁酸的摄取被不同浓度的Cmyr-47双向调节。如图5B所示，Cmyr-47在500ng/ml或以下的浓度增强胆汁酸经由NTCP向肝细胞的转运，而在高于500ng/ml的浓度则明显减少对TA吸收。明显的是，62.5ng/ml的Cmyr-47将TA吸收提高50％以上，而与阳性对照CsA相比2μg/ml的Cmyr-47则有效抑制胆汁酸摄取。基于图5B所示的剂量递增研究，确定Cmyr-47阻断胆汁酸转运的IC50值为0.15μM。
与Cmyr-47双向调节NTCP-介导的胆汁酸转运相反，CsA诱导的是TA吸收的单向抑制(图5C和5D)。不论是在10ng/ml的低浓度还是在100ng/ml的高浓度，CsA都未增加NTCP介导的TA转运。基于图5D所示的剂量递增研究，CsA抑制胆汁酸转运的计算IC50值为3.05μM。
实施例1.4：其它HBV衍生的多肽的体外胆汁酸试验
为了进一步分析HBV衍生多肽对NTCP介导的胆汁酸摄取的双向效果，根据如前所述的方案对两种不同浓度(62.5ng/ml，作为代表性的低浓度；1μg/ml，作为代表性的高浓度)的Cmyr-47和其它HBV衍生的多肽进行体外胆汁酸测试。还测试了两个对照处理组，CsA和奎尼丁，用作比较。奎尼丁是I类抗心律不齐药，先前的研究显示其能增强NTCP介导的TA摄取(见Kim等，J.Pharmacol.Exp.Ther.291(3)：1204-09(1999))。CsA和奎尼丁购自Sigma-Aldrich(分别为Sigma-30024和Sigma-Q3625)。
如图5E所示，100ng/ml的CsA对TA吸收无明显影响，而奎尼丁在0.1μmol/L时提高TA吸收。表1所列的HBV衍生的多肽(Cmyr-60，Cmyr-55，Cmyr-47，Cmyr-40，Cmyr-35，Cmyr-30，Cmyr-25，Cmyr-20，Cmyr-47+(-10)，Cmyr-47+(-9)，Cplam-47，Cstea-47，Cchol-47，Amyr-47，Bmyr-47，Dmyr-47，Emyr-47，Fmyr-47，Gmyr-47或Hmyr-47)在相当于62.5ng/ml(11.58nmol/L)Cmyr-47的低浓度时提高TA吸收，证明这些HBV衍生的多肽在低浓度时能提高NTCP介导的胆汁酸摄取。
相反，当HBV衍生的多肽(Cmyr-60，Cmyr-55，Cmyr-47，Cmyr-40，Cmyr-35，Cmyr-30，Cmyr-25，Cmyr-20，Cmyr-47+(-10)，Cmyr-47+(-9)，Cplam-47，Cstea-47，Cchol-47，Amyr-47，Bmyr-47，Dmyr-47，Emyr-47，Fmyr-47，Gmyr-47或Hmyr-47)以相当于1μg/ml(185.23nmol/L)Cmyr-47的较高浓度测试时，所有多肽都有效抑制TA吸收(图5F)，证明这些HBV衍生的多肽在某个高浓度时能抑制NTCP介导的胆汁酸摄取。作为比较，50μg/ml的CsA抑制TA吸收，而20μmol/L的奎尼丁则提高TA吸收。这些结果证明，这些HBV衍生的多肽能以剂量依赖性的方式双向调节NTCP介导的胆汁酸摄取。
实施例2
实施例2.1：Cmyr-47处理的大鼠的毒性及胆汁酸、总胆固醇、甘油三酯和血糖分析
为确定Cmyr-47的毒性，并确定Cmyr-47可调节体内胆汁酸摄取，以190只SpragueDawley大鼠(雄性和雌性数量相同)进行为期6个月的长期毒性实验。各大鼠每日皮下注射作为对照的PBS或1、3或9mg/kg的Cmyr-47，共180天。实验方案如表2所不。
表2：大鼠的180天长期慢性毒性实验的实验设计方案
实验结束时，通过尾部采血从各大鼠采集血样。3000rpm离心10分钟，进一步从血样中分离出血清。用总胆汁酸检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)分析血清样品，以测定总胆汁酸(TBA)水平。如表3和4所示，与对照组相比，用Cmyr-47处理的雌性和雄性大鼠的血清都显示升高的总胆汁酸水平，表明Cmyr-47能有效阻断体内胆汁酸摄取。总胆汁酸的增加是剂量依赖性的。
表3：大鼠180天长期慢性毒性实验的血清TBA浓度(雄性，μM/L)
表4：大鼠180天长期慢性毒性实验的血清TBA浓度(雌性，μM/L)
实施例2.2：Cmyr-47处理的大鼠的总胆固醇、甘油三酯和血糖
实施例2.1中测试的各动物的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和血糖(GLU)的水平总结于表5和6中。如表5和6所示，与对照组相比，Cmyr-47的低剂量组、中剂量组或高剂量组对血清TC、TG或GLU无显著影响(所有P值均大于0.05)。因此，Cmyr-47不影响生理条件下血清TC、TG或GLU的正常水平。
表5：大鼠180天长期慢性毒性实验的血清TC、TG和GLU浓度(雄性，mmol/L，χ±SEM)
注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
表6：大鼠180天长期慢性毒性实验的血清TC、TG和GLU浓度(雌性，mmol/L，χ±SEM)
注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
实施例2.3：Cmyr-47处理的狗的毒性及胆汁酸、总胆固醇、甘油三酯和血糖分析
为进一步测定Cmyr-47的毒性，并确定Cmyr-47是否可调节体内胆汁酸摄取，以56只小比格犬(雄性和雌性数量相同)进行为期9个月的长期毒性实验。每只狗每日皮下注射作为对照的PBS或0.25、0.75或2mg/kg的Cmyr-47，共270天。实验方案如表7所示。
表7：狗的270天长期毒性实验的实验设计方案
实验结束时，通过静脉穿刺从每只狗采集血样。如上文所述从血样中分离出血清。如上文所述分析血清样品，以测定总胆汁酸(TBA)水平。如表8所示，与对照组相比，Cmyr-47以剂量依赖性的方式增加狗血清中总胆汁酸的水平。每只动物的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和血糖(GLU)的水平总结在表9中。如表9所示，与对照相比，Cmyr-47的低剂量组、中剂量组或高剂量组对血清TC、TG或GLU无显著影响(所有P值均大于0.05)。因此，Cmyr-47不影响生理条件下血清TC、TG或GLU的正常水平。
表8：270天长期慢性毒性实验中第91天检测的狗的血清TBA浓度(μM/L)
表9：270天长期慢性毒性实验中第91天检测的狗的血清TC、TG和GLU浓度(mmol/L，χ±SEM)
注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
实施例2.4：Cmyr-47处理的狗的药代动力学分析
以56只只小比格犬(雄性和雌性数量相同)进行为期1个月的长期毒性实验。每只狗每日皮下注射作为对照的PBS或0.4、1.2或3.6mg/kg的Cmyr-47，共30天。实验方案如表10所示。
表10：狗的药代动力学分析的实验设计方案
实验期间，在第一次给药后以及最后一次给药后第0、10、20、40、60、90、120、180、240、360和1440分钟通过静脉穿刺采集每只狗的血样。如前文所述从采集的血样中分离出血清。然后分析血清样品，使用抗Pre-S1抗体125E11(Wei等，Clinica.Chimica.Acta.317：159-69(2002))通过放射性免疫测定(RIA)来测定Cmyr-47的浓度。表11-13分别显示了给予0.4、1.2或3.6mg/kg的每只动物的血清浓度。如表13所示，给予3.6mg/kg的Cmyr-47的狗很好地耐受该剂量，未观察到明显的毒性。给药后20分钟(即Tmax)时Cmyr-47在血流中达到峰值浓度(即Cmax)。Cmax指药物给药后达到的峰值血清浓度。Tmax指观察到Cmax时的时间。如表13所示，例如，Cmyr-47的最高剂量能在20分钟时达到高于500ng/ml的Cmax，表明在此测试条件下Cmyr-47的Tmax是约20分钟。如表11-13所示，仅最高的剂量(3.6mg/kg)能达到高于500ng/ml的峰值浓度。
表11：皮下注射给予0.4mg.kg-1的小猎兔犬的血清Cmyr-47浓度
注：ND＝检测不到
表12：皮下注射给予1.2mg/kg的小猎兔犬的血清Cmyr-47浓度
注：ND＝检测不到
表13：皮下注射给予3.6mg/kg的小猎兔犬的血清Cmyr-47浓度
注：ND＝检测不到
实施例3
实施例3.1：用Cmyr-47治疗高脂血金仓鼠模型的方法和材料
为了分析Cmyr-47对脂质代谢的体内影响，通过喂食金黄地鼠高脂饮食2周(适应性饮食10天后)建立高脂血症金黄地鼠模型。从北京维通利华实验动物技术有限公司(SCXK(Jing)2012-0001)购得雄性金仓鼠(N＝70，90-110g)，动物的品质证书编号为11400700093338。动物饲养在浙江中医大学动物实验研究中心(SYXK(Zhe)2013-0184)，噪音控制室内(＜50dB)，温度为23±1℃，湿度为50-70％，12小时的光：暗循环(150-200Lx)。该高脂饮食的组成包括1.25％的胆固醇和20.06％的脂肪(大豆油2.79％，可可油17.27％)，该饮食购自Research Diets Inc.(New Brunswick，NJ)并保存在4℃。一组饲喂正常饲料的金黄地鼠作为正常非高脂血对照(“正常对照组”)。用Co60辐射灭菌后，将全营养大鼠颗粒饲料用作正常饲料。动物可随意获得过滤的无菌自来水。所有食物随时可得，每只笼子有4-5只动物。每周监测饲喂该高脂饮食的每只金黄地鼠的体重及食物消耗。所有动物均受到人道处理，并根据3R原则(可能时避免或替代动物的使用、减少所用动物的数量、和修改管理或实验过程以尽可能减少疼痛和伤痛)注意将疼痛和痛苦降到最低。
2周的高脂饮食处理后，当金黄地鼠的血清总胆固醇(TC)水平高于10mmol/L时，表明仓鼠具有高脂血表型。将总共40只高脂血症金黄地鼠随机分成5组(N＝8只/组)：模型对照组(10mL/kg PBS，皮下给药(sc))；阳性处理对照组(非诺贝特，50mg/kg/天，经口的胃内给药(po))；低剂量处理组(Cmyr-47，10mg/kg/天，sc)；高剂量处理组(Cmyr-47，30mg/kg/天，sc)；和CsA处理组(CsA，50mg/kg/天，po)。将饲喂正常饲料的10只仓鼠用作正常对照组(10mL/kg PBS，sc)。
采用上文所述方案由贺普药业(中国上海)合成得到白色粉末的Cmyr-47，批号：14011801)。对于各处理，在PBS中新鲜制备Cmyr-47溶液，并在制备后立即使用。用20×PB溶液(64.4652g的Na2HPO4·12H2O和3.1202g的NaH2PO4·2H2O，溶于水至体积为500mL)配制PBS。然后，将1体积的20×PB、4体积的纯水和15体积0.9％的生理盐水混合在一起，获得用于溶解测试药物的PBS。在本研究中用作阳性对照的Fenolip片(非诺贝特，FENO)购自Laboratoires FOURNIER S.A。CsA购自诺华。
PBS、Cmyr-47、FENO和CsA各自连续给予4周。在实验期间，模型对照组、低剂量组和高剂量组以及阳性对照组中所有的动物都饲喂高脂饮食，而正常对照组则饲喂正常饲料。Cmyr-47或PBS皮下注射给金黄地鼠，一天两次(早上为9：00-10：00，下午为16：00-17：00)。经口胃内将FENO给予阳性处理对照组。经口胃内将CsA给予CsA处理组。每天早上监控食物和水的消耗，粪便以及动物的饲养情况。每周给所有动物称重。
给药2周后，测量所有动物的血清TC和甘油三酯(TG)水平。给药4周后，测量所有动物的血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平。测量之前，采血前所有动物禁食12小时，但可饮水。从各动物的眼眶后血管采集0.3mL的血样，在3000rpm离心10分钟，从血样中分离出血清。从上海申能德赛诊断技术有限公司(中国上海)购得用于测量脂质的试剂盒，所有测量均按照制造商提供的说明书进行。使用7020自动生化分析仪进行测量。各动物的动脉粥样硬化指数(AI)根据下式计算：AI＝(TC-HDL-C)/HDL-C。AI被认为是患动脉粥样硬化的风险增加的最可靠指标之一。
使用赛多利斯科学仪器有限公司(中国北京)的SQP电子秤以及来自三洋公司(日本)的MLS-3750高压灭菌锅。使用来自永洁达净化科技有限公司(中国，浙江，杭州)的RO-MB-50超纯水系统。从昆山超声波仪器有限公司(中国，江苏，昆山)购买KQ-300DE超声波清洗机，从日立公司(日本)购买Hitachi 7020自动生化分析仪。使用来自Thermo FisherScientific Inc.(USA)的多功能ELISA仪器。
使用SPSS19.0软件分析数据，以平均值±标准偏差或平均值±SEM表示。采用ANOVA方差分析评估从测试结果获得的数据。采用LSD测试进行成对比较。统计学分析的值四舍五入至两位小数点。
