CN104781274A - 用于治疗肝脏疾病和心血管疾病的脂肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于脂肽的化合物，其用于诊断、预防和/或治疗肝脏疾病或病况，优选肝脏参与的代谢疾病，以及控制或改变胆固醇水平或胆固醇摄取，并且因此，诊断、预防和/或治疗心血管疾病。此外，本发明涉及用于测试或测量测试化合物的NTCP介导的转运的体外或体内测定或方法。此外，本发明涉及用于诊断、预防和/或治疗肝脏疾病或病况的方法，其包括将治疗有效量的基于脂肽的化合物施用于患者。此外，本发明涉及用于诊断、预防和/或治疗心血管疾病的方法。

Description

用于治疗肝脏疾病和心血管疾病的脂肽

本发明涉及基于脂肽的化合物，其用于诊断、预防和/或治疗肝脏疾病或病况，优选肝脏参与的代谢疾病，以及用于控制或改变胆固醇水平或胆固醇摄取，并且因此，诊断、预防和/或治疗心血管疾病。此外，本发明涉及用于测试或测量测试化合物的NTCP介导的转运的体外或体内测定或方法。此外，本发明涉及用于诊断、预防和/或治疗肝脏疾病或病况的方法，其包括将治疗有效量的基于脂肽的化合物施用于患者。此外，本发明涉及用于诊断、预防和/或治疗心血管疾病的方法。

发明背景

人乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒科的成员。嗜肝DNA病毒是最小的包膜DNA病毒，其经由pgRNA中间体的逆转录复制。在装配过程中，核衣壳获取称为大(L)、中(M)和小(S)的三种病毒包膜蛋白。它们被编码在一个开放阅读框中，并且共享对于膜锚定所需的S结构域。除了S-结构域以外，M含有55个氨基酸的N端亲水性延伸(preS2)，而L进一步延伸107、117或118个氨基酸(基因型依赖性)，被称为preS1 (Urban 2008)。丁型肝炎病毒(HDV)是利用HBV包膜蛋白用于进入肝细胞的卫星拟病毒。已知L的肉豆蔻酰化的preS1-结构域在HBV和HDV感染性中发挥关键作用。

本发明人先前已经鉴定了HBV L-蛋白衍生的脂肽，其阻断HBV和HDV感染PHH和HepaRG细胞(Gripon等人, 2005, Schulze等人, 2010, WO 2009/092611 A1)。它们代表了HBV的preS1-结构域的N端47个氨基酸(HBVpreS/2-48^myr)，并且包括天然存在的肉豆蔻酸修饰。

在WO 2009/092612和WO 2012/107579(其内容以其整体通过引用并入本文)中，发明人描述了HBV的疏水性修饰的preS-衍生肽及其作为媒介物用于将化合物特异性递送至肝脏的用途。

此外，发明人先前已经鉴定了负责这些HBV L-蛋白衍生脂肽的结合的受体，即牛磺胆酸钠协同转运多肽(NTCP/SLC10A1)。(美国临时申请61/725,144，2012年11月12日申请)。NTCP是整合性跨膜蛋白，在HepG2、HuH7中不表达，在DMSO处理后在HepaRG细胞中诱导(Kotani等人, 2012)，并且在去分化过程中在原代肝细胞中下调(Doring等人, 2012)。

具体而言，发明人已经鉴定了在乙型肝炎病毒(HBV)和/或丁型肝炎病毒(HDV)感染中发挥关键作用的新型HBV preS1-特异性受体，人牛磺胆酸钠协同转运多肽NTCP/SLC10A1。该受体或某些非人对应物的表达允许将先前不能结合HBV和/或HDV和/或不易受HBV和/或HDV感染的细胞转化为能够结合HBV和/或HDV和/或易受HBV和/或HDV感染的细胞。已经易受HBV和/或HDV感染的细胞(HepaRG细胞)显示NTCP表达后显著增加的易感性。

此外，Yan等人(2012)将NTCP/SLC10A1鉴定为原代树鼩肝细胞(PTH)中的preS-特异性受体，并且表明人(h) NTCP促进HBV/HDV进入肝细胞瘤细胞。

肝脏在药物生物转化和从身体处置中发挥主要作用。鉴于其在胃肠道和全身血液之间的屏障功能，其恒定暴露于进入门静脉循环的摄取的外源性物质。药物诱导的肝损伤占自愿向药物警戒登记(pharmacovigilance registries)报告的所有不良药物反应的报告的高达7％。药物引起对肝细胞、胆管或血管结构的直接损害，或者可干扰胆汁流。通常遇到的表型因此包括肝炎、胆汁淤积、脂肪变性、肝硬化、血管和肿瘤性病变和甚至暴发性肝衰竭。几乎每种药物都具有引起肝损伤的潜能，其通过药剂的直接毒性或通过个体的特质反应。肝脏对药物损伤的敏感性受各种因素诸如年龄、性别、怀孕、组合用药、肾功能和遗传因素的影响(Kullak-Ublick, 2000)。

药物诱导的胆汁淤积性肝病是肝损伤的一种亚型，其特征在于继发于施用肝毒性剂的碱性磷酸酶和胆红素的主要升高。它本身可以表现为胆汁淤积性肝炎或温和性胆汁淤积(bland cholestasis)，这取决于病原体和损伤机制。通常引起胆汁淤积与肝炎的药物包括精神药物、抗生素和非甾体抗炎药(NSAID)。该机制是免疫过敏的，并且由超敏反应导致。使用避孕药和17α-烷基化雄激素类固醇最经常观察到无肝炎的纯胆汁淤积，并且所述机制最可能涉及干扰胆汁盐、有机阴离子和磷脂的肝细胞小管外排系统。胆汁形成的限速步骤被认为是胆汁盐穿过小管肝细胞膜的胆汁盐输出泵(BSEP)介导的转位。环孢霉素A、曲格列酮、波生坦、利福平和性类固醇的代谢产物对BSEP功能的抑制是药物诱导的胆汁淤积的一个重要原因(Kullak-Ublick, 2000)。

本领域需要用于治疗肝脏参与的代谢疾病、药物诱导的毒性和胆汁淤积性肝病以及心血管疾病的改进的手段和方法。

发明概述

根据本发明，该目标通过提供用于诊断、预防和/或治疗肝脏疾病或病况的基于脂肽的化合物来解决，其中所述肝脏疾病或病况与化合物向肝细胞的牛磺胆酸钠协同转运多肽(NTCP)介导的转运相关。

根据本发明，该目标通过提供用于诊断、预防和/或治疗心血管疾病的基于脂肽的化合物来解决。

根据本发明，该目标通过用于测试或测量一种或多种测试化合物的NTCP介导的转运的体外或体内测定或方法来解决，所述测定或方法包括以下步骤：

(a) 提供一种或多种测试化合物和如本发明中定义的基于脂肽的化合物；

(b) 提供用于功能性和选择性NTCP表达的测试系统；

(c) 与基于脂肽的化合物或不与基于脂肽的化合物一同将一种或多种测试化合物添加至(b)的NTCP测试系统；

(d) 通过比较各自有添加或无添加基于脂肽的化合物情况下步骤(b)和(c)的结果确定所述测试化合物是否经由NTCP转运，

其中，当测试化合物减少、阻断或抑制通过NTCP的胆汁盐转运（竞争性转运）时，或者当所述化合物的转运可以通过添加基于脂肽的化合物而减少、阻断或抑制时，所述化合物被认为是经由NTCP转运。

根据本发明，该目标通过用于诊断、预防和/或治疗肝脏疾病或病况的方法来解决，

其中所述肝脏疾病或病况与化合物向肝细胞的牛磺胆酸钠协同转运多肽(NTCP)介导的转运相关，

所述方法包括将治疗有效量的基于脂肽的化合物施用于患者。

根据本发明，该目标通过用于诊断、预防和/或治疗心血管疾病的方法来解决。

根据本发明，该目标通过用于控制或改变胆固醇水平或胆固醇摄取的方法来解决，所述方法包括将治疗有效量的基于脂肽的化合物施用于患者。

本发明的优选实施方案的描述

在以下更详细地描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文中描述的具体方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应当理解，本文中所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并且不旨在限定将仅由所附权利要求限定的本发明的范围。除非另有说明，否则本文中所用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。出于本发明的目的，本文中引用的所有参考文献均以其整体通过引用并入本文。

