CN109302986A - 一种楠木优树组织培养幼化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于楠木育苗技术领域，涉及一种楠木优树的幼化方法，所述方法包括楠木优树材料的嫁接复壮步骤，外植体灭菌、初代培养、试管嫁接幼化、继代增殖培养、诱导生根步骤以及炼苗和移栽步骤。本发明的楠木优树组织培养的幼化方法具有使楠木优树嫩枝扦插成活率高、无性繁殖能力强等优点。另外，本发明还避免了楠木优树种子、枝条、根段采集难的问题，同时也使楠木优树材料的幼化周期缩短，幼化效率大大提高。因此，本发明为楠木优树的幼化开辟了新途径，有力推动了楠木育种的进程。
Description
技术领域
本发明涉及一种楠木优树组织培养幼化的方法，它是对楠木成熟化效应严重的优树材料进行幼化，从而提高了楠木优树的无性繁殖能力。
背景技术
楠木属亚热带常绿阔叶高大乔木，为我国特有的珍稀濒危保护树种，木材材质优良，坚硬耐腐，是一种经济价值极高的名贵优良用材树种。楠木在我国主要分布在湖北省西部、贵州省西北部、四川省及重庆市，树形挺拔、枝叶繁茂、四季常青，是组成常绿阔叶林的主要树种，其中不乏生长快、干形优的成年优树。然而，由于自然和人为等种种原因，我国楠木种质资源日趋减少，这严重威胁着我国特有珍贵资源的生存与发展。挽救、保护和综合利用楠木种质资源迫在眉睫，收集优良楠木种质资源并进行无性繁殖是挽救和保护楠木种质资源的必要措施。
目前，楠木的繁育手段为播种育苗的繁育方法。然而，受生长环境条件的限制，多数楠木优树种子采集十分困难，部分优树虽然能够采集到种子，但是育苗时间长，难以维持母本的优良特性。扦插繁殖和嫁接繁殖是无性繁育的重要手段，能够把亲本的遗传特性原原本本地继承下来，但是楠木成年大树的枝条老化，老枝条扦插苗以及根系扦插苗成活率都极低，因此，对老龄优树材料进行幼化并进行无性繁殖是育种研究工作中的重要问题。
基于上述理由，提出本申请。
发明内容：
本发明的目的是针对楠木优树材料成熟化效应严重，无性繁殖能力低的突出问题，研究出一种楠木优树组织培养幼化的方法。该方法是先将楠木优树材料进行嫁接复壮，然后再通过组织培养和试管嫁接相结合的方法进行楠木优树材料幼化，它不但避免了楠木优树种子、枝条、根段采集难的问题，同时也使楠木优树材料的幼化周期缩短，幼化效率大大提高，有力地推动了楠木育种的进程。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种楠木优树组织培养幼化的方法，所述方法包括以下步骤：
(一)材料的嫁接复壮：首先是将秋季、早春收集的楠木优树枝条进行嫁接，嫁接方式采用“T”形芽接法进行，砧木采用普通楠木的苗木；
(二)组织培养和试管嫁接幼化：4月中旬至8月底采集楠木优树嫁接材料萌发的嫩枝进行组织培养和试管嫁接幼化，其过程包括以下几个步骤：
第一步、外植体灭菌：采集经嫁接复壮过的楠木优树带腋芽茎段作为外植体，用高锰酸钾溶液将嫩枝表面消毒、清洗干净，然后放在超净工作台上，进行表面灭菌，灭菌时，先用75％的酒精浸泡7～8秒后，快速用无菌水冲洗3～5次，再用0.13％～0.15％的氯化汞溶液浸泡5～6分钟，用无菌水冲洗3～5次，然后用无菌滤纸吸干材料表面的水，再用85μg/mL氨苄青霉素浸泡5分钟；