实施例3.2：Cmyr-47和衍生自HBV的其它多肽对血清总胆固醇(TC)的影响
如表14和图6所示，实验期间，模型对照组的血清TC水平明显高于正常对照组的血清TC水平，表明饲喂高脂饮食的动物具有高脂血症(所有P值＜0.01)。与模型对照组相比，给予FENO明显降低血清TC水平(所有P值＜0.01)。与模型对照组相比，用Cmyr-47处理的高脂血动物也表现出较低的血清TC水平，且Cmyr-47的效果是剂量依赖性的。与之相反，用CsA处理的高脂血动物与模型对照组相比显示明显升高的血清TC水平。
表14：Cmyr-47对血清TC的影响
注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
还测试了表1所列的衍生自HBV的其它多肽，以确定其在体内对血清TC的作用。根据上文所述的实验方案进行测试。所有多肽的给药量以相当于30mg/kg/天的Cmyr-47计。
图7A和7B表明饲喂高脂饮食的动物具有高脂血(比较正常对照组和模型对照组的血清TC水平)。如先前所知，FENO能降低动物的血清TC水平。在第4周时，用其它HBV衍生肽处理的动物(Cmyr-60、Cmyr-55、Cmyr-40、Cmyr-35、Cmyr-30、Cmyr-25、Cmyr-20、Cmyr-47+(-10)、Cmyr-47+(-9)、Cplam-47、Cstea-47、Cchol-47、Amyr-47、Bmyr-47、Dmyr-47、Emyr-47、Fmyr-47、Gmyr-47或Hmyr-47)与模型对照组相比也表现出较低的血清TC水平。
实施例3.3：Cmyr-47和衍生自HBV的其它多肽对血清甘油三酯(TG)的影响
如表15和图8所示，在整个实验过程中，模型对照组的血清TG水平明显高于正常对照组的水平(所有P值＜0.01)。第2周和第4周的测量值表明FENO明显降低动物的血清TG水平(所有P值＜0.01)。Cmyr-47的高剂量组与模型对照组相比也明显降低动物的血清TG水平。与对血清TC的影响类似，Cmyr-47对血清TG的影响也是剂量依赖性的。值得注意的是，与模型动物相比，CsA处理提高了动物的血清TG水平。
表15：Cmyr-47对血清TG的影响
注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
还采用前文所述的方案测量了衍生自HBV的其它多肽(Cmyr-60、Cmyr-55、Cmyr-40、Cmyr-35、Cmyr-30、Cmyr-25、Cmyr-20、Cmyr-47+(-10)、Cmyr-47+(-9)、Cplam-47、Cstea-47、Cchol-47、Amyr-47、Bmyr-47、Dmyr-47、Emyr-47、Fmyr-47、Gmyr-47或Hmyr-47)给药的动物的血清TG水平。如图9A和9B所示，用这些HBV衍生多肽处理的动物的血清TG水平低于模型对照组的血清TG水平，表明所测试的所有HBV衍生多肽能降低体内血清TG。
实施例3.4：Cmyr-47和衍生自HBV的其它多肽对血清LDL-C的影响
表16和图10总结了经PBS、FENO或Cmyr-47处理的动物的血清LDL-C水平的测量值。如所预期的，与正常对照组相比，模型对照组的血清LDL-C水平明显增加，证明了该组动物具有高脂血症表型(P＜0.01)。与模型对照组相比，用FENO处理的阳性对照组表现出明显较低的血清LDL-C水平。与Cmyr-47对血清TC和TG的影响一致，与模型对照组相比，经Cmyr-47处理的动物(尤其是经30mg/kg这一高剂量处理的动物)显示明显下降的血清LDL-C水平。
表16：Cmyr-47对血清LDL-C的影响(处理后4周)
注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
还采用前文所述的方案测量了衍生自HBV的其它多肽(Cmyr-60、Cmyr-55、Cmyr-40、Cmyr-35、Cmyr-30、Cmyr-25、Cmyr-20、Cmyr-47+(-10)、Cmyr-47+(-9)、Cplam-47、Cstea-47、Cchol-47、Amyr-47、Bmyr-47、Dmyr-47、Emyr-47、Fmyr-47、Gmyr-47或Hmyr-47)给药的动物的血清LDL-C水平。如图11A和11B所示，这些动物的血清LDL-C水平低于模型对照组的血清LDL-C水平。
实施例3.5：Cmyr-47对血清HDL-C和AI的影响
表17和图12提供了血清HDL-C水平的测量值。基于本研究所获得的数值，各动物的AI值根据前文所述的公式计算。表17和图13提供了各组的AI平均值。虽然Cmyr-47未降低体内血清HDL-C，但用Cmyr-47处理的动物的AI平均值明显低于模型对照组的AI平均值，表明Cmyr-47有抗动脉粥样硬化和其它血管疾病(包括肪积累引起的心血管疾病)的保护作用。
表17：Cmyr-47对血清HDL-C和AI的影响(处理后4周)
注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
实施例3.6：Cmyr-47对血清总胆汁酸(TBA)的影响
表18和图14提供了血清TBA水平的测量值。如所预期的，模型对照组的血清TBA水平高于正常对照组的血清TBA水平。与模型对照组相比，经Cmyr-47处理的动物的血清TBA水平以剂量依赖性的方式升高，表明Cmyr-47能抑制体内胆汁酸摄取。第4周的测量结果表明高剂量的Cmyr-47能明显降低血清TBA水平(P值小于0.05)。经4周的处理后，CsA和低剂量的Cmyr-47也略有提高了血清TBA水平，虽然未达到显著性差异。
表18：Cmyr-47对血清TBA的影响
注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
实施例3.7：Cmyr-47对血清葡萄糖(GLU)的影响
如表19所示，与正常对照组相比，高脂血症动物未显示任何明显的高血糖表型(所有P值>0.05)。高剂量和低剂量Cmyr-47未将血清GLU水平降低到正常对照组和模型对照组所具有的正常血糖水平(所有P值>0.05)。
表19：Cmyr-47对金仓鼠血清GLU的影响
注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
如前文所讨论，Cmyr-47能逆转高脂饮食金黄地鼠的高脂血症表型。尤其是，高剂量的Cmyr-47能降低本研究中所测量的所有生物学指标。相反，胆汁酸摄取抑制剂CsA未产生相似的效果。此外，尽管CsA能在体外有效抑制胆汁酸摄取，体内使用CsA进行的处理却导致血清TG和TC水平升高，表明CsA具有致高脂血症作用。
与Cmyr-47对血清TC和TG水平的影响一致，经Cmyr-47处理的动物的AI值也明显低于未处理的高脂血症动物的AI值，这进一步证明Cmyr-47作为心血管疾病的预防性药物的作用。此外，衍生自HBV的其它多肽在降低血清TG、TC和LDL-C方面也显示了类似的功效，表明这些多肽也能在体内逆转高脂血症表型。
实施例3.8：不同剂量的Cmyr-47对血清TC和TG的影响
如实施例3.1构建高脂血症金黄地鼠模型。2周的高脂饮食处理后，当动物的血清总胆固醇(TC)水平高于10mmol/L时，表明该动物具有高脂血症表型。将总共32只高脂血症金黄地鼠随机分成4组(N＝8只/组)：模型对照组(10mL/kg PBS，皮下(sc))，低剂量处理组(Cmyr-47，1mg/kg/天，sc)，中剂量处理组(Cmyr-47，3mg/kg/天，sc)和高剂量处理组(Cmyr-47，10mg/kg/天，sc)。饲喂正常饲料的8只金黄地鼠作为正常对照组(10mL/kg PBS，sc)。
采用实施例3.1的方案，连续给予Cmyr-474周。实验期间，模型对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组的所有动物喂食高脂饮食，而正常对照组喂食正常饲料。Cmyr-47或PBS皮下注射给金黄地鼠，每天2次(早上为9：00-10：00，下午为16：00-17：00)。每天早上监控食物和水的消耗，粪便以及动物的饲养情况。如实施例3.1所述在处理后第2周和第4周测量所有动物的血清TC和TG水平，结果列在表20和21中。如实施例3.1所述分析数据。
如表20和图15所示，实验期间，模型对照组的血清TC水平明显高于正常对照组的血清TC水平(所有P值＜0.01)。用1mg/kg或3mg/kg的Cmyr-47进行的处理对血清TC无影响。但是，用10mg/kg Cmry-47处理4周的高脂血症动物与模型对照组相比其血清TC水平具有一定程度的降低(P＜0.05)。
表20：Cmyr-47对血清TC的影响
注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
如表21和图16所示，整个实验期间，模型对照组的血清TG水平明显正常对照组的血清TG水平(所有P值＜0.01)。以1mg/kg或3mg/kg的Cmyr-47用药组血清TG无影响。用10mg/kg Cmry-47处理4周的高脂血动物与模型对照组相比其血清TG水平具有一定程度的降低(P＜0.05)。这些数据表明，给予治疗有效量的Cmyr-47以使Cmyr-47的血清浓度能达到能双向调节NTCP介导的胆汁酸摄取的血清浓度，可有益于降低高脂血症患者的血清TC和TG水平。
表21：Cmyr-47对血清TG的影响
注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
实施例4
实施例4.1：Cmyr-47处理Zucker糖尿病肥胖大鼠实验的方法和材料
在自发性II型糖尿病动物模型Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠中评价Cmyr-47作为抗糖尿病，抗高脂血和/或抗高胆固醇血的药剂的功效。从维通利华实验动物技术有限公司(SCXK(Beijing)2012-0001)购得60天龄雄性ZDF大鼠(n＝40)和Zucker瘦(ZL)大鼠(n＝6)，动物的证书编号分别为11400700109970和11400700109972。所有动物饲养在浙江中医大学动物实验研究中心(SYXK(Zhe)2013-0184)，的噪音控制室内(＜50dB，温度为23±1℃，湿度为50-70％，无特定病原体(SPF)环境，12小时的光：暗循环(150-200Lx)。动物能自由获得来自高压蒸汽水瓶中的经过滤的无菌水。给ZDF大鼠饲喂购自Specialty Feeds，Inc.(Memphis，TN；Purina 5008；Catalogue No.SF06-019)的Purina#5008饲料。ZL大鼠则饲喂经Co60Y辐射灭菌的正常饲料(基础饲料)。每个笼子装2只ZDF大鼠或ZL大鼠。笼床每两天换一次。实验大鼠的饲养和所有操作符合人道关怀和3R原则。
经饲喂2周的Purina#5008饲料或正常饲料之后，所有动物禁食10小时但可自由饮水。然后给每只动物称重，尾部采集0.3毫升的血液。进一步分析血样的糖化血红蛋白(HbAlc)。额外采集0.5毫升的血液，3000rpm离心10分钟，分离出血清。采用下文所述试剂盒测量动物的HbA1c，血清葡萄糖(GLU)和胰岛素水平。使用Hitachi 7020组自动生化分析仪进行所有测量。
选择空腹血清GLU水平接近平均水平的30只动物，将其随机分成5组：模型对照组(PBS，10ml/kg)，低剂量治疗组(Cmyr-47，10mg/kg)，高剂量治疗组(Cmyr-47，30mg/kg)，阳性对照组(二甲双胍，300mg/kg)和CsA治疗组(CsA，20mg/kg)，每组6只动物。6只ZL大鼠用作正常对照组(PBS，10ml/kg)。PBS和Cmyr-47皮下注射给动物，每天2次(09：00和17：00)。二甲双胍(MET)和CsA溶液采用口服灌胃的方式给药，每天2次，分别早上和下午给药。所述给药方案持续4周。实验期间，ZDF大鼠饲喂Purina#5008饲料，而ZL大鼠饲喂正常饲料。
采用上文所述方案由上海贺普药业有限公司(中国上海)合成和纯化得到白色粉末的Cmyr-47，批号：14011801)，于-20℃保存。使用前，称量Cmyr-47并将其溶解在PBS中。MET由百时美施贵宝公司(中国上海)制备，批准文号为H20023370，批号为AAD7878。CsA购自诺华。
给药的第2周，动物禁食10小时，但可自由饮水，然后从每只动物的尾静脉采集0.3mL的血液，用于测量血清GLU，总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)和血尿素氮(BUN)。给药的第4周，动物禁食10小时，然后采集血液，测量血清GLU，TC，TG和BUN，HbA1c和胰岛素。最后一次给药后，动物禁食12小时，然后腹膜内注射3％戊巴比妥钠对其进行麻醉并对其实施颈脱位法处死。分离出每只动物的心脏，肾脏，肩胛脂肪和腹部脂肪，进行肉眼观察，并称重以计算心脏，肾脏和总脂肪指数。