浓度、量和其他数值数据在本文中可以范围形式表达或呈现。应当理解的是，此类范围形式仅仅出于方便和简洁而使用，并且因此应当灵活地解释以不仅包括作为范围的限值明确记载的数值，而且包括该范围内涵盖的所有个别数值或子范围，如同每个数值和子范围被明确地记载。作为举例说明，“至少4个氨基酸，优选4至19”的数值范围应当被解释为不仅包括4至19的明确记载的值，而且包括所示范围内的个别值和子范围。因此，该数值范围内包括的是个别值，诸如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，和子范围诸如4至10、6至15、10至19、8至19和15至19等。作为举例说明，“至少1个氨基酸，优选1至78”的数值范围应当被解释为不仅包括1至78的明确记载的值，而且包括所示范围内的个别值和子范围。因此，该数值范围内包括的是个别值，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 … 75、76、77、78，和子范围诸如10至50、15至40、8至35、30至50和20至40等。该相同原则适用于仅记载一个数值的范围。此外，此类解释应当适用，而不论范围的宽度或所述特征。

脂肽在肝脏疾病的治疗中的用途

如上所讨论，本发明提供用于诊断、预防和/或治疗肝脏疾病或病况的基于脂肽的化合物。

所述肝脏疾病或病况与化合物向肝细胞的牛磺胆酸钠协同转运多肽(NTCP)介导的转运相关。

优选地，所述与化合物向肝细胞的NTCP介导的转运相关的肝脏疾病或病况是选自以下的肝脏参与的代谢疾病

肝内胆汁淤积，

肝脏(通过肝脏毒素)的中毒/肝毒性，

药物诱导的胆汁淤积性肝病，

高脂血症。

- 基于脂肽的化合物

基于脂肽的化合物优选包含：

　　(a) 肽或氨基酸序列，

　　(b) 疏水性或脂质修饰，优选在肽(a)处，

　　(c) 任选地，一个或多个进一步部分。

优选地，肽或氨基酸序列(a)具有或包含通式

X - P - Y

其中

P是氨基酸序列NPLGFXaaP             SEQ. ID NO: 1,

　　(单字母氨基酸代码)

　　其中Xaa是任意氨基酸；优选F或L，更优选F

　　(因此，P优选为NPLGFFP或NPLGFLP)；

X是具有m个氨基酸长度的氨基酸序列，

　　其中m为至少4；

Y是具有n个氨基酸长度的氨基酸序列，

　　其中n为0或至少1；

并且其中m + n ≥ 11。

肽或氨基酸序列(a) (具有通式X-P-Y)优选衍生自乙型肝炎病毒(HBV)的preS结构域(也称为“preS-肽”)。HBV的包膜包封三种蛋白，其被称为L(大)、M(中)和S(小)。它们共有具有四个跨膜区的C端S结构域。M蛋白和L蛋白携带55个氨基酸和依赖于基因型的107或 118个氨基酸(preS2和preS1)的额外N端延伸。

肽或氨基酸序列(a)是指这样的肽，其具有对应于或基于HBV的L蛋 白N端延伸(preS1)的氨基酸序列(优选基因型A至H以及绒毛猴 (WMHBV)、猩猩(orangutan)、黑猩猩(chimpanzee)和大猩猩(gorilla)乙型肝炎病毒的L蛋 白N端延伸(preS1)的氨基酸序列)，但还指其变体，优选地为C端截短变体、氨基酸取代变体。

作为不可缺少或基本的序列，对于本发明的基于脂肽的化合物结合至NTCP重要的氨基酸残基(如SEQ ID NO:l (NPLGFXaaP)所示)存在于本发明的基于脂肽的化合物的肽/氨基酸序列(a)中。

具体而言，所述肽基于以下序列(单字母代码的氨基酸；加下划线的必需结构域)。

必需结构域　　　(SEQ ID NO: l):

 (其中X或Xaa为任意氨基酸，优选F或L，更优选F)

还存在HBV preS共有序列(对于氨基酸位置(-11)至48)

(SEQ ID NO: 14 ):

“变体”优选地为SEQ ID NO:2-14的序列的N端和/或C端截短变体、氨基酸取代或缺失变体或者延长变体，其携带疏水性修饰，且其中，任选地，一个或多个进一步部分与必需结构域的N端或C端的一个或多个氨基酸偶联。变体还包含含有经修饰氨基酸、非天然氨基酸或肽模拟物或可模拟肽骨架/结构的其他化合物的氨基酸序列。优选地，变体选自SEQ ID NO:2至14的C端截短变体；氨基酸取代或缺失变体；包含经修饰氨基酸、非天然氨基酸或肽模拟物或可模拟肽骨架/结构的其他化合物的变体。

此外，肽或氨基酸序列优选为L-氨基酸序列，而且还可以包含D-氨基酸或者是D-氨基酸序列。

根据本发明，基于脂肽的化合物的肽包含至少具有SEQ ID NO:1的序列的氨基酸，并且可以由上述SEQ ID NO:2至14的18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118 或119个氨基酸或其变体组成。

N端和/或C端截短变体包含SEQ ID NO:2至14的优选至少18个连续氨基酸、更优选至少19个连续氨基酸、甚至更优选至少20 个和刚刚甚至更优选至少21个连续氨基酸，或其变体。

具有m个氨基酸的长度的肽的N端序列X包含至少4 个氨基酸(即m为至少4)。优选地，N端序列X可以由4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、或19个氨基酸组成。即，m可以是4至19。

在一个实施方案中，X的一个或多个氨基酸在侧链中具有氨基，所述氨基酸优选地选自赖氨酸、α-氨基甘氨酸、α,γ-二氨基丁酸、鸟氨酸、α,β-二氨基丙酸，更优选赖氨酸。侧链中具有氨基的X的一个或多个氨基酸优选地位于X的N端，其中一至十一(1-11)个、优选一至三(1 - 3)个侧链中具有氨基的氨基酸位于X的N端。

在一个实施方案中，N端序列X优选地包含序列NX₁SX₂X₃ (SEQ ID NO: 15)，其中X₁、X₂和X₃可以是任意氨基酸。优选地，SEQ ID NO: 15的X₁是L、I或Q，更优选L。优选地，SEQ ID NO: 15的X₂是T、V、A或不存在，优选T或V，更优选T。优选地，SEQ ID NO: 15的X₃ 是P、S、T或F，更优选P或S，甚至更优选S。优选地，序列NX₁SX₂X₃ (SEQ ID NO: 15)直接与氨基酸序列P (SEQ. ID NO: 1; NPLGFXaaP)的N端连接，导致产生包含序列NX₁SX₂X₃NPLGFXaaP的肽，其 中X₁、X₂、X₃和Xaa如上所定义。

具有n个氨基酸的长度的肽的C端序列Y包含0个或至少1个氨基酸(即n = 0 或n 为至少1)。优选地，C端序列Y可以由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92 或93个氨基酸组成。即，n可以是0至93。

在一个实施方案中，C端序列Y由至少4个氨基酸组成(即n为至少4)，其优选地具有序列X₄HQLDP (SEQ ID NO: 16)，其中 X₄是任意氨基酸。优选地，SEQ ID NO: 16的X₄为D、E或S，更优选D 或E，甚至更优选D。优选地，序列X₄HQLDP (SEQ ID NO: 16)直接与氨基酸序列P(SEQ. ID NO: 1; NPLGFXaaP)的C端连接，产生包含序列NPLGFXaaPX₄HQLDP的肽，其中X₄和Xaa如上所定义。

在一个优选的实施方案中，本发明的基于肽脂的化合物的肽包含由氨基酸序列 NX₁SX₂X₃NPLGFXaaP X₄HQLDP (SEQ ID NO: 17)编码的肽，其中X₁、X₂、X₃、X₄和Xaa如上所定义。

术语“变体”还指在嗜肝DNA病毒属(hepadnavirus genus)的不同病毒种、毒株或亚型(诸如HBV毒株α、HBV毒株LSH(黑猩猩分离株)、绒毛猴HBV(WMHBV)或选自HBV基因型A至H的毒株)中发现的同源序列(参见SEQ ID NO: 2-13)。