第二步、初代培养：表面灭菌后的外植体材料经剪切处理后，接种到初代培养基中进行培养，培养条件为室温25～26℃，光照强度3000～4000lux，光照时间每天8:00～ 20:00，初代培养5～6天后转接到相同培养基继续培养10～12天；
第三步、试管嫁接幼化：切取初代培养萌发的嫩芽作为接穗，以普通楠木为砧木进行无菌嫁接，嫁接方式采用“T”形芽接法进行，嫁接后转接到嫁接幼化培养基中进行培养，培养条件同初代培养，培养10～12天，剪除砧木上的萌芽，继续培养28～30 天；
第四步、继代增殖培养：将已经幼化伸长，生长旺盛的楠木优树接穗萌发的嫩芽，剪切长度为2.5～3.0cm带1～2节的茎段，转移至增殖培养基中，进行增殖培养，增殖培养继代周期为30～35天，培养条件为：室温28～29℃，光照强度3000～4000lux,光照时间每天8:00～20:00；
第五步、诱导生根：切取长约3cm粗壮的楠木优树材料幼化的嫩芽，转接在生根培养基中诱导生根，生根培养条件的室温为28～29℃，生根光照时间控制为每天12h，光照强度为2000～3000lux，生根时间为10～12天；
第六步、炼苗和移栽：待楠木试管苗根长至1.5～2.0cm时，进行室内炼苗，炼苗时先将附着在根部的培养基清洗干净，然后栽植到泥炭土和珍珠岩的混合基质中，混合基质中的泥炭土和珍珠岩的比例为3:1，浇透水，覆盖保湿4～5天，30天后将幼苗移栽到口径为12cm的营养钵中，营养钵中装有沙壤土和泥炭土比例为3:1的混合基质，置于塑料大棚壮苗，壮苗过程中，根据需要及时浇水、喷施叶面肥溶液及预防病虫害，大棚壮苗一个月，进行大田移栽。
进一步，所述的(一)材料的嫁接复壮中的嫁接时间是在秋季和早春进行；嫁接方式采用“T”形芽接法，砧木采用普通楠木苗木。
进一步，上述技术方案所述的(二)组织培养和试管嫁接幼化的第二步、初代培养步骤中的初代培养基为：MS+5mg/L(3.0～5.0)6-BA+0.4mg/L(0.4～0.5)NAA，再加入琼脂5.5g/L，蔗糖25g/L，其pH值为6.2～6.5。
进一步，上述技术方案所述的(二)组织培养和试管嫁接幼化的第三步、试管嫁接幼化步骤中的试管嫁接幼化培养基为：MS+(0.3～0.5)mg/LNAA，再加入琼脂5.5g/L，蔗糖浓度为25～30g/L，pH值为6.2～6.5。
进一步，所述的(二)组织培养和试管嫁接幼化的第四步、继代增殖培养步骤中的增殖培养基为：1/2MS+6mg/L(5.0～7.0)6-BA+0.4mg/L NAA，再加入琼脂5.5g/L，蔗糖15～20g/L，pH值为6.2～6.5。
进一步，所述的(二)组织培养和试管嫁接幼化的第五步、诱导生根步骤中的生根培养基为：1/2MS+(0.2～0.3mg/L)NAA+(0.1～0.2mg/L)IBA，再加入琼脂5.5g/L，蔗糖15～20g/L，pH值为6.2～6.5。
本发明的积极效果是：
(1)本发明是将成熟化效应较严重的楠木材料经嫁接复壮，再进行组织培养和试管嫁接幼化，克服了楠木优树种子采集难，种子育苗母本优良特性难以保存的缺点；
(2)本发明解决了楠木优树材料成熟化效应严重，无性繁殖能力低的突出问题；
(3)本发明进一步提高了楠木优树幼化的成功率和幼化效率，降低了科研成本；
(4)通过本发明的实施，为楠木优树的幼化开辟了一个新途径；