戊巴比妥钠(含量≥95.0％，批号20130112)购自默克。TC，TG，GLU和BUN试剂盒购自德赛诊断系统(中国，上海)。HbA1c检测试剂购自Trinity Biotech Inc.(爱尔兰)。胰岛素ELISA检测试剂盒(批号0469636-1)购自Bertin Pharma(法国)。使用市售试剂盒进行的所有测量都根据制造商提供于试剂盒中的说明书进行。
使用赛多利斯科学仪器有限公司(中国北京)的SQP电子秤，来自三洋公司(日本)的MLS-3750高压灭菌锅。使用来自杭州永洁达净化科技有限公司(中国，浙江)的RO-MB-50超纯水系统。从昆山超声波仪器有限公司(中国，江苏)购买KQ-300DE超声波清洗机，从日立公司(日本)购买Hitachi 7020自动生化分析仪。Hb9210糖化血红蛋白分析仪购自TrinityBiotech Inc(爱尔兰)。使用来自Thermo Fisher Scientific Inc.(MA，USA)的多功能酶标仪。
采用SPSS 19.0软件(SPSS，Chicago，IL)进行统计学分析。所有数据以平均值±均值的标准误差表示。采用ANOVA方差分析评估从测试结果获得的数据。采用LSD测试进行成对比较。统计学分析的值四舍五入至两位小数点。
实施例4.2：Cmyr-47和衍生自HBV的其它多肽对血清葡萄糖(GLU)的影响
高血糖(即血葡萄糖升高)是II型糖尿病最主要症状之一。如表22和图17所示，通过比较模型对照组的血清GLU水平与正常对照组的血清GLU水平，证实了ZDF大鼠的高血糖表型(所有P值＜0.01)。MET是已知的抗糖尿病药，能有效降低糖尿病患者的血糖。如所预期的，与模型对照组相比，MET处理的ZDF大鼠显示明显降低的空腹血清GLU。Cmyr-47也能降低ZDF大鼠的血糖。具体而言，处理4周后，低剂量和高剂量Cmyr-47都能有效地降低动物的血清GLU水平。Cmyr-47对血糖的影响是剂量依赖性的。相反，与模型对照组相比，CsA处理明显提高了动物的血清GLU水平。
表22：Cmyr-47对ZDF大鼠空腹血清GLU的影响
注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
还采用与上文相同的方案测试了表1所列的其它衍生自HBV的多肽，以分析它们对体内血糖的影响。所有多肽以相当于30mg/kg/天的Cmyr-47的量给药。
如图18A和18B所示，ZDF大鼠证实具有高血糖表型。如在上述研究中所观察到的，用MET处理明显降低体内空腹血清GLU。用HBV衍生的肽(Cmyr-60、Cmyr-55、Cmyr-40、Cmyr-35、Cmyr-30、Cmyr-25、Cmyr-20、Cmyr-47+(-10)、Cmyr-47+(-9)、Cplam-47、Cstea-47、Cchol-47、Amyr-47、Bmyr-47、Dmyr-47、Emyr-47、Fmyr-47、Gmyr-47或Hmyr-47)处理4周后，ZDF大鼠的空腹血清GLU水平与模型对照组相比下降，证明了所述多肽用作抗糖尿病药的作用。
实施例4.3：Cmyr-47和衍生自HBV的其它多肽对HbA1c的影响
HbAlc指糖化血红蛋白，当一个对象经历持续性高血糖时，其水平明显升高。如表23和图19所示，与ZDF大鼠的高血糖表型一致，在整个研究期间，模型对照组的HbA1c水平一直都明显高于正常对照组的水平(所有P值＜0.01)。同样，与MET对血糖的作用一样，用MET处理也明显降低ZDF大鼠的HbA1c水平(P＜0.01)。与模型对照组相比，Cmyr-47处理的ZDF大鼠的HbA1c水平还显示出明显的剂量依赖性的降低，表明Cmyr-47作为体内调节血糖的抗糖尿病药的作用。与CsA对血清GLU水平的影响一样，CsA处理4周后血清HbAlc明显增加。
表23：Cmyr-47对ZDF大鼠的HbA1c水平的影响
注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
当如上文所述在相同的动物模型中测试表1所列的衍生自HBV的其它多肽也显示出类似的效果。如图20A和20B所示，模型对照组的HbAlc水平高于多肽处理的ZDF大鼠的HbAlc水平。这些结果证明衍生自HBV的多肽能有效地降低血糖和HbA1c，这些结果也证实了CsA具有升高血糖的影响
实施例4.4：Cmyr-47对血清胰岛素的影响
II型糖尿病患者伴随胰岛素抵抗，胰岛素过量产生，以及胰脏损伤导致的最终的胰岛素分泌恶化。为了证实Cmyr-47能通过防止胰脏损伤而调节胰岛素，将Cmyr-47处理的动物的胰岛素水平与经PBS或MET处理的动物的胰岛素水平进行比较。如表24和图21所示，ZDF大鼠的起始血清胰岛素水平明显高于正常对照组的起始水平。虽然第4周时ZDF大鼠的胰岛素水平仍高于正常对照组的水平，但与起始水平相比，绝对水平明显下降。这一变化表明研究期间ZDF大鼠的胰岛素抵抗仍在发展，导致胰腺衰竭。虽然模型对照组与阳性对照组的空腹胰岛素水平之间无统计学上的显著性差异(P＞0.05)，MET处理呈现出能保护动物免受血清胰岛素损失影响。但是，模型对照组和Cmyr-47处理动物之间的显著性差异(所有P值＜0.05)表明，两种剂量的Cmyr-47处理均能完全稳定胰岛素的分泌，如果未增加的话。这些结果证明Cmyr-47可防止胰脏损伤，因此有助于糖尿病患者维持适当的胰岛素分泌。
表24：Cmyr-47对ZDF大鼠血清胰岛素的影响
注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
实施例4.5：Cmyr-47和衍生自HBV的其它多肽对血清总胆固醇(TC)的影响
如上文所讨论的，糖尿病表型包括脂质失调，包括血流中胆固醇和甘油三酯水平的升高。如表25和图22所示，与正常对照组相比，模型对照组的血清TC水平一直在升高(所有P值＜0.05)。但与MET对血糖的影响相反，MET在降低ZDF大鼠血清TC水平方面完全无效。CsA在降低ZDF大鼠血清TC水平方面也完全无效，4周的处理后与模型对照组相比CsA明显提高了血清TC水平。值得注意的是，与模型对照组相比，高剂量的Cmyr-47明显降低了ZDF大鼠血清TC水平，表明Cmyr-47能调节糖尿病患者中普遍升高的很大范围的生物标记物。
表25：Cmry-47对ZDF大鼠中血清TC的影响
注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
用衍生自HBV的其它多肽处理的动物也显示能降低体内血清TC。如图23A和23B所示，经HBV衍生的多肽(Cmyr-60、Cmyr-55、Cmyr-40、Cmyr-35、Cmyr-30、Cmyr-25、Cmyr-20、Cmyr-47+(-10)、Cmyr-47+(-9)、Cplam-47、Cstea-47、Cchol-47、Amyr-47、Bmyr-47、Dmyr-47、Emyr-47、Fmyr-47、Gmyr-47或Hmyr-47)处理4周后，ZDF大鼠的血清TC水平低于模型对照组的血清TC水平。这些结果证明，MET仅能靶向一种具体症状，而衍生自HBV的多肽能靶向多个途径，因此有利于同时控制糖尿病相关的症状。
实施例4.6：Cmyr-47和衍生自HBV的其它多肽对血清甘油三酯(TG)的影响
除血清TC外，血清TG也是可导致糖尿病的高脂血症的生物标记。如所预料的，表26和图24显示模型对照组的血清TG水平在整个研究期间都明显高于正常对照组的血清TG水平(所有P值＜0.01)。值得注意的是，在第2周时，MET明显提高ZDF大鼠的血清TG水平(P＜0.01)。在第4周时，MET处理的ZDF大鼠的血清TG水平仍高于模型对照组的水平，虽然差异不显著。与对血清TC水平的影响一样，CsA进一步提高了ZDF大鼠的血清TG水平。相反，两种剂量的Cmyr-47都能降低ZDF大鼠的血清TG水平，且Cmyr-47的作用是剂量依赖性的。
表26：Cmyr-47对ZDF大鼠的血清TG的影响
注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
当在上文所述的相同动物模型中进行测试衍生自HBV的其它多肽也能在降低体内血清TG。如图25A和25B所示，模型对照组的血清TG水平维持高于HBV衍生肽(Cmyr-60、Cmyr-55、Cmyr-40、Cmyr-35、Cmyr-30、Cmyr-25、Cmyr-20、Cmyr-47+(-10)、Cmyr-47+(-9)、Cplam-47、Cstea-47、Cchol-47、Amyr-47、Bmyr-47、Dmyr-47、Emyr-47、Fmyr-47、Gmyr-47或Hmyr-47)处理的ZDF大鼠的血清TG水平，这进一步证明衍生自HBV的多肽也能同时调节葡萄糖代谢和脂质代谢。
实施例4.7：Cmyr-47对血清血尿素氮(BUN)的影响
升高的血清BUN反映受损的肾功能，通常出现在人类糖尿病患者中。在ZDF模型中，糖尿病导致肾功能不全以及血清BUN的关联升高。如所预料的，表27和图26显示整个研究期间模型对照组的血清BUN水平明显高于正常对照组的血清BUN水平。MET处理未能逆转肾功能不全，因为模型对照组和阳性对照组的BUN差异不显著。但是，高剂量Cmyr-47在第4周时明显降低ZDF大鼠的血清BUN水平(P＜0.01)，表明Cmyr-47可保护糖尿病对象免受肾损伤和肾功能不全。
表27：Cmyr-47对ZDF大鼠血清BUN的影响
注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
实施例4.8：Cmyr-47对器官指数的影响
糖尿病患者发生心血管疾病、肾功能不全以及肥胖的风险增加。如上文所讨论的，各种指数，如心脏指数(HI)、肾脏指数(KI)和总脂肪指数(TFI)可用作该风险的定量指标。如表28和图27A所示，模型对照组的HI值高于正常对照组。MET处理组对HI值无影响。令人惊讶的是，两种剂量的Cmyr-47明显降低ZDF大鼠的HI值，表明Cmyr-47有益于预防不利的心血管事件。
如表28和图27B所示，模型对照组的KI值明显高于正常对照组的KI值(P＜0.01)，表明ZDF大鼠在此研究期间发生了肾功能不全。与Cmyr-47对血清BUN的影响一样，Cmyr-47处理也降低了ZDF大鼠的KI值，虽然差异不具有统计学显著性。
表28和图27C显示模型对照组的TFI值明显高于正常对照组的TFI值(P＜0.01)，表明ZDF大鼠出现病态肥胖。Cmyr-47处理组显示TFI值低于模型对照组的趋势，虽然统计学上不显著。值得注意的是，MET未显示类似的趋势，相反，MET提高了ZDF大鼠的TFI值。
表28：Cmyr-47处理4周后对ZDF大鼠器官指数的影响
注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
实施例4.9：Cmyr-47对血清总胆汁酸(TBA)的影响
为了证实Cmyr-47能调节血清TBA水平，测量各动物的血清TBA水平。如表29和图28所示，模型对照组的血清TBA水平高于正常对照组的血清TBA水平。与模型对照组相比，Cmyr-47处理的ZDF大鼠的血清TBA水平剂量依赖性的提高。第4周的测量值证明高剂量的Cmyr-47明显提高了血清TBA水平(P值低于0.05)。同时，CsA处理4周后明显升高血清TBA水平(P值低于0.01)。
表29：Cmyr-47对ZDF大鼠血清TBA的影响
注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
MET是广泛使用的抗糖尿病药，能在体内有效调节血糖。如上文所呈现的，本研究也证实了MET在血糖调节方面的功效。但是，如MET未能降低ZDF大鼠血清TC、TG和BUN水平以及HI值的结果所证明的，MET未能提供抗脂质异常及相关疾病的有益作用。如高脂血症动物模型中所显示，CsA处理不仅提高了血清TG和TC水平，而且还进一步提高血清GLU水平，表明体外有效抑制胆汁酸摄取并不总能说明其在体内对脂质和葡萄糖代谢具有治疗效果。相反，Cmyr-47在所有测试中均表现良好。如上文所证明的，Cmyr-47能调节血糖和脂质代谢，同时抗胰腺损伤、肾功能失调以及心血管疾病发生。因此，作为抗高血糖药、抗高胆固醇血症药、抗高脂血症药以及抗肥胖药，Cmyr-47要优于MET，并同时显示出对多种糖尿病表型的全面的作用。
序列表
<110> 上海贺普药业股份有限公司
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的多肽
<220>
<223> N末端Myr
<220>
<223> C-末端NH2
<400> 15
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Ala Phe Lys Ala Asn Ser Glu Asn Pro Asp Trp Asp
20 25 30
Leu Asn Pro Asn Lys Asp Asn Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly
35 40 45
<210> 16
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的多肽
<220>
<223> N末端Myr
<220>
<223> C-末端NH2