术语“变体”还指这样的同源序列，其与包含不变NPLGFXaaP结构域和SEQ ID NO. 2-14的邻接序列的氨基酸序列或本文中公开的任何其他氨基酸序列显示出至少50％、优选70％、更优选80％、甚至更优选90％或 95％的序列同一性。

因此，根据本发明的优选的肽/氨基酸序列(a)包含具有不同病毒种、毒株或亚型(优选HBV或绒毛猴HBV(WMHBV)或者其变体的基因型)的氨基酸序列的SEQ ID NOs. 2至14的变体。

SEQ ID NOS. 2至14的“变体”还包含这样的变体或“类似物”，其包含氨基酸缺失、氨基酸取代(诸如用其他氨基酸或等构物(isostere)(与蛋白氨基酸具有紧密的结构和空间相似性的经修饰氨基酸)的保守性或非保守性替代)、氨基酸添加或等构物添加，只要所述序列仍结合NTCP。

保守性氨基酸取代通常涉及相同类别氨基酸间的取代。这些类别包括，例如

- 具有不带电荷的极性侧链的氨基酸，诸如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；

- 具有碱性侧链的氨基酸，诸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；

- 具有酸性侧链的氨基酸，诸如天冬氨酸和谷氨酸；和

- 具有非极性侧链的氨基酸，诸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸。

如上所讨论，肽或氨基酸序列(a)优选为L-氨基酸序列，而且还可以包含D-氨基酸或者是D-氨基酸序列。

优选地，肽或氨基酸序列(a)，X - P - Y选自包含选自以下的氨基酸序列的肽

SEQ ID NO. 18　　　　　　HBV preS/2-48 (基因型C)，

SEQ ID NO. 19　　　　　　HBV preS/2-48 (基因型D)，

SEQ ID NO. 20　　　　　　HBV preS/2-48 (共有)，或

与上述序列具有至少90％序列同一性(优选至少95％或99％同一性)的氨基酸序列

及其变体。

在该实施方案中，m = 7且n = 33 (m + n = 40)，导致产生47个氨基酸的肽或氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，所述脂肽是Myrcludex B：

(a) 具有SEQ ID NO. 18的HBV preS/2-48 (基因型C)的氨基酸序列。

根据本发明的基于脂肽的化合物优选包含：

(b) 疏水性或脂质修饰，优选在肽(a)处。

优选地，所述肽包含疏水性或脂质修饰(b)，诸如在N端、C端或在氨基酸侧链处。

在一个实施方案中，所述肽用至少一个疏水性部分或基团修饰。在本发明的优选实施方案中，所述肽用1、2、3、4个或更多个疏水性部分或基团修饰。即，所述肽可以用多于一个(诸如2个)疏水性部分或基团修饰。疏水性部分或基团可以是彼此相同或不同的。

疏水性修饰优选选自：酰化和/或添加疏水性部分。

优选地，所述肽包含N或C端的疏水性修饰(b)。

N端疏水性修饰是优选的。

“N端”是指肽的N端，因此在具有通式X-P-Y的肽中，它是指X的N端，即相应的第一氨基酸残基，但还包含紧邻N端的疏水性修饰，诸如相应的氨基酸残基(-4)、(-3)、(-2)、(-1)、1、2或3或4。因此，还可通过在与X的N端接近的位点处连接疏水性部分来获得疏水性修饰的偶联。

根据本发明的基于脂肽的化合物的疏水性修饰添加疏水性部分，优选添加至肽/氨基酸序列。

酰化优选地选自用羧酸、脂肪酸、具有亲脂性侧链的氨基酸的酰化。优选的脂肪酸是饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸、支链或非支链脂肪酸，优选地具有8至22个碳原子(C8至C22)。更优选地，通过酰化的疏水性修饰选自用肉豆蔻酰基(C14)、棕榈酰基(C16)或硬脂酰基(C18)的酰化。在体内和医学应用中由于其较高的安全性(例如，不显示硬脂酰基的不利作用(先天免疫应答等))而优选通过肉豆蔻酰化的修饰。

疏水性部分的添加优选地选自添加胆固醇、胆固醇衍生物、磷脂、糖脂、甘油酯、类固醇、神经酰胺、异戊二烯衍生物、金刚烷、法呢醇、脂肪族基团、聚芳族化合物、油酸、胆汁盐或胆汁盐缀合物，更优选油酸、胆固醇、胆汁盐或胆汁盐缀合物。疏水性部分的连接优选地通过共价结合，其可经由氨基甲酸酯、酰胺、醚、二硫化物或本领域技术人员的技术之内的任何其他连接来实现。

因此，所述肽/氨基酸序列(a)优选为疏水性修饰的，优选酰化的，并且因此，由于它们的亲脂性或疏水性基团/部分，优选为脂肽。

在一个实施方案中，肽或氨基酸序列(a)具有或包含通式

X - P - Y - R_o

其中P、X和Y如上定义，并且

R是所述疏水性修饰的肽的C端修饰，

　　其优选为保护免于降解的部分，所述部分选自酰胺、D-氨基酸、经修饰氨基酸、环状氨基酸、白蛋白、天然和合成的聚合物，诸如PEG、聚糖(glycane)，

o为0或至少1。

Y的C端修饰(R)优选为用保护免受降解(例如，体内降解)的部分进行的修饰。

“C端”是指C端(即，相应的最后一个氨基酸残基)处的修饰，但还包含紧邻C端(诸如倒数第二个氨基酸残基、倒数第三个或更多个氨基酸残基)的修饰(例如，引入保护载体免于酶促降解(例如通过羧肽酶的作用)的一个D-氨基酸)。本领域技术人员将能够根据相应的应用选择相应合适的部分。优选的保护免于降解的部分选自酰胺、D-氨基酸、经修饰氨基酸、环状氨基酸、白蛋白、天然和合成聚合物诸如PEG、聚糖。此外，o为0或者至少1，即C端修饰(R)是任选的。优选地，o 为1。在本发明的进一步实施方案中，o为1、2、3、4或更多。即，可以用多于一个部分或基团(诸如，2个)修饰C端或其邻近部分。所述部分或基团可以彼此相同或不同。

在一个实施方案中，优选的C端修饰是酰胺。

在本发明的一个实施方案中，疏水性修饰和/或R经由接头或间隔区与肽连接。接头或间隔区是本领域技术人员已知的，诸如聚丙氨酸、聚甘氨酸(polyglycin)、碳水化合物、(CHa)n基团。因此，技术人员将能够根据相应的应用选择相应合适的一种或多种接头或间隔区。

在一个优选的实施方案中，所述脂肽是Myrcludex B，其具有

(a) SEQ ID NO. 18的HBV preS/2-48 (基因型C)的氨基酸序列；

(b) N端肉豆蔻酰化

(c) C端酰胺。

在一个实施方案中，根据本发明的基于脂肽的化合物包含

(c) 一个或多个进一步部分。

此类进一步部分可以是

　　一种或多种药物或它们各自的前药；

　　一种或多种标签；

　　一种或多种标记，诸如一种或多种荧光染料、一种或多种放射性同位素和一种或多种造影剂；

　　一种或多种重组病毒或其衍生物；

　　药物、前药或标记的载体或一种或多种储库(depot)；

　　一种或多种免疫原性表位；

　　激素(肽激素、类固醇激素、单胺、氨基酸衍生物，类二十烷酸)。

在一个实施方案中，一个或多个进一步部分共价连接至脂肽化合物(优选肽)，诸如经由接头、间隔区和/或一个或多个锚定基团。

基于脂肽的化合物可以进一步含有一个或多个锚定基团，其可以作为进一步部分(诸如化合物、标签、标记)的额外附接点，并且可以位于Y的氨基酸处。

锚定基团可以在氨基酸侧链处，或者可以是氨基酸侧链本身，即锚定基团可以是侧链本身或经修饰的侧链。锚定基团还可以是引入脂肽的氨基酸序列以充当锚定基团的经修饰的氨基酸残基。在本发明的其他实施方案中，锚定基团A与疏水性修饰和/或C端修饰R连接。

优选的锚定基团选自酯、醚、二硫化物、酰胺、硫醇、硫酯。技术人员将能够根据待连接的相应的进一步部分来选择相应合适的锚定基团。锚定基团还可适合用于连接复合物形成组分(complex-forming component)，诸如生物素/亲和素、聚精氨酸/寡核苷酸(例如siRNA)复合物。在一些实施方案中，存在多于一个锚定基团，诸如2个、3个、4个或更多个，诸如2 个。锚定基团可以彼此相同或不同，以允许连接几个进一步部分。