(5)经过本发明组织培养幼化后的楠木幼树嫩枝成活率可达90％以上，因此本发明方法对楠木优树种质资源的保存和发展具有十分重要的意义。
具体实施方式：
下面结合实施案例对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施案例。
实施例1：以楠木优树“楠优5”为例对本发明作进一步的详细说明。
一种楠木优树组织培养幼化的方法，该方法包括以下步骤：
(一)材料的嫁接复壮：首先将秋季、早春收集的“楠优5”优树枝条，于3月下旬进行嫁接，嫁接方式采用“T”形芽接法，选用直径3～5cm的健壮的普通楠木作砧木，接穗萌发后，及时抹除砧木上的萌芽，根据生长情况，加强水、肥和病虫害管理；
(二)组织培养和试管嫁接幼化：5月上旬采集长度超过10cm的嫁接苗的嫩枝进行组织培养和试管嫁接幼化，其过程包括以下几个步骤：
第一步、外植体灭菌：采集经嫁接复壮过的楠木优树嫩枝，剪切带腋芽茎段长度为1.3～1.5cm，用高锰酸钾溶液将嫩枝表面消毒、清洗干净，然后放在超净工作台上，进行表面灭菌，灭菌时，先用75％的酒精浸泡7～8秒后，快速用无菌水冲洗3～5次，再用0.13％～0.15％的氯化汞溶液浸泡5～6分钟，用无菌水冲洗3～5次，然后用无菌滤纸吸干材料表面的水，再用85μg/mL氨苄青霉素浸泡5分钟；
第二步、初代培养：表面灭菌后的外植体材料经剪切处理后，接种到初代培养基中进行培养，培养基为：MS+5mg/L(3.0～5.0)6-BA+0.4mg/L(0.4～0.5)NAA，再加入琼脂5.5g/L，蔗糖25g/L，其pH值为6.2～6.5。培养条件为室温25～26℃，光照强度3000～ 4000lux，光照时间每天8:00～20:00，初代培养5～6天后转接到相同培养基继续培养 10～12天；
第三步、试管嫁接幼化：试管嫁接采用芽接进行，砧木选用长度为3cm，去顶芽的楠木组培苗茎段，接穗采用外植体经初代培养后萌发的长度约2cm嫩枝，嫁接时，先将楠木切取初代培养萌发的嫩芽作为接穗，以普通楠木为砧木进行无菌嫁接，嫁接方式采用“T”形芽接法进行，先在接穗上选定1个叶芽，在选定的叶芽上方0.5厘米处横切一刀，长约0.8厘米，再在叶芽下方1厘米处横切一刀，然后用刀自下端横切处紧贴枝条的木质部向上削去，一直削到上端横切处，削成一个上宽下窄的盾形芽片——接穗；再在砧木上横切一刀，长约1厘米，深度以切断砧木皮层为度，再从横口中间向下垂直切一刀，长约1～1.2厘米，切成“T”形。然后用芽接刀骨柄挑开砧木皮层，以便插进接穗，用芽接刀挑开砧木上的“T”字形切口，将接穗插入切口中，插入时接穗的叶柄要朝上，插入后，要使接穗上端同“T”字形横切口对齐，用塑料带先从接口上边绑起，逐渐往下缠，叶芽和叶柄要留在外边，转接到嫁接幼化培养基中进行培养，幼化培养基为：MS+(0.3～0.5)mg/LNAA，再加入琼脂5.5g/L，蔗糖浓度为25～30g/L，pH值为 6.2～6.5。培养条件为室温27～28℃，光照强度3000～4000lux,光照时间每天8:00～ 20:00，培养10～12天，剪除砧木上的萌芽，继续培养28～30天；