<400> 16
Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp Asp
20 25 30
Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly
35 40 45
<210> 17
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的多肽
<220>
<223> N末端Myr
<220>
<223> C-末端NH2
<400> 17
Gly Lys Asn Ile Ser Thr Thr Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Arg Asn Pro Asp Trp Asp
20 25 30
His Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Thr Glu Ala Asn Lys Val Gly
35 40 45
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的多肽
<220>
<223> N末端Myr
<220>
<223> C-末端NH2
<400> 18
Gly Gln Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
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Gln Leu Asp Pro Leu Phe Arg Ala Asn Ser Ser Ser Pro Asp Trp Asp
20 25 30
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<210> 19
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的多肽
<220>
<223> N末端Myr
<220>
<223> C-末端NH2
<400> 19
Gly Lys Asn Leu Ser Ala Ser Asn Pro Leu Gly Phe Leu Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Asn Asn Pro Asp Trp Asp
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<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的多肽
<220>
<223> N末端Myr
<220>
<223> C-末端NH2
<400> 20
Gly Gln Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
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Gln Leu Asp Pro Leu Phe Arg Ala Asn Ser Ser Ser Pro Asp Trp Asp
20 25 30
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<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 21
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1 5 10 15
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20 25 30
Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala
35 40 45
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50 55 60
<210> 22
<211> 55
<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 22
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1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp
20 25 30
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35 40 45
Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe
50 55
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<211> 47
<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 23
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
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20 25 30
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<211> 40
<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 24
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
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Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp
20 25 30
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<211> 35
<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 25
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1 5 10 15
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Phe Asn Pro
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<213> 乙肝病毒
<400> 26
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Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp
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<211> 25
<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 27
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
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<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 28
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
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Gln Leu Asp Pro
20
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<211> 58
<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 29
Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser
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<210> 30
<211> 57
<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 30
Gly Leu Ser Trp Thr Val Pro Leu Glu Trp Gly Thr Asn Leu Ser Val
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Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp
35 40 45
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50 55
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<211> 47
<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 31
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
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Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp
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Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly
35 40 45
<210> 32
<211> 47
<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 32
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp
20 25 30
Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly
35 40 45
<210> 33
<211> 47
<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 33
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp
20 25 30
Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly
35 40 45
<210> 34
<211> 47
<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 34
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp
20 25 30
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35 40 45
<210> 35
<211> 47
<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 35
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Ala Phe Lys Ala Asn Ser Glu Asn Pro Asp Trp Asp
20 25 30
Leu Asn Pro Asn Lys Asp Asn Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly
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<211> 47
<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 36
Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
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<211> 47
<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 37
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Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Arg Asn Pro Asp Trp Asp