在一个实施方案中，一个或多个进一步部分是一种或多种造影剂，其经由螯合剂偶联。

由此，造影剂以与螯合剂的复合物的形式结合/偶联，所述螯合剂能够与各自的造影剂形成复合物。

此类螯合剂可以是1,4,7, 10-四氮杂环十二烷-N,N',N,N'-四乙酸(DOTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、三亚乙基四胺(TETA)、亚氨基二乙酸、二亚乙基三胺-N,N,N',N',N"-五乙酸(DTP A)和6-肼基吡啶-3-羧酸(HYNIC)，诸如优选DOTA。

造影剂的实例是顺磁性剂，例如Gd、Eu、W和Mn，优选地与螯合剂络合。进一步选择是超磁性铁(Fe)络合物和颗粒、含有高原子序数的原子的化合物(即用于计算机断层摄影(CT)的碘)、微泡(诸如用于对比度增强超声(CEUS??))和载体，诸如含有这些造影剂的脂质体。

可通过本领域技术人员易知的多种程序来制备本发明的肽，通常通过合成化学程序和/或遗传工程改造程序。合成化学程序更具体地包括固相顺序和嵌段合成。从WO 2009/092612可获得更多细节。

- NTCP

也称为钠/Na⁺-牛磺胆酸盐协同转运多肽(NTCP)的钠/胆汁酸协同转运蛋白是在人中由SLC10A1 (溶质载体家族10成员1)基因编码的蛋白。

钠/胆汁酸协同转运蛋白是参与胆汁酸的肠肝循环的整合膜糖蛋白。两种同源转运蛋白参与胆汁酸的重吸收，一种从肠腔、胆管和肾脏吸收，其具有顶部定位(SLC10A2)，另一种钠依赖性的协同转运蛋白在肝细胞的基底外侧膜中发现(SLC10A1)。

胆汁形成是肝脏的一种重要功能。胆汁盐是胆汁的主要成分，并且由肝细胞分泌到胆汁中且递送至小肠，在那里它们协助脂肪消化。在肝脏中，肝细胞摄取胆汁盐(主要经由NTCP)，并且将它们再次分泌到胆汁中(主要经由胆汁盐输出泵(BSEP))用于正在进行的肠肝循环。胆汁盐摄取到肝细胞中主要以钠依赖性方式通过牛磺胆酸钠协同转运多肽NTCP发生。NTCP的转运特性已经充分表征。它是转运蛋白的溶质载体家族的一个产电(electrogenic)成员(SLC10A1)且主要转运胆汁盐和硫酸化的化合物，而且还能够介导额外底物诸如甲状腺激素、药物和毒素的转运。其在生理和病理生理条件下受高度调节。NTCP的调节处理向肝细胞的胆汁盐负载的变化，并且防止肝脏疾病过程中细胞毒性量的胆汁盐的进入。

对于胆汁盐转运蛋白的综述，还参见Trauner和Boyer (2003)。

对于NTCP，可以检测到大范围的底物，其转运未缀合以及牛磺酸-缀合和甘氨酸-缀合的胆汁酸(Hagenbuch & Meier, 1994)，还有硫酸化的胆汁酸和，与顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白(ASBT)相反，还有类固醇硫酸盐(Craddock等人 1998; Kramer等人, 1999; Schroeder等人 1998)，和甲状腺激素(Friesema等人, 1999)。药物如瑞舒伐他汀(Ho等人, 2006)和米卡芬净(Yanni等人, 2010)也已经显示对NTCP具有亲和力。最近的数据显示被鉴定为NTCP的抑制剂的FDA批准的药物(Dong等人, 2013)。它们中的大多数是抗真菌药、抗高血脂药(辛伐他汀)、抗高血压药、抗炎药或糖皮质激素药物。

优选地，经由NTCP转运到肝细胞中的化合物是

　　- 胆汁酸类

　　　　诸如胆酸盐

　　　　牛磺酸-或甘氨酸-缀合的胆汁酸及其盐

　　　　　　(牛磺酸-或甘氨酸缀合的二羟基和三羟基胆汁盐)

　　　　　　诸如

　　　　　　牛磺胆酸盐

　　　　　　甘氨胆酸盐

　　　　　　牛磺脱氧胆酸盐

　　　　　　牛磺鹅脱氧胆酸盐

　　　　　　牛磺熊脱氧胆酸盐

　　　　硫酸化的胆汁酸及其盐

　　- 类固醇类

　　　　类固醇硫酸盐

　　　　　　雌激素缀合物(例如雌酮-3-硫酸盐，17α-炔雌醇-3-O-硫酸盐)

　　　　　　脱氢表雄酮硫酸盐

　　- 缀合和未缀合的甲状腺激素

　　- 肝毒素

　　- 共价结合至牛磺胆酸盐的化合物(例如，苯丁酸氮芥-牛磺胆酸盐)

　　- 溴磺酚酞(bromosulphophthalein)

　　- 药物

　　　　诸如

　　　　抗真菌药(例如米卡芬净)

　　　　抗高血脂药(例如辛伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀)

　　　　抗高血压药，

　　　　抗炎药，或

　　　　糖皮质激素药物。

优选地，所述与化合物向肝细胞的NTCP介导的转运相关的肝脏疾病或病况是选自以下的肝脏参与的代谢疾病

　　肝内胆汁淤积，

　　肝脏(通过肝脏毒素)的中毒/肝毒性，

　　药物诱导的胆汁淤积性肝病，

　　高脂血症，

　　肝后胆汁淤积。

当本文中使用时，“肝脏参与的代谢疾病”是指受脂质和胆汁酸的肝脏代谢影响的代谢病症，包括内脏性肥胖、糖尿病和血脂异常。

通常，“胆汁淤积”是其中胆汁成分不能从肝细胞分泌到胆系或者其中胆汁不能从肝脏流向十二指肠、导致肝细胞内肝细胞胆汁酸积累的病况。

当本文中使用时，“胆汁淤积”或“肝内胆汁淤积”是指与小管膜中胆汁盐泵(如BSEP或MRP)的表达不足和/或活性不足相关的肝细胞胆汁酸积累的肝内毒性作用。

当本文中使用时，“肝后胆汁淤积”是指由于大胆管阻塞导致的胆汁淤积性肝病。

当本文中使用时，“肝脏的中毒”或“肝毒性”或“毒性肝脏疾病”是指不依赖于胆汁酸积累的药物的毒性作用。这些药物经由NTCP介导的转运穿透肝细胞，并且通过破坏线粒体或通过活化细胞色素P-450系统中的酶(导致氧化应激)而引起几种直接的毒性作用。

当本文中使用时，“药物诱导的胆汁淤积性肝病”是指由于对胆汁盐输出泵(BSEP)的药物作用导致的胆汁酸从肝细胞的输出的抑制。

药物诱导的胆汁淤积可以由几种抑制BSEP的药物引起，所述药物诸如利福平、环孢霉素A、利福霉素SV、波生坦、曲格列酮、依托红霉素和格列本脲(Fattinger等人, 2001; Funk等人, 2001; Funk等人, 2001; Stieger等人, 2000; Dawson等人, 2012; Morgan等人, 2010; Ogimura等人, 2011)。BSEP是转运蛋白的ATP结合盒(ABC)家族的一个成员(BSEP也被鉴定为ABCB11)，并且其参与胆汁酸输出肝细胞的过程，因此降低其对这些细胞的毒性。上述药物引起过量胆汁酸积累的毒性作用，因为胆汁酸经由BSEP的分泌被失效。经由基于脂肽的化合物(诸如MyrB)和NTCP对NTCP介导的胆汁酸摄取的抑制抵消BSEP抑制，并且从而防止肝毒性或适合用于治疗和/或诊断。

“高脂血症”(或高脂蛋白血症，或高脂血症)涉及血液中的任何或所有脂质和/或脂蛋白的异常升高的水平。

高脂血症被分为原发性和继发性亚型。原发性高脂血症通常是由于遗传原因(诸如受体蛋白中的突变)，而继发性高脂血症则由于其他潜在原因诸如糖尿病而产生。脂质和脂蛋白异常在一般群体中常见，并且被认为是由于它们对动脉粥样硬化的影响而导致的心血管疾病的一个可改变的风险因素。