第四步、继代增殖培养：将已经幼化伸长，生长旺盛的楠木优树接穗萌发的嫩芽，剪切成长度为2.5～3.0cm带1～2节的茎段，转移至增殖培养基中，进行增殖培养，继代增殖培养基为：1/2MS+6mg/L(5.0～7.0)6-BA+0.4mg/L NAA，再加入琼脂5.5g/L，蔗糖15～20g/L，pH值为6.2～6.5，继代周期为30～35天，培养条件为：室温28～29℃，光照强度3000～4000lux，光照时间每天8:00～20:00；
第五步、诱导生根：切取长约3cm生长状况良好的楠木幼化的嫩芽，转接在生根培养基中诱导生根，生根培养基为：1/2MS+(0.2～0.3mg/L)NAA+(0.1～0.2mg/L) IBA，再加入琼脂5.5g/L，蔗糖15～20g/L，pH值为6.2～6.5，生根培养条件的室温为 28～29℃，生根光照时间控制为每天12h，光照强度为2000～3000lux，生根时间为10～ 12天；
第六步、炼苗和移栽：待楠木试管苗根长至1.5～2.0cm时，进行室内炼苗，炼苗时先将附着在根部的培养基清洗干净，然后栽植到泥炭土和珍珠岩的混合基质中，混合基质中的泥炭土和珍珠岩的比例为3:1，浇透水，覆盖保湿4～5天，30天后将幼苗移栽到口径为12cm的营养钵中，营养钵中装有沙壤土和泥炭土比例为3:1的混合基质，置于塑料大棚进行炼苗，炼苗过程中，根据需要及时浇水、喷施叶面肥溶液及预防病虫害，大棚炼苗一个月，进行大田移栽。
以本实施例的楠木优树组织培养幼化的方法进行楠木生根成活率实验，实验结果如下表1所示，其中：实验序号001、002、003代表采用本实施例组织培养幼化的方法进行的三组相同的平行试验；实验序号004、005、006代表采用现有技术中普通扦插方法进行的三组相同的平行试验。
表1采用本发明实施例1嫁接幼化的方法和普通扦插方法得到的幼苗成
活数及成活率对比表
| 实验序号 | 实验样品数 | 实验方法 | 成活的幼苗 | 成活率 |
| 001 | 200 | 实施例1的方法 | 190 | 95％ |
| 002 | 200 | 实施例1的方法 | 185 | 92.5％ |
| 003 | 200 | 实施例1的方法 | 181 | 90.5％ |
| 004 | 200 | 普通扦插 | 43 | 21.5％ |
| 005 | 200 | 普通扦插 | 48 | 24％ |
| 006 | 200 | 普通扦插 | 55 | 27.5％ |
上述实验选用的楠木枝条均为生长健壮、无病虫害的枝条。
由上表1可知，本实施例的楠优树组织培养幼化后幼苗的成活率都在90％以上，而采用普通扦插方法(没有经过组织培养幼化)的楠木幼树枝条的扦插成活率均在30％以下。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，唯不同之处在于，进行外植体表面灭菌时，所述酒精浓度为85％，所述浸泡时间为3～5秒。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，唯不同之处在于，进行初代培养时，所述培养条件室温为28～29℃，所述光照强度为2000～3000lux，所述光照时间为每天6:00～22:00。
实施例4
本实施例与实施例1基本相同，唯不同之处在于，进行继代增殖培养时，所述培养条件为室温25～26℃，所述光照强度为3000～4000lux,所述光照时间为每天6:00～ 22:00.