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<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 38
Gly Gln Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
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<211> 47
<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 39
Gly Lys Asn Leu Ser Ala Ser Asn Pro Leu Gly Phe Leu Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Asn Asn Pro Asp Trp Asp
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35 40 45
<210> 40
<211> 47
<212> PRT
<213> 乙肝病毒
<400> 40
Gly Gln Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Leu Phe Arg Ala Asn Ser Ser Ser Pro Asp Trp Asp
20 25 30
Phe Asn Thr Asn Lys Asp Asn Trp Pro Met Ala Asn Lys Val Gly
35 40 45
<210> 41
<211> 3221
<212> DNA
<213> 乙肝病毒
<400> 41
ttccactgcc ttccaccaag ctctgcagga tcccaaagtc aggggtctgt attttcctgc 60
tggtggctcc agttcaggaa cagtcaaccc tgctccaaat attgcctctc acatctcgtc 120
aatctccgcg aggactgggg accctgtgcc gaacatggag aacatcacat caggattcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240
gcagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggatcac ccgtgtgtct 300
tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcctgtc ctccaatttg 360
tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttattgg ttcttctgga ttatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
aattccagga tcaacaacaa ccagtacggg accatgcaaa acctgcacga ctcctgctca 540
aggcaactct atgtttccct catgttgctg tacaaaacct atggatggaa attgcacctg 600
tattcccatc ccatcgtcct gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcttgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtttggctt tcagctatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acagcatcgt 780
gagtcccttt ataccgctgt taccaatttt cttttgtctc tgggtataca tttaaaccct 840
aacaaaacaa aaagatgggg ttattcccta aacttcatgg tctacataat tggaagttgg 900
ggaacgttgc cacaggatca tattgtacaa aagatcaaac actgttttag aaaacttcct 960
gttaacagac ctattgattg gaaagtatgt caaagaattg tgggtctttt gggctttgct 1020
gctccattta ctcaatgtgg atatcctgcc ttaatgcctt tgtatgcatg tatacaagct 1080
aaacaggctt ttactttctc gccaacttac aaggcctttc taagtaaaca gtatatgaac 1140
ctttaccccg ttgctcggca acggcctggt ctgtgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggctggg gcttggccat aggccatcag cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagccgct tgttttgctc gcagccggtc tggagcaaag 1320
ctcatcggaa ctgataattc tgtcgtcctc tcgcggaaat atacatcgtt tccatggctg 1380
ctaggctgta ctgccaactg gatccttcgc gggacgtcct ttgtttacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc ctcgcggggc cgcttgggag tctctcgtcc ccttctccgt 1500
ctgccgttcc agccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggtccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgttgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca tcagatcctg cccaaggtct tacataagag gactcttgga ctctcagcaa 1680
tgtcaatgac cgaccttgag gcctacttca aagactgtgt gtttaaggac tgggaggagc 1740
ttggggagga gattaggtta aaggtgtttg tattaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gcgcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcttgta catgtcccac 1860
ttttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccttataa 1920
agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct tctgacttct ttccttccgt 1980
cagagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa gccttagagt ctcctgagca 2040
ttgctctcct caccatactg cactcaggca agccattctc tgctgggtgg aattgatgac 2100
tctagccacc tgggtgggta ataatttgga agatccagca tccagggatc tagtagtcaa 2160
ttatgttaat actaacatgg gtttaaagat caggcaacta ttgtggtttc atatatcttg 2220
tcttactttt ggaagacaga ctgtgctaga atatttggtc tctttcggag tgtggattcg 2280
cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggagactac 2340
tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga agaactccct cgcctcgcag 2400
acgcagatct caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct cgggaatctc aatgttagta 2460
ttccttggac tcataaggtg ggaaatttta ctgggcttta ttcctctaca gtacctatct 2520
ttaatcctga atggcaaact ccttcctttc ctaagattca tttacaagag gacattatta 2580
ataggtgtca acaatttgtg ggccctctca ctgtaaatga aaagagaaga ctgaaattaa 2640
ttatgcctgc cagattctat cctacccaca ctaaatattt gcccttagac aaaggaatta 2700
aaccttatta tccagatcag gtagttaatc attacttcca aaccagacat tatttacata 2760
ctctttggaa ggctgggatt ctatataaga gggaaaccac acgtagcgca tcattttgcg 2820
ggtcaccata ttcttgggaa caagagctac atcatgggag gttggtcatc aaaacctcgc 2880
aaaggcatgg ggacgaacct ttctgttccc aaccctctgg gattctttcc cgatcatcag 2940
ttggaccctg cattcggagc caattcaaac aatccagatt gggacttcaa ccccatcaag 3000
gaccactggc cagcaggcaa ccaggtagga gtgggagcat tcgggccaag gctcacccct 3060
ccacacggcg gtattttggg gtggagccct caggctcagg gcatattggc cacagtgtca 3120
acaattcctc ctcctgcctc caccaatcgg cagtcaggaa ggcagcctac tcccatctct 3180
ccacctctaa gagacagtca tcctgaggcc atgcagtgga a 3221
<210> 42
<211> 3215
<212> DNA
<213> 乙肝病毒
<400> 42
aactccacca ctttccacca aactcttcaa gatcccagag tcagggccct gtaccttcct 60
gctggtggct ccagttcaga aatagtgagc cctgctcaga atactgtctc tgccatatcg 120
tcaatcttat cgaagactgg ggaccctgta ccgaacatgg agaacatcgc atcaggactc 180
ctaggacccc tgctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaaaaat cctcacaata 240
ccacagagtc tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc tagggggaac acccgtgtgt 300
cttggccaaa attcgcagtc ccaaatctcc agtcactcac caacctgttg tcctccaatt 360
tgtcctgggt atcgctggat gtgtctgcgg cgttttatca tattcctctg catcctgctg 420
ctatgcctca tcttcttgtt ggttcttctg gactatcaag gtatgttgcc cgtttgtcct 480
ctaattccag gatcatcaac aaccagcacc ggaccatgca aaacctgcac aactcctgct 540
caaggaacct ctatgtttcc ctcatgttgc tgtacaaaac ctacggacgg aaactgcacc 600
tgtattccca tcccatcatc ttgggctttc gcaaaattcc tatgggagtg ggcctcagtc 660