“高胆固醇血症”(或高胆固醇血症)是血液中存在高水平的胆固醇。它是“高脂血症”的一种形式。

当本文中使用时，“高脂血症”优选是指高胆固醇血症，其包括升高的LDL胆固醇、降低的HDL胆固醇、升高的甘油三酯、导致高血压的动脉阻塞、心血管疾病(CVD)、心脏病发作和中风。

优选地，NTCP介导的转运被基于脂肽的化合物减少或阻断。

本发明人已发现，脂肽MyrB干扰NTCP介导的胆汁盐转运。具体而言，MyrB抑制NTCP介导的胆汁盐转运。

由此，转运蛋白失活的K_i(rNTCP的K_i ~ 4nM)相比于对于HBV/HDV感染抑制观察到的IC₅₀(80 pM)高得多，这与以下发现一致：HBV感染在低于饱和受体的浓度可已被阻断(Schulze等人, 2010)。一个合理的解释是以下假设：类似于其他病毒，L蛋白/hNTCP复合物必须多聚化。MyrB与单个亚基的结合可以废除病毒进入，而底物转运可以继续。该假设得到证明NTCP的寡聚化的报道支持(Doring等人, 2012)。

优选地，基于脂肽的化合物以治疗有效量施用。

本发明的基于脂肽的化合物的“治疗有效量”是指足以阻断或抑制NTCP介导的胆汁盐转运的量。

本发明的基于脂肽的化合物的“治疗有效量”进一步指足以诊断、预防和/或治疗各肝脏疾病或病症的量。优选的治疗有效量取决于待递送的各化合物和其各自的治疗潜力。

基于脂肽的化合物优选以使得在目标部位、即NTCP部位(肝细胞)达到约1至10 nM的K_i的浓度使用。

具体而言，为了抑制底物转运，基于脂肽的化合物优选以使得目标部位的浓度高于约1至10 nM的K_i的剂量使用。

在约10 nM的使用的基于脂肽的化合物的IC₅₀值的情况下，优选的治疗有效量为约100 μg/kg体重或1至5 mg/患者的范围内。1至5 mg/患者的范围内的优选的治疗有效量可以每日一次或在其他实施方案中，每2-3天仅一次施用，这取决于使用的化合物的稳定性和代谢和NTCP/化合物的复合物的周转(turnover)。

治疗有效量优选为以下范围内的每日剂量或每日施用

- 约0.1 mg至约50 mg/患者，即约0.0014 mg/kg体重至约0.7 mg/kg体重，

- 优选地，约1 mg至约20 mg/患者，即约0.014 mg/kg体重至约0.28 mg/kg体重。

技术人员将能够确定合适的治疗有效量。

优选地，本发明的施用或应用途径选自皮下、静脉内、口服??、鼻内、肌内、经皮、吸入、通过栓剂。

用于鼻内施用或应用的优选实施方案是鼻内喷雾。

在一个实施方案中，本发明的基于脂肽的化合物溶解于来自患者的血清中，并且经由注射应用。

优选的治疗有效量取决于各自的应用和抑制、诊断、预防和/或治疗的期望结果。

基于脂肽的化合物可以包含以下的药物组合物的形式施用/应用：

- 至少一种如本文上述定义的基于脂肽的化合物；

和

-任选地药学上可接受的载体和/或赋形剂。

此类药物组合物非常适合用于本文中描述的所有用途和方法。

“药学上可接受的载体或赋形剂”指任何媒介物，可在其中配制或与其配制所述药物组合物。其包括盐水溶液，诸如磷酸盐缓冲盐水。通常，基于施用模式和途径和标准药物实践选择稀释剂或载体。

用于控制胆固醇水平和心血管疾病的脂肽

如上所讨论，本发明提供用于控制或改变胆固醇水平或胆固醇摄取的基于脂肽的化合物。

胆固醇水平或摄取通过经由如本申请中定义的基于脂肽的化合物降低或阻断NCTP介导的胆汁盐转运而控制或改变。

如上所讨论，本发明提供用于诊断、预防和/或治疗心血管疾病(CVD)的基于脂肽的化合物。

所述使用包括控制或改变胆固醇水平或胆固醇摄取，其中胆固醇水平或摄取通过经由如本申请中定义的基于脂肽的化合物降低或阻断NCTP介导的胆汁盐转运而控制或改变。

心血管疾病(CVD)是西方世界中的发病率和死亡率的主要原因。高胆固醇水平已作为风险因素之一与CVD相关。临床上特别重要的是在冠状动脉中胆固醇和富含胆固醇的脂蛋白的异常沉积。此类沉积，最终导致动脉粥样硬化，是冠状动脉疾病的主导促成因素。在这种情况下，CVD的防治关键取决于降脂治疗。不同类型的药物可用于该目的，诸如他汀类、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸树脂、贝特类和烟酸，其通过经由不同途径降低胆固醇的水平而起作用(Schmitz & Langmann, 2006)。这些药物具有几种副作用，并且依赖于对心血管药物起作用的的代谢酶和转运蛋白的相对水平。

胆固醇代谢的主要控制由作为胆固醇体内平衡的重要调节剂的胆汁酸引起。胆汁酸和胆固醇的水平由胆固醇代谢和吸收的调节联系起来。胆汁酸的合成是哺乳动物中胆固醇代谢的主要途径，因为胆固醇利用的最终产品是胆汁酸。胆汁酸合成的主要途径通过经由胆固醇7α羟化酶(CYP7A1)的作用在胆固醇的7位羟基化而起始。

这意味着，胆汁酸的合成是过量胆固醇的分泌的主要机制之一。在生理条件下，该调节不足以补偿胆固醇的过量摄入。然而，如果阻断胆汁酸摄取进入肝细胞，则胆固醇以胆汁酸的形式的分泌将足以补偿胆固醇的过量膳食摄入。经由根据本发明的基于脂肽的化合物和NTCP阻断胆汁酸摄取导致胆汁酸的细胞内缺陷，这通过增加的胆固醇代谢和吸收补偿。

因此，根据本发明，基于脂肽的化合物适用于降脂治疗以预防CVD。

测试化合物的NTCP介导的转运的测定

如上所讨论，本发明提供用于测试或测量测试化合物的NTCP介导的转运的体外和体内测定或方法。

所述体外和体内测定或方法包括以下步骤

(a) 提供一种或多种测试化合物和如本文中定义的基于脂肽的化合物；

(b) 提供用于功能性和选择性NTCP表达的测试系统，其包括测量通过NTCP的胆汁酸转运；

(c) 与基于脂肽的化合物或不与基于脂肽的化合物一同将测试化合物添加至(b)的NTCP测试系统；

(d) 通过比较各自有添加或无添加基于脂肽的化合物情况下步骤(b)和(c)的结果确定所述测试化合物是否经由NTCP转运，

其中，当测试化合物减少、阻断或抑制通过NTCP的胆汁盐转运（竞争性转运）时，或者当所述化合物的转运可以通过添加基于脂肽的化合物而减少、阻断或抑制时，所述化合物被认为是经由NTCP转运。

技术人员将能够确定和应用合适的测试系统或测试模型。

此类合适的测试系统包括功能性和选择性的NTCP表达，从而功能性的NTCP转运，其可以被本发明的基于脂肽的化合物(诸如MyrB)选择性地阻断/抑制。其可以是以下中的一者或多者：