实施例5
本实施例与实施例1基本相同，唯不同之处在于，在进行生根培养时，所述室温为25～ 26℃，所述生根光照时间控制为每天16h，所述光照强度为3000～4000lux。
经测试，实施例2～5的楠优树组织培养幼化后幼苗的成活率也都在90％以上，由上述结果可以看出，本发明进一步提高了楠木优树幼化的成功率和幼化效率，通过本发明的实施也为楠木优树的幼化开辟了一个新途径。
Claims (6)
1.一种楠木优树组织培养幼化的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
(一)材料的嫁接复壮：首先是将秋季、早春收集的楠木优树枝条进行嫁接，嫁接方式采用“T”形芽接法进行，砧木采用普通楠木的苗木；
(二)组织培养和试管嫁接幼化：4月中旬至8月底采集楠木优树嫁接材料萌发的嫩枝进行组织培养和试管嫁接幼化，其过程包括以下几个步骤：
第一步、外植体灭菌：采集经嫁接复壮过的楠木优树带腋芽茎段作为外植体，用高锰酸钾溶液将嫩枝表面消毒、清洗干净，然后放在超净工作台上，进行表面灭菌，灭菌时，先用75％的酒精浸泡7～8秒后，快速用无菌水冲洗3～5次，再用0.13％～0.15％的氯化汞溶液浸泡5～6分钟，用无菌水冲洗3～5次，然后用无菌滤纸吸干材料表面的水，再用85μg/mL氨苄青霉素浸泡5分钟；
第二步、初代培养：表面灭菌后的外植体材料经剪切处理后，接种到初代培养基中进行培养，培养条件为室温25～26℃，光照强度3000～4000lux，光照时间每天8:00～20:00，初代培养5～6天后转接到相同培养基继续培养10～12天；
第三步、试管嫁接幼化：切取初代培养萌发的嫩芽作为接穗，以普通楠木为砧木进行无菌嫁接，嫁接方式采用“T”形芽接法进行，嫁接后转接到嫁接幼化培养基中进行培养，培养条件同初代培养，培养10～12天，剪除砧木上的萌芽，继续培养28～30天；
第四步、继代增殖培养：将已经幼化伸长，生长旺盛的楠木优树接穗萌发的嫩芽，剪切长度为2.5～3.0cm带1～2节的茎段，转移至增殖培养基中，进行增殖培养，增殖培养继代周期为30～35天，培养条件为：室温28～29℃，光照强度3000～4000lux,光照时间每天8:00～20:00；
第五步、诱导生根：切取长约3cm粗壮的楠木优树材料幼化的嫩芽，转接在生根培养基中诱导生根，生根培养条件的室温为28～29℃，生根光照时间控制为每天12h，光照强度为2000～3000lux，生根时间为10～12天；
第六步、炼苗和移栽：待楠木试管苗根长至1.5～2.0cm时，进行室内炼苗，炼苗时先将附着在根部的培养基清洗干净，然后栽植到泥炭土和珍珠岩的混合基质中，混合基质中的泥炭土和珍珠岩的比例为3:1，浇透水，覆盖保湿4～5天，30天后将幼苗移栽到口径为12cm的营养钵中，营养钵中装有沙壤土和泥炭土比例为3:1的混合基质，置于塑料大棚壮苗，壮苗过程中，根据需要及时浇水、喷施叶面肥溶液及预防病虫害，大棚壮苗一个月，进行大田移栽。
2.根据权利要求1所述的楠木优树组织培养幼化的方法，其特征在于：所述的(一)材料的嫁接复壮中的嫁接时间是在秋季和早春进行；嫁接方式采用“T”形芽接法，砧木采用普通楠木苗木。
3.根据权利要求1所述的楠木优树组织培养幼化的方法，其特征在于：所述的(二)组织培养和试管嫁接幼化的第二步、初代培养步骤中的初代培养基为：MS+5mg/L(3.0～5.0)6-BA+0.4mg/L(0.4～0.5)NAA，再加入琼脂5.5g/L，蔗糖25g/L，其pH值为6.2～6.5。
4.根据权利要求1所述的楠木优树组织培养幼化的方法，其特征在于：所述的(二)组织培养和试管嫁接幼化的第三步、试管嫁接幼化步骤中的试管嫁接幼化培养基为：MS+(0.3～0.5)mg/LNAA，再加入琼脂5.5g/L，蔗糖浓度为25～30g/L，pH值为6.2～6.5。
5.根据权利要求1所述的楠木优树组织培养幼化的方法，其特征在于：所述的(二)组织培养和试管嫁接幼化的第四步、继代增殖培养步骤中的增殖培养基为：1/2MS+6mg/L(5.0～7.0)6-BA+0.4mg/L NAA，再加入琼脂5.5g/L，蔗糖15～20g/L，pH值为6.2～6.5。
6.根据权利要求1所述的楠木优树组织培养幼化的方法，其特征在于：所述的(二)组织培养和试管嫁接幼化的第五步、诱导生根步骤中的生根培养基为：1/2MS+(0.2～0.3mg/L)NAA+(0.1～0.2mg/L)IBA，再加入琼脂5.5g/L，蔗糖15～20g/L，pH值为6.2～6.5。
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