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actgtctggc tttcagttat atcgatgatg tggttttggg ggccaagtct gtacaacatc 780
ttgagtccct ttataccgct gttaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttaaacc 840
ctcacaaaac aaaaagatgg ggatattccc ttaacttcat gggatatgta attgggagtt 900
ggggcacatt gccacaggaa catattgtac aaaaaatcaa aatgtgtttt aagaaacttc 960
ctgtaaacag gcctattgat tggaaagtat gtcaacgaat tgtgggtctt ttggggtttg 1020
ccgccccttt tacgcaatgt ggatatcctg ctttaatgcc tttatatgca tgtatacaag 1080
caaaacaggc ttttactttc tcgccaactt acaaggcctt tctaagtaaa cagtatatga 1140
acctttaccc cgttgctcgg caacggcctg gtctgtgcca agtgtttgct gacgcaaccc 1200
ccactggttg gggcttggcc attggccatc agcgcatgcg tgggaccttt gtgtctcctc 1260
tgccgatcca tactgcggaa ctcctagccg cttgttttgc tcgcagcagg tctggggcaa 1320
aactcatcgg gactgacaat tctgtcgtgc tctcccgcaa gtatacatca tttccatggc 1380
tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg 1440
cgctgaatcc cgcggacgac ccctcccggg gccgcttggg gctctaccgc ccgcttctcc 1500
gcctgttgta ccgaccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc 1560
cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac 1620
cgtgaacgcc cacaggaacc tgcccaaggt cttgcataag aggactcttg gactttcagc 1680
aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt gtgtttactg agtgggagga 1740
gttgggggag gagattaggt taaaggtctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt 1800
gtgttcacca gcaccatgca actttttcac ctctgcctaa tcatctcatg ttcatgtcct 1860
actgttcaag cctccaagct gtgccttggg tggctttggg gcatggacat tgacccgtat 1920
aaagaatttg gagcttctgc ggagttactc tcttttttac cttctgactt ctttccttct 1980
attcgagatc ttctcgacac cgcctctgct ctgtatcggg aggccttaga gtctccggaa 2040
cattgttcac ctcaccatac ggcactcagg caagctattc tgtgttgggg tgagttgatg 2100
aatctagcca cctgggtggg aagtaatttg gaagatccag catccaggga attagtagtc 2160
ggctatgtca acgttaatat gggcctaaaa cttagacaac tattgtggtt tcacatttcc 2220
tgtcttactt ttgggagaga aactgttctt gaatatttgg tgtcttttgg agtgtggatt 2280
cgcactcctt ctgcatatag accaccaaat gcccctatcc tatcaacact tccggaaact 2340
actgttgtta gacgaagagg caggtcccct agaagaagaa ctccctcgcc tcgcagacga 2400
aggtctcaat cgccgcgtcg cagaagatct caatctcggg aatctcaatg ttagtattcc 2460
ttggacacat aaggtgggaa actttacggg gctttattct tctacggtac cttgttttaa 2520
tcctaaatgg caaactcctt cttttcctga cattcatttg caggaggaca ttgttgatag 2580
atgtaagcaa tttgtggggc cccttacagt aaatgaaaac aggagactaa aattaattat 2640
gcctgctagg ttttatccca atgttactaa atatttgccc ttagataaag ggatcaaacc 2700
gtattatcca gagtatgtag ttaatcatta cttccagacg cgacattatt tacacactct 2760
ttggaaagcg gggatcttat ataaaagaga gtccactcgt agcgcctcat tttgcgggtc 2820
accatattct tgggaacaag atctacagca tgggaggttg gtcttccaaa cctcgaaaag 2880
gcatggggac aaatctttct gtccccaatc ccctgggatt cttccccgat catcagttgg 2940
accctgcatt caaagccaac tcagaaaatc cagattggga cctcaacccg cacaaggaca 3000
actggccgga cgccaacaag gtgggagtgg gagcattcgg gccagggttc acccctcccc 3060
atggggggct gttggggtgg agccctcagg ctcagggcct actcacaact gtgccagcag 3120
ctcctcctcc tgcctccacc aatcggcagt caggaaggca gcctactccc ttatctccac 3180
ctctaaggga cactcatcct caggccatga agtgg 3215
<210> 43
<211> 3215
<212> DNA
<213> 乙肝病毒
<400> 43
aattccacaa cattccacca agctctgcta gaccccagag tgaggggcct atactttcct 60
gctggtggct ccagttccgg aacagtaaac cctgttccga ctactgcctc acccatatcg 120
tcaatcttct cgaggactgg ggaccctgca ccgaacatgg agagcacaac atcaggattc 180
ctaggacccc tgctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata 240
ccacagagtc tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc tagggggagc acccacgtgt 300
cctggccaaa attcgcagtc cccaacctcc aatcactcac caacctcttg tcctccaatt 360
tgtcctggct atcgctggat gtgtctgcgg cgttttatca tattcctctt catcctgctg 420
ctatgcctca tcttcttgtt ggttcttctg gactaccaag gtatgttgcc cgtttgtcct 480
ctacttccag gaacatcaac taccagcacg ggaccatgca agacctgcac gagtcctgct 540
caaggaacct ctatgtttcc ctcttgttgc tgtacaaaac cttcggacgg aaactgcact 600
tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc gcaagattcc tatgggagtg ggcctcagtc 660
cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc 720
actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccatgtct gtacaacatc 780
ttgagtccct ttttacctct attaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttgaacc 840
ctaataaaac caaacgttgg ggctactccc ttaacttcat gggatatgta attggaagtt 900
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caggcaagca attctgtgct ggggtgagtt gatgactcta gctacctggg tgggtaataa 2160
tttggaagat ccagcatcca gagatttggt ggtcaattat gttaatacta atatgggttt 2220
aaaaatcagg caactattgt ggtttcacat ttcctgtctt acttttggga gagaaaccgt 2280
tcttgagtat ttggtgtctt ttggagtgtg gattcgcact cctcctgctt atagaccacc 2340
aaatgcccct atcctatcaa cacttccgga gactactgtt gttagacgaa gaggcaggtc 2400
ccctcgaaga agaactccct cgcctcgcag acgaagatct caatcgccgc gtcgcagaag 2460
atctgcatct ccagcttccc aatgttagta ttccttggac tcacaaggtg ggaaacttta 2520
cggggctgta ttcttctact atacctgtct ttaatcctga ttggcaaact ccttcttttc 2580
caaatatcca tttgcatcaa gacattataa ctaaatgtga acaatttgtg ggccctctca 2640
cagtaaatga gaaacgaaga ttaaaactag ttatgcctgc cagatttttc ccaaactcta 2700
ctaaatattt accattagac aaaggtatca aaccgtatta tccagaaaat gtagttaatc 2760
attacttcca gaccagacat tatttacata ccctttggaa ggcgggtatt ctatataaga 2820
gagaaacatc ccgtagcgct tcattttgtg ggtcaccata tacttgggaa caagatctac 2880
agcatggggc tttcttggac ggtccctctc gagtggggaa agaacctttc caccagcaat 2940
cctctaggat tccttcccga tcaccagttg gacccagcat tcagagcaaa taccaacaat 3000
ccagattggg acttcaatcc caaaaaggac ccttggccag aggccaacaa ggtaggagtt 3060
ggagcctatg gacccgggtt cacccctcca cacggaggcc ttttggggtg gagccttcag 3120
tctcagggca cactaacaac tttgccagca gatccgcctc ctgcctccac caatcgtcag 3180
tcagggaggc agcctactcc catctctcca ccactaagag acagtcatcc tcaggccatg 3240
cagtggaa 3248
<210> 48
<211> 3215
<212> DNA
<213> 乙肝病毒