- 表达功能性NTCP的转基因细胞系，

- 表达功能性NTCP的转基因动物。

合适的体外测试系统或测试模型的实例是：

- 用编码NTCP的慢病毒稳定转导的肝细胞和肝细胞瘤细胞系，如实施例中描述和如2012年11月12日申请的美国临时申请 61/725,144中描述。

合适的体内测试系统或测试模型的实例是：

- 分离的灌注肝，例如小鼠或大鼠，如vom Dahl等人, 1991或Schulz等人, 1991中描述；

- 转基因小鼠，如实施例中描述和如2012年11月12日申请的美国临时申请 61/725,144中描述。

用于治疗肝脏疾病的方法

如上所讨论，本发明提供用于诊断、预防和/或治疗肝脏疾病或病况的方法。

所述肝脏疾病或病况与化合物向肝细胞的牛磺胆酸钠协同转运多肽(NTCP)介导的转运相关。

本发明的方法包括将治疗有效量的基于脂肽的化合物施用于患者的步骤。

基于脂肽的化合物优选如本申请中所定义。

优选地，且如上所讨论，所述与化合物向肝细胞的NTCP介导的转运相关的肝脏疾病或病况是选自以下的肝脏参与的代谢疾病

　　肝内胆汁淤积，

　　肝脏(通过肝脏毒素)的中毒/肝毒性，

　　药物诱导的胆汁淤积性肝病，

　　高脂血症，

　　肝后胆汁淤积。

优选地，且如上所讨论，经由NTCP转运到肝细胞中的化合物是

　　- 胆汁酸类

　　　　诸如胆酸盐

　　　　牛磺酸-或甘氨酸-缀合的胆汁酸及其盐

　　　　　　(牛磺酸-或甘氨酸缀合的二羟基和三羟基胆汁盐)

　　　　　　诸如

　　　　　　牛磺胆酸盐

　　　　　　甘氨胆酸盐

　　　　　　牛磺脱氧胆酸盐

　　　　　　牛磺鹅脱氧胆酸盐

　　　　　　牛磺熊脱氧胆酸盐

　　　　硫酸化的胆汁酸及其盐

　　- 类固醇类

　　　　类固醇硫酸盐

　　　　　　雌激素缀合物(例如雌酮-3-硫酸盐，17α-炔雌醇-3-O-硫酸盐)

　　　　　　脱氢表雄酮硫酸盐

　　- 缀合和未缀合的甲状腺激素

　　- 肝毒素

　　- 共价结合至牛磺胆酸盐的化合物(例如，苯丁酸氮芥-牛磺胆酸盐)

　　- 溴磺酚酞

　　- 药物

　　诸如

　　　　抗真菌药(例如米卡芬净)

　　　　抗高血脂药(例如辛伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀)

　　　　抗高血压药，

　　　　抗炎药，或

　　　　糖皮质激素药物。

在一个实施方案中，如上所讨论，NTCP介导的转运被基于脂肽的化合物减少或阻断。

优选地，且如上所讨论，基于脂肽的化合物的治疗有效量在约0.1 mg至约50 mg/患者/天、优选约1 mg至约20 mg/患者/天的范围内。

用于控制胆固醇水平和治疗心血管疾病的方法

如上所讨论，本发明提供用于控制或改变胆固醇水平或胆固醇摄取的方法。

胆固醇水平或摄取通过(经由基于脂肽的化合物)降低或阻断NCTP介导的胆汁盐转运而控制或改变。

本发明的方法包括将治疗有效量的基于脂肽的化合物施用于患者的步骤。

基于脂肽的化合物优选如本申请中所定义。

如上所讨论，本发明提供用于诊断、预防和/或治疗心血管疾病(CVD)的方法，所述方法包括将治疗有效量的基于脂肽的化合物(优选如权利要求5至9中任一项所定义)施用于患者。

由此，胆固醇水平或摄取优选通过如本申请中定义的基于脂肽的化合物降低或阻断NCTP介导的胆汁盐转运而控制或改变。

NTCP介导的阻塞胆汁酸摄取能够实现经由肝细胞的升高的胆固醇周转。因此，LDL胆固醇将降低，且HDL胆固醇将升高。作为结果，导致高血压、CVD心脏病发作和中风的动脉阻塞的风险将尽可能减小。

本发明的进一步描述

本发明人显示，脂肽Myrcludex B (MyrB)干扰NTCP介导的胆汁盐转运。

NTCP/SLC10A受体的功能分析揭示：

(i) 人NTCP (hNTCP)结合MyrB；

(ii) NTCP-底物干扰HBV感染；

(iii) MyrB抑制NTCP介导的胆汁盐转运。

MyrB是一种有趣的新颖药物，其不仅靶向NTCP，而且在体内研究其功能。

值得注意的是，转运蛋白失活的K_i(rNTCP的K_i ~ 4nM)相比于对于HBV/HDV感染抑制观察到的IC₅₀(80 pM)高得多(Schulze等人, 2010)。这与以下发现一致：HBV感染在低于饱和受体的浓度可已被阻断(Schulze等人, 2010)。一个合理的解释是以下假设：类似于其他病毒，L蛋白/hNTCP复合物必须多聚化。如果只有一个亚基结合MyrB，则可废除进入，尽管底物转运可进展。该假设得到证明NTCP的寡聚化的报道支持(Doring等人, 2012)。NTCP的天然底物当以高浓度(图2C和D)应用时干扰MyrB结合和HBV感染的观察表明钠驱动的转运与有效的HBV进入相偶联。

以下实施例和附图举例说明本发明，然而不限于此。

附图简述

图1　　hNTCP特异性结合脂肽MyrB。

五种肝细胞瘤细胞系中的稳定的人NTCP (hNTCP)表达通过抗生素选择后的慢病毒转导来实现。

(A) 来自HuH7^hNTCP、HepG2^hNTCP、HepaRG^hNTCP、Hepa1-6^hNTCP和Hep56.1D^hNTCP细胞系(相比于模拟转导的细胞和两种PHH样品)的去糖基化的细胞裂解物的Western印迹。HepaRG^hNTCP泳道(*)上仅上样10％的样品。

(B-C) 将表达hNTCP的人细胞系与Atto488标记的肽MyrB^atto (绿色或488 λ)孵育。肽结合通过肽与hNTCP的共定位－使用hNTCP特异性抗体(红色)的IF (B)或使用突变体肽MyrB^attoAla11-15或过量的未标记的MyrB的FACS (C)来分析。

(D) 如(C)中对于HepG2^mNtcp细胞系所述的MyrB结合的FACS分析。

(E) 表达大鼠Ntcp-eGFP的HepG2细胞(绿色)与MyrB^atto(红色)孵育，并通过共聚焦显微镜分析。注意微绒毛中hNTCP/MyrB^atto的共定位。

图2　　脂肽MyrB对NTCP介导的胆汁酸转运的影响；胆汁酸对HBV感染的效果。

(A) 表达rNtcp-eGFP的HepG2细胞与渐增浓度的MyrB或突变体MyrB^Ala11-15(在区域9-NPLGFFP-15中具有Ala突变的突变体，即9-NPAAAAA-15)孵育，且定量³H-牛磺胆酸盐摄取。将未竞争的摄取设定为100％。

(B) 表达hNtcp-eGFP的HepG2细胞与渐增浓度的MyrB、突变体MyrB^Ala11-15（或preS2-78myr孵育，且定量³H-牛磺胆酸盐摄取。将未竞争的摄取设定为100％。

(C-D) 分化的HepaRG (B)或HuH7^hNTCP细胞(C)在HBV感染之前2小时预孵育，并且在HBV感染过程中与5、50 和500 μM TC、TDC 或TCDC共孵育，并且在感染后第7-9天(d7-9 p.i.)测定分泌的HBeAg。感染通过在感染之前2小时和感染过程中添加MyrB来控制(controlled)。

(E) HuH7^hNTCP细胞在37℃在所示胆汁盐浓度孵育过夜，用胰蛋白酶处理，并在胆汁盐存在的情况下与MyrB^atto再孵育30分钟。结合通过FACS分析进行定量。未标签的MyrB用作对照。

实施例

1.　　方法

1.1　　质粒：将hNTCP cDNA (Origene, USA)和mNtcp cDNA (Rose等人, 2011)亚克隆至共表达嘌呤霉素的慢病毒载体pWPI-puro中。hNTCP、mNtcp和h/mNtcp嵌合体通过重叠PCR生成并引入pWPI-GFP。

1.2　　细胞：产生慢病毒，且用于将hNTCP转导至人(HepaRG、HepG2、HuH7)、小鼠(Hepa1-6、Hep56.1D)和大鼠肝细胞瘤细胞系TC5123中。各模拟转导的细胞用作对照。为了生成稳定细胞系，实现用2.5 μg/ml嘌呤霉素的选择。转导的HepaRG的分化如(Gripon等人, 2002)中所述通过DMSO诱导。对于有或无融合的eGFP的大鼠Ntcp的表达，先前已经描述了HepG2-rNTCP和HepG2-rNTCP-eGFP细胞系(Stross等人, 2010)。

1.3　　肽的合成和标记化

MyrB和MyrB突变体和对照肽preS2-78myr的合成通过固相合成进行(Schieck等人, 2013)。标记化通过将atto565-NHS-酯/atto488-NHS-酯(ATTO-TEC, Germany)偶联至肽的赖氨酸残基来实现。单标记化的肽在HPLC纯化后合并，制备储存溶液(100 μM)并储存在-80℃。

1.4　　流式细胞术： 将细胞在37℃在含有200 nM MyrB^atto或MyrB^atto-突变体的培养基中孵育30分钟。将细胞洗涤(PBS/1% BSA)，用胰蛋白酶处理，并悬浮于Krebs-Henseleit-缓冲液中。流式细胞术在FACS Canto II (BD Bioscience, Heidelberg, Germany)上进行；FlowJo v7.61软件(Treestar, Ashton, USA)用于分析。使用BD Compbeats (BD Bioscience, Heidelberg, Germany)进行补偿。

1.5　　IF: 使细胞在盖玻片上生长(参见Meier等人, 2012)，洗涤并与400 nM MyrB孵育(37℃；30分钟)。将细胞再次洗涤(3x PBS/2% BSA)，用PFA固定，用PBS/1ug/ml Hoechst 3342洗涤并封固(FluoromountG)。在用TritonX 100透化(10 min/RT)后，使用在PBS/2% BSA中1:750稀释的α-SCL10A1/NTCP抗体(Sigma, Germany)实现NTCP免疫染色(18小时，4℃)。多克隆兔抗血清H863用于HBcAg染色，多克隆兔抗血清用于MRP-2检测，患者来源的血清(M. Roggendorf, Essen)用于HδAg。作为二抗，使用用AlexaFluor488或AlexaFluor546标记的山羊抗兔或山羊抗人(Invitrogen)。肌动蛋白染色通过将1:2000稀释的atto633标记鬼笔环肽(ATTO-Tec, Germany)添加至第二染色步骤来进行。图像在Leica DM IRB或Leica SP2共聚焦显微镜(Leica, Germany)上拍摄，使用ImageJ进行图像分析。

1.6　　牛磺胆酸盐摄取测定： HepG2-rNtcp细胞如(Kubitz等人, 2004)先前所述用于研究[3H] TC摄取。简而言之，将HepG2-rNtcp细胞培养12小时(在含有用于选择的G418的D-MEM/Ham′s F12 w. 10% FCS培养基中)，与渐增浓度的MyrB预孵育20分钟，然后添加TC(150 μM，含有450 cpm/fmol [3H]TC)。5分钟后，通过去除培养基并用冰冷的PBS洗涤三次停止摄取。裂解细胞(0.2 M NaOH和0.05% SDS)。细胞裂解物的放射活性在液体闪烁计数器(Packard instruments, Frankfurt, Germany)中使用Ultima Gold液体闪烁溶液(Perkin Elmer, Rodgau, Germany)进行测量。

1.7　　Western印迹： 全细胞裂解物用PNGase F (New England Biolabs)处理，并通过Western印迹使用兔抗hNTCP抗体(Sigma-Aldrich)或抗血清K9进行分析。

2.　　脂肽MyrB与hNTCP的结合

为了评价hNTCP的表达是否促进MyrB结合，HuH7-、HepG2-、HepaRG-和两种小鼠肝细胞瘤细胞Hepa1-6和Hep56.1D用编码hNTCP的慢病毒稳定转导。hNTCP表达通过Western印迹验证(图1A)。HuH7^hNTCP、HepG2^hNTCP、Hepa1-6^hNTCP 和Hep56.1D^hNTCP表达相当量的hNTCP。出于未知原因，HepaRG^hNTCP-表达更高。在模拟转导的细胞中未检测到hNTCP。为了检查hNTCP表达是否使得HuH7^hNTCP、HepG2^hNTCP 和HepaRG^hNTCP细胞能够结合HBVpreS，我们通过荧光显微镜(图1B)和流式细胞术(图1C)分析atto-染料-标记的MyrB (MyrB^atto)的细胞结合。通过MyrB竞争和MyrB^attoAla11-15突变体控制特异性。hNTCP-表达导致特异性的MyrB结合，表明hNTCP作为HBVpreS-特异性受体的有效作用。

由于来自一些非HBV易感物种(小鼠(m)，大鼠(r))的肝细胞结合MyrB(Meier等人, 2012)且在注射后在肝脏中积聚肽(Schieck等人, 2013)，我们预期mNtcp和rNtc也结合MyrB。因此，我们使用HepG2^mNtcp细胞和表达大鼠NTCP-eGFP-融合体的HepG2细胞，并分析MyrB^atto结合。我们验证MyrB^atto与两种细胞系的特异性且竞争性结合(图1D和E)。利用大鼠NTCP-eGFP融合体的荧光，我们证实了微绒毛中MyrB/rNtcp-复合物的共定位。

3.　　胆汁盐转运的抑制

3.1　　脂肽MyrB抑制NTCP的胆汁盐转运蛋白功能。

MyrB作为一些NTCP的特异性配体的仅仅大小(mere size)表明几个接触位点参与结合。为了测试MyrB因此是否干扰NTCP的胆汁盐转运蛋白功能，我们在表达Flag-rNtcp-eGFP的HepG2细胞系中分析MyrB对³H-标记的牛磺胆酸盐的摄取的干扰。MyrB以4 nM的 IC₅₀抑制rNtcp(图2A)。值得注意的是，HBV感染的抑制的IC₅₀(~100pM)和胆汁盐转运的抑制的IC₅₀(~5nM)实质上不同，这与感染抑制不需要NTCP的结合饱和的观察(Schulze等人, 2010)相关。

此外，我们在表达Flag-hNtcp-eGFP的HepG2细胞系中分析了MyrB(相比于两种对照肽)对³H-标记的牛磺胆酸盐摄取的干扰，所述两种对照肽为：突变体MyrB^Ala11-15 ((在区域9-NPLGFFP-15中具有Ala突变的突变体，即9-NPAAAAA-15))和preS2-78myr(参见图2B)。

3.2　　NTCP底物牛磺胆酸盐(TC)、牛磺脱氧胆酸盐(TDC)和牛磺鹅脱氧胆酸盐(TCDC)抑制HBV感染。

为了测试NTCP的天然底物是否影响HBV感染，分化的HepaRG (图2C)和HuH7^hNTCP (图2D)细胞在渐增浓度的TC、TDC和TCDC下用HBV接种。所有三种底物在两种细胞系中都在非生理浓度(50μM和500μM)抑制HBV感染，如HBeAg分泌所显示。在5 μM观察到略微降低，表明在生理条件(<5μM)下，hNTCP仍然是功能性的HBV/HDV受体。为了测试TC、TDC和TCDC是否干扰MyrB^atto结合，我们进行了结合竞争测定(图2E)。在500 μM存在的情况下，所有底物都深度干扰preS-结合。

前述说明书、权利要求和/或附图中公开的特征可以，单独和以其任何组合，是用于以其多种形式实现本发明的材料。

Claims (23)

1.基于脂肽的化合物，其用于诊断、预防和/或治疗肝脏疾病或病况，

其中所述肝脏疾病或病况与化合物向肝细胞的牛磺胆酸钠协同转运多肽(NTCP)介导的转运相关。

2.权利要求1的基于脂肽的化合物，其中所述与化合物向肝细胞的NTCP介导的转运相关的肝脏疾病或病况是选自以下的肝脏参与的代谢疾病

　　肝内胆汁淤积，

　　肝脏(通过肝脏毒素)的中毒/肝毒性，

　　药物诱导的胆汁淤积性肝病，

　　高脂血症，

　　肝后胆汁淤积。

3.权利要求1或2的基于脂肽的化合物，其中经由NTCP转运到肝细胞中的化合物是

　　- 胆汁酸类

　　　　诸如胆酸盐

　　　　牛磺酸-或甘氨酸-缀合的胆汁酸及其盐

　　　　　　(牛磺酸-或甘氨酸-缀合的二羟基和三羟基胆汁盐)

　　　　　　诸如

　　　　　　牛磺胆酸盐

　　　　　　甘氨胆酸盐

　　　　　　牛磺脱氧胆酸盐

　　　　　　牛磺鹅脱氧胆酸盐

　　　　　　牛磺熊脱氧胆酸盐

　　　　硫酸化的胆汁酸及其盐

　　- 类固醇类

　　　　类固醇硫酸盐

　　　　　　雌激素缀合物(例如雌酮-3-硫酸盐，17α-炔雌醇-3-O-硫酸盐)