<400> 48
ctcaacacag ttccaccaag cactgttgga tccgagagta agggggctgt attttcctgc 60
tggtggctcc agttcagaaa cacagaaccc tgctccgact attgcctctc tcacatcatc 120
aatcttctcg aagactgggg accctgctat gaacatggag aacatcacat caggactcct 180
aggacccctt ctcgtgttac aggcggtgtg tttcttgttg acaaaaatcc tcacaatacc 240
aaagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta ggggtaccac ccgggtgtcc 300
tggccaaaat tcgcagtccc caatctccaa tcacttacca acctcctgtc ctccaacttg 360
tcctggctat cgttggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctcttca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctatcaaggt atgttgcccg tgtgtcctct 480
acttccagga tcwacaacca ccagcacggg accctgcaaa acctgcacca ctcttgctca 540
aggaacctct atgtttccct cctgctgctg taccaaacct tcggacggaa attgcacctg 600
tattcccatc ccatcatctt gggctttcgg aaaataccta tgggagtggg cctcagcccg 660
tttctcttgg ctcagtttac tagtgcaatt tgttcagtgg tgcgtagggc tttcccccac 720
tgtctggctt ttagttatat ggatgatctg gtattggggg ccaaatctgt gcagcatctt 780
gagtcccttt ataccgctgt taccaatttt ttgttatctg tgggcatcca tttgaacaca 840
gctaaaacaa aatggtgggg ttattccctt cactttatgg gttatataat tgggagttgg 900
gggaccttgc ctcaggaaca tattgtgcat aaaatcaaag attgctttcg caaacttccc 960
gtgaatagac ccattgattg gaaggtttgt caacgcattg tgggtctttt gggctttgca 1020
gcccctttta ctcaatgtgg ttatcctgct ctcatgccct tgtatgcctg tattrccgct 1080
aagcaggctt ttgttttctc gccaacttac aaggcctttc tctgtaaaca atacatgaac 1140
ctttaccccg ttgctcggca acggccaggc ctttgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggctggg gcttggcgat tggccatcag cgcatgcgcg gaacctttgt ggctcctctg 1260
cccatccata ctgcggaact cctagccgct tgtttcgctc gcagcaggtc tggagcggac 1320
attatcggca ctgacaactc cgttgtcctt tctcggaagt acacctcctt cccatggctg 1380
ctaggctgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtctacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcctg cggacgaccc ctctcgtggt cgcttggggc tctgccgccc tcttctccgc 1500
ctgccgttcc ggccgacgac gggtcgcacc tctctttacg cggactcccc gcctgtgcct 1560
tctcatctgc cggcccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgcccc ttggaacttg ccaacaacct tacataagag gactcttgga ctttcgcccc 1680
ggtcaacgac ctggattgag gaatacatca aagactgtgt atttaaggac tgggaggagt 1740
cgggggagga gttgaggtta aaggtctttg tattaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atcttttgtt catgtcccac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccttataa 1920
agaatttgga gcttctgtgg agttactctc atttttgcct tctgacttct tcccgtctgt 1980
ccgggaccta ctcgacaccg cttcagccct ctaccgagat gccttagaat caccagaaca 2040
ttgcaccccc aaccacactg ctctcaggca agctattttg tgctggggtg agttgatgac 2100
cttggcttcc tgggtgggca ataatttaga ggatcctgca gcaagagatc tagtagttaa 2160
ttatgtcaat actaacatgg gcctaaaaat tagacaatta ttatggtttc acatttcttg 2220
ccttacattt ggaagagaaa ctgtgcttga gtatttggtg tcttttggag tgtggattcg 2280
cactccacct gcttatagac caccaaatgc ccctatccta tcaacacttc cggagactac 2340
tgttgttaga caacgaggca gggcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
atctcaatct ccgcgtcgca gaagatctca atctccagct tcccaatgtt agtattcctt 2460
ggactcataa ggtgggaaac tttaccggtc tttactcctc tactatacct gttttcaatc 2520
ctgactggtt aactccttct tttcctgaca ttcacttgca tcaagatctg atacaaaaat 2580
gtgaacaatt tgtaggccca ctcactacaa atgaaaggag acgattgaaa ctaattatgc 2640
cagctaggtt ttatcccaaa gttactaaat acttcccttt ggataaaggt attaagcctt 2700
actatccaga gaatgtggtt aatcattact ttaaaactag acattattta catactttgt 2760
ggaaggcagg aattctatat aagagagaat ccacacatag cgcctcattt tgtgggtcac 2820
catattcctg ggaacaagag ctacagcatg ggagcacctc tctcaacggc gagaaggggc 2880
atgggacaga atctttctgt gcccaatcct ctgggattct ttccagacca ccagttggat 2940
ccactattca gagcaaattc cagcagtccc gattgggact tcaacacaaa caaggacaat 3000
tggccaatgg caaacaaggt aggagtggga ggcttcggtc cagggttcac acccccacac 3060
ggtggccttc tggggtggag ccctcaggca cagggcattc taacaacctc gccaccagat 3120
ccacctcctg cttccaccaa tcggaggtca ggaagaaagc caaccccagt ctctccacct 3180
ctaagggaca cacatccaca ggccatgcag tggaa 3215
<210> 49
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的多肽
<220>
<223> N末端Myr
<220>
<223> C-末端NH2
<400> 49
Gly Leu Asn Gln Ser Thr Phe Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Ser His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Leu Phe Lys Ala Asn Ala Gly Ser Ala Asp Trp Asp
20 25 30
Lys Asn Pro Asn Lys Asp Pro Trp Pro Gln Ala His Asp Thr Ala
35 40 45

Claims (73)

1.一种治疗针对代谢疾病的方法，所述方法包括给予该疾病对象治疗有效量的多肽或含该多肽的药物组合物，以使所给予的多肽的血清浓度能双向调节该对象中NTCP介导的胆汁酸摄取，其中，所述多肽含有衍生自乙肝病毒(HBV)的氨基酸序列。
2.一种降低关于代谢疾病的对象中血清脂质水平的方法，所述方法包括给予该对象治疗有效量的多肽或含该多肽的药物组合物，以使所给予的多肽的血清浓度能双向调节该对象中NTCP介导的胆汁酸摄取，其中，所述多肽含有衍生自乙肝病毒(HBV)的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，
(a)当所给予的多肽在该对象中的血清浓度为93nmol/L或以下时，该多肽提高该对象中NTCP介导的胆汁酸摄取；和/或
(b)当所给予的多肽在该对象中的血清浓度高于93nmol/L时，该多肽抑制该对象中NTCP介导的胆汁酸摄取。
4.如权利要求2所示的方法，其特征在于，所述血清脂质包括选自胆固醇、甘三酯和LDL-C的一种或多种脂质。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，给予该多肽后约20分钟，该多肽在对象中的血清浓度达到峰值浓度。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述峰值浓度为高于93nmol/L。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述对象患有代谢疾病或有患上代谢疾病的风险。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述代谢疾病涉及脂质代谢失调。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述代谢疾病是胆固醇相关疾病。
10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述代谢疾病是高脂血症。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述高脂血症是高甘油三酯血症、高胆固醇血症或其组合。
12.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述代谢疾病涉及葡萄糖代谢失调。
13.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述代谢疾病是高血糖。
14.如权利要求7、12和13任一项所述的方法，其特征在于，所述代谢疾病是糖尿病。
15.如权利要求7、12和13任一项所述的方法，其特征在于，所述代谢疾病是肥胖。
16.一种降低关于代谢疾病的对象的血糖水平的方法，包括给予该对象治疗有效量的多肽或含该多肽的药物组合物，其中，所述多肽含有衍生自乙肝病毒(HBV)的氨基酸序列。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所给予的多肽的血清浓度使该多肽能双向调节该对象中NTCP介导的胆汁酸摄取。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，