　　　　　　脱氢表雄酮硫酸盐

　　- 缀合和未缀合的甲状腺激素

　　- 肝毒素

　　- 共价结合至牛磺胆酸盐的化合物(例如，苯丁酸氮芥-牛磺胆酸盐)

　　- 溴磺酚酞

　　- 药物

　　诸如

　　　　抗真菌药(例如米卡芬净)，

　　　　抗高血脂药(例如辛伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀)，

　　　　抗高血压药，

　　　　抗炎药，或

　　　　糖皮质激素药物。

4.权利要求1-3中任一项的基于脂肽的化合物，其中所述NTCP介导的转运被所述基于脂肽的化合物减少或阻断。

5.权利要求1-4中任一项的基于脂肽的化合物，其中所述基于脂肽的化合物包含以下通式的肽

X - P - Y - R_o

其中

P是氨基酸序列NPLGFXaaP (SEQ.ID NO:1)，

　　其中Xaa是任意氨基酸；优选F或L，更优选F，

X是具有m个氨基酸长度的氨基酸序列，

　　其中m为至少4；

Y是具有n个氨基酸长度的氨基酸序列，

　　其中n为0或至少1；

并且其中m + n ≥ 11；

R是所述疏水性修饰的肽的C端修饰，

　　其优选为保护免于降解的部分，所述部分选自酰胺、D-氨基酸、经修饰氨基酸、环状氨基酸、白蛋白、天然和合成的聚合物，诸如PEG、聚糖，

o为0或至少1。

6.权利要求5的基于脂肽的化合物，其中m = 4至19和/或n = 0至78。

7.权利要求5或6的基于脂肽的化合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:2-14的氨基酸序列的18-119个连续氨基酸或其变体，诸如具有以下的氨基酸序列

SEQ ID NO. 18     HBV preS/2-48 (基因型C)，

SEQ ID NO. 19     HBV preS/2-48 (基因型D)，

SEQ ID NO. 20     HBV preS/2-48 (共有)，或

与SEQ ID NO.18至20中任一者具有至少90％序列同一性(优选至少95％或99％同一性)的氨基酸序列。

8.权利要求5-7中任一项的基于脂肽的化合物，其中所述肽包含一个或多个疏水性修饰，诸如一个或多个N端、C端疏水性修饰或一个或多个在氨基酸侧链的疏水性修饰，其中所述疏水性修饰优选为疏水性部分的酰化和/或添加，更优选通过用肉豆蔻酰基(C14)、棕榈酰基(C16)或硬脂酰基(C18)的酰化的N端疏水性修饰，甚至更优选通过用肉豆蔻酰基(C14)的酰化的N端疏水性修饰。

9.权利要求5或6的基于脂肽的化合物，其中所述脂肽是具有SEQ ID NO. 18的氨基酸序列的Myrcludex B，其具有N端肉豆蔻酰化和C端酰胺。

10.权利要求5-9中任一项的基于脂肽的化合物，其包含一个或多个进一步部分，

　　诸如

　　一种或多种药物或它们各自的前药；

　　一种或多种标签；

　　一种或多种标记，诸如一种或多种荧光染料、一种或多种放射性同位素和一种或多种造影剂；

　　一种或多种重组病毒或其衍生物；

　　药物、前药或标记的载体或一种或多种储库；

　　一种或多种免疫原性表位；

　　激素。

11.权利要求10的基于脂肽的化合物，其中所述一个或多个进一步部分是共价连接的，诸如经由接头、间隔区和/或锚定基团。

12.前述权利要求中任一项的基于脂肽的化合物，其中所述基于脂肽的化合物以治疗有效量、优选以约0.1 mg至约50 mg/患者/天、优选约1 mg至约20 mg/患者/天的范围施用。

13.如权利要求1-12中任一项定义的基于脂肽的化合物，其用于诊断、预防和/或治疗心血管疾病(CVD)。

14.权利要求13的基于脂肽的化合物，其包含控制或改变胆固醇水平或胆固醇摄取，

其中通过(经由所述基于脂肽的化合物)降低或阻断NCTP介导的胆汁盐转运而控制或改变所述胆固醇水平或摄取。

15.用于测试或测量一种或多种测试化合物的NTCP介导的转运的体外或体内测定或方法，所述测定或方法包括以下步骤：

(a) 提供一种或多种测试化合物和如权利要求5-11中任一项中定义的基于脂肽的化合物；

(b) 提供用于功能性和选择性NTCP表达的测试系统，诸如转基因细胞系或转基因动物；

(c) 与基于脂肽的化合物或不与基于脂肽的化合物一同将所述测试化合物添加至(b)的NTCP测试系统；

(d) 通过比较各自在有添加或无添加基于脂肽的化合物情况下步骤(b)和(c)的结果确定所述测试化合物是否经由NTCP转运，

其中，当测试化合物减少、阻断或抑制通过NTCP的胆汁盐转运（竞争性转运）时，或者当所述化合物的转运可以通过添加基于脂肽的化合物而减少、阻断或抑制时，所述化合物被认为是经由NTCP转运。

16.用于诊断、预防和/或治疗肝脏疾病或病况的方法，其中所述肝脏疾病或病况与化合物向肝细胞的牛磺胆酸钠协同转运多肽(NTCP)介导的转运相关，

所述方法包括将治疗有效量的基于脂肽的化合物，优选如权利要求5至11中任一项所定义的基于脂肽的化合物，施用于患者。

17.权利要求16的方法，其中所述与化合物向肝细胞的NTCP介导的转运相关的肝脏疾病或病况是选自以下的肝脏参与的代谢疾病

　　肝内胆汁淤积，

　　肝脏(通过肝脏毒素)的中毒/肝毒性，

　　药物诱导的胆汁淤积性肝病，

　　高脂血症，

　　肝后胆汁淤积。

18.权利要求16或17的方法，其中经由NTCP转运到肝细胞中的化合物是

　　- 胆汁酸类

　　　　诸如胆酸盐

　　　　牛磺酸-或甘氨酸-缀合的胆汁酸及其盐

　　　　　　(牛磺酸-或甘氨酸-缀合的二羟基和三羟基胆汁盐)

　　　　　　诸如

　　　　　　牛磺胆酸盐

　　　　　　甘氨胆酸盐

　　　　　　牛磺脱氧胆酸盐

　　　　　　牛磺鹅脱氧胆酸盐

　　　　　　牛磺熊脱氧胆酸盐

　　　　　　硫酸化的胆汁酸及其盐

　　- 类固醇类

　　　　类固醇硫酸盐

　　　　　　雌激素缀合物(例如雌酮-3-硫酸盐，17α-炔雌醇-3-O-硫酸盐)

　　　　　　脱氢表雄酮硫酸盐

　　- 缀合和未缀合的甲状腺激素

　　- 肝毒素

　　- 共价结合至牛磺胆酸盐的化合物(例如，苯丁酸氮芥-牛磺胆酸盐)

　　- 溴磺酚酞

　　- 药物

　　诸如

　　　　抗真菌药(例如米卡芬净)，

　　　　抗高血脂药(例如辛伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀)，

　　　　抗高血压药，

　　　　抗炎药，或

　　　　糖皮质激素药物。

19.权利要求16-18中任一项的方法，其中所述NTCP介导的转运被所述基于脂肽的化合物减少或阻断。

20.权利要求16-19中任一项的方法，其中所述基于脂肽的化合物的治疗有效量在约0.1 mg至约50 mg/患者/天、优选约1 mg至约20 mg/患者/天的范围内。

21.用于诊断、预防和/或治疗心血管疾病(CVD)的方法，所述方法包括将治疗有效量的基于脂肽的化合物，优选如权利要求5至11中任一项所定义的基于脂肽的化合物，施用于患者。

22.权利要求20的方法，其中通过(经由所述基于脂肽的化合物)降低或阻断NCTP介导的胆汁盐转运而控制或改变胆固醇水平或摄取。

23.权利要求16-21中任一项的方法，其中施用途径选自皮下、静脉内、口服??、鼻内、肌内、经皮、吸入、通过栓剂。