(a)当所给予的多肽在该对象中的血清浓度为93nmol/L或以下时，该多肽提高该对象中NTCP介导的胆汁酸摄取；和/或
(b)当所给予的多肽在该对象中的血清浓度高于93nmol/L时，该多肽抑制该对象中NTCP介导的胆汁酸摄取。
19.如权利要求17或18所述的方法，其特征在于，给予该多肽后约20分钟，该多肽在对象中的血清浓度达到峰值浓度。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述峰值浓度为高于93nmol/L。
21.如权利要求16-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述对象患有代谢疾病或有患上代谢疾病的风险。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述代谢疾病涉及葡萄糖代谢失调。
23.如权利要求21或22所述的方法，其特征在于，所述代谢疾病是高血糖。
24.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其特征在于，所述代谢疾病是糖尿病。
25.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其特征在于，所述代谢疾病是肥胖。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽能降低所述对象中与代谢相关的一种或多种化学或生物分子的水平或活性，或使所述水平或活性稳定，其中，所述化学或生物分子选自：葡萄糖、胆固醇、甘油三酯、游离脂肪酸、氨基酸、激素、LDL-C、HDL-C、HbAlc、血尿素氮和矿物质。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽能降低所述对象的总胆固醇、甘油三酯和/或LDL-C水平。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽能降低所述对象的葡萄糖和/或HbA1c水平。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽能使所述对象的胰岛素水平稳定。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽能降低衡量代谢变化的一种或多种生理参数的水平或值，或使所述水平或值稳定，其中，所述一种或多种生理参数选自：血糖、血压、体重、脂肪量、体重指数(BMI)、炎症、动脉粥样硬化指数、心脏指数、肾脏指数、总脂肪指数和稳态模型评估(HOMA)指数。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其特征在于，所述对象患有心血管疾病(如动脉粥样硬化疾病)、心脏病或肾脏损伤，或有患上心血管疾病(如动脉粥样硬化疾病)、心脏病或肾脏损伤的风险。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其特征在于，所述对象患有代谢疾病，或有患上代谢疾病的风险，所述代谢疾病选自：高血糖症，低血糖症，高胰岛素血症，肥胖症，高脂血症，高甘油三酯血症，高胆固醇血症，心脏疾病，代谢综合症，动脉粥样硬化的疾病，冠心病，冠状动脉疾病，外周动脉疾病，心绞痛，脑血管疾病，急性冠状综合征，心肌梗塞，中风，心血管疾病，阿尔茨海默病，血脂异常，家族性复合高脂血症，家族性高甘油三酯血症，家族性高胆固醇血症，异型高胆固醇血症，同型高胆固醇血症，家族性载脂蛋白B-100缺陷，多基因性高胆固醇血症，残粒清除障碍病，肝脂酶缺乏症，以及暴饮暴食、甲状腺机能减退、雌激素和孕激素用药、β阻断剂和噻唑类利尿剂在内的药物引起的血脂异常，肾病综合征，慢性肾衰竭，库欣综合征(Cushing’s syndrome)，原发性胆汁性肝硬化，糖原贮积病，肝细胞瘤，胆汁郁积，肢端肥大症，胰岛瘤，单一性生长素缺乏症，肾脏损伤，肥胖，和酒精引起的高甘油三酯血症。
33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽含有HBV的pre-S1区域的氨基酸序列。
34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽含有HBV基因型A、B、C、D、E、F、G或H的pre-S1区域的氨基酸序列。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其特征在于，所述HBV是基因型C。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽含有HBV基因型C的pre-S1区域氨基酸序列13-59的序列。
37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽含有选自SEQ ID NO：21-40中任一所示的氨基酸序列。
38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽含有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽长度至少为20、25、30、35或40个氨基酸。
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽的一个或多个氨基酸残基缺失、被取代或插入。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述多肽的1-30、1-20、1-10、1-8、1-5或1-3个氨基酸残基缺失、被取代或插入。
42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽在其N末端和/或C末端含有来自HBV的pre-S1区域的天然侧接氨基酸序列。
43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述HBV的pre-S1区域的天然侧接氨基酸序列长1-10、1-8、1-5或1-3个氨基酸。
44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽与SEQ ID NO：21-40任一所示的氨基酸序列具有至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。
45.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽含有对应于HBV基因型C的pre-S1区域的氨基酸13的甘氨酸。
46.如权利要求1-45中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽含有对应于HBV基因型C的pre-S1区域的氨基酸20的天冬酰胺。
47.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽的N末端含有疏水基团修饰基团。
48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述疏水基团选自：肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、胆固醇和花生四烯酸。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述疏水基团是肉豆蔻酸。
50.如权利要求1-49中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽具有能使该多肽稳定的C末端修饰。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述C末端修饰是酰胺化(胺化)或异戊二醇化。
52.如权利要求1-51中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽含有SEQ ID NO：23，其中所述多肽还含有N末端肉豆蔻酸修饰和C末端胺化修饰，或其中所述多肽含有SEQ IDNO：3。
53.如权利要求1-52中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽能结合钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)。
54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述多肽能双向调节NTCP介导的胆汁酸向肝细胞的转运。
55.如权利要求54所述的方法，其特征在于，
(a)如果肝细胞与93nmol/L或以下浓度的所述多肽接触，则所述多肽提高NTCP介导的胆汁酸向肝细胞的转运；和/或
(b)如果肝细胞与高于93nmol/L的所述多肽接触，则所述多肽抑制NTCP介导的胆汁酸向肝细胞的转运。
56.如权利要求54所述的方法，其特征在于，
(a)当所给予的多肽在该对象中的血清浓度为500ng/ml或以下时，该多肽提高该对象中NTCP介导的胆汁酸摄取；和/或
(b)当所给予的多肽在该对象中的血清浓度高于500ng/ml时，该多肽抑制该对象中NTCP介导的胆汁酸摄取。
57.如权利要求1-56中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽或含该多肽的药物组合物与治疗有效量的至少一种第二药剂可以同时给予，或在该其他药剂给药之前或之后给予。
58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述第二药剂选自：抗高血脂药、抗高血糖药、抗糖尿病药、抗肥胖药和胆汁酸类似物。
59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述第二药剂选自：胰岛素、二甲双胍、西他列汀、考来维仑、格列甲嗪、辛伐他汀、阿伐他汀、依泽替米贝、非诺贝特、烟酸、奥利斯特、氯卡色林、苯丁胺、托吡酯、奥贝胆酸和熊脱氧胆酸。
60.如权利要求1-59中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽或含该多肽的药物组合物通过选自肠胃外、肺内、鼻内、病灶内、肌肉、静脉、动脉、腹膜内以及皮下的至少一种方式给予到所述对象。
61.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述多肽或含所述多肽的药物组合物皮下给予对象。
62.多肽或含所述多肽的药物组合物在制备治疗代谢疾病的药物中的用途，其中，所述多肽含有衍生自HBV的氨基酸序列；所述药剂含有一定量的用于给予针对代谢相关疾病对象的所述多肽，使得所给予的多肽的血清浓度使该多肽能双向调节该对象中NTCP介导的胆汁酸摄取。
63.多肽或含所述多肽的药物组合物在制备降低有需要的对象的血清脂质水平的药物中的用途，其中，所述多肽含有衍生自HBV的氨基酸序列；所述药剂含有一定量的给予有代谢疾病对象的所述多肽，使得所给予的多肽的血清浓度使该多肽能双向调节该对象中NTCP介导的胆汁酸摄取。
64.如权利要求63所述的用途，其特征在于，所述血清脂质包括选自胆固醇、甘三酯和LDL-C中的一种或多种脂质。
65.多肽或含所述多肽的药物组合物在制备降低代谢疾病的对象的血糖水平的药物中的用途，其中，所述多肽含有衍生自HBV的氨基酸序列。
66.如权利要求65所述的用途，其特征在于，所述药剂含有一定量的用于给予所述对象的所述多肽，使得所给予的多肽的血清浓度使该多肽能双向调节该对象中NTCP介导的胆汁酸摄取。
67.多肽或含所述多肽的药物组合物在制备用于权利要求1-61中任一项所述的方法中的药剂的用途。
68.多肽或含所述多肽的药物组合物，用于以一定的量给予代谢疾病的对象以治疗该对象的代谢疾病，其中，该量使得所给予多肽的血清浓度使该多肽能双向调节该对象中NTCP介导的胆汁酸摄取，其中，所述多肽含衍生自HBV的氨基酸序列。
69.多肽或含所述多肽的药物组合物，用于以一定的量给予代谢疾病的对象以降低该对象的血清脂质水平，其中，该量使得所给予多肽的血清浓度使该多肽能双向调节该对象中NTCP介导的胆汁酸摄取，其中，所述多肽含衍生自HBV的氨基酸序列。
70.如权利要求69所述的多肽含所述多肽的药物组合物，其特征在于，所述血清脂质包括选自胆固醇、甘三酯和LDL-C中的一种或多种脂质。
71.多肽或含所述多肽的药物组合物，用于降低代谢疾病的对象的血糖水平，其中，所述多肽含衍生自HBV的氨基酸序列。
72.多肽或含所述多肽的药物组合物，用于权利要求1-61中任一项所述的方法。
73.一种药物组合物，含有含衍生自HBV的氨基酸序列的多肽，其中，当给予代谢疾病的对象时，该药物组合物提供的多肽的血清浓度使该多肽能双向调节该对象中NTCP介导的胆汁酸摄取。
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