CN109294924A - 一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法 - Google Patents

一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法 Download PDF

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CN109294924A CN201811147718.8A CN201811147718A CN109294924A CN 109294924 A CN109294924 A CN 109294924A CN 201811147718 A CN201811147718 A CN 201811147718A CN 109294924 A CN109294924 A CN 109294924A
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Abstract

本发明涉及真菌分离培养技术领域，具体涉及一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，包括如下步骤：（1）取橙黄玉凤兰植株，洗净，风干；（2）将植株分解为主茎、叶片、根和块茎，并剪切成小段；（3）将小段用乙醇浸泡处理；（4）再用次氯酸钠浸泡处理；（5）吸干水分；（6）将根块、主茎、块茎和叶片分成小片，然后分别接种于含硫酸链霉素的PDA培养基中；（7）置于恒温培养箱中，培养。本发明的分离培养方法使用PDA培养基，采用硫酸链霉素选择出内生真菌，并在分离培养基上培养数日后，通过肉眼观察菌落形态进行真菌菌落形态观察，确定了菌株最适培养基和培养时间，为今后橙黄玉凤兰内生真菌的大批量培养奠定了基础。

Description

一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法
技术领域
本发明涉及真菌分离培养技术领域，具体涉及一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法。
背景技术
兰花是被子植物中最多样化的一个科，包括许多重要的药用植物和观赏花类。在自然条件下，只有与某些真菌形成共生关系，兰花才能正常生长。由于其经济价值及其与真菌的特殊生物学关系，近年来，兰花已成为研究植物与真菌之间的间作关系、真菌多样性和特异性的重要材料。内生真菌可以与植物形成共生关系，成为一个互惠共生有机体。最近，一些学者提出了进化论假说:以植物和动物宿主形成共生微生物群体的多样性之间的关系在宿主进化适应环境压力和营养的发挥了重要作用，例如，内生真菌能促进宿主植物的生长，可以添加主机抵抗环境压力。因此，作为一种非常特殊的真菌群落，内生真菌群是真菌多样性的重要组成部分。
而现有技术中未见相关橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法的报道。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，包括如下步骤：
（1）取橙黄玉凤兰植株，冲洗干净植物表面的沙土，用滤纸吸干植株表面的水分，置于有滤纸的干净培养皿中自然风干，然后转移至超净工作台；
（2）将风干后的植株分解为主茎、叶片、根和块茎，并剪切成3～4cm长的小段；
（3）将剪切后的小段用质量分数为65%-75%的乙醇浸泡处理1～3min；
（4）将乙醇浸泡后的小段取出，再用质量分数为2%-3%的次氯酸钠浸泡处理1～2min；
（5）将次氯酸钠浸泡后的小段取出，置于无菌吸水纸上吸干水分；
（6）将吸干水分后的根块分为面积为0.5～1.0cm2的小薄片，主茎和块茎剪成0.5～1.0cm长的小段，叶片切成面积为0.5～1.0cm2的小片，然后分别接种于含20-30μg/mL硫酸链霉素的PDA培养基中；
（7）将接种后的PDA培养基置于27-29℃恒温培养箱中，培养。
优选的，所述步骤（7）之后还包括步骤（8）内生真菌的纯化培养：当发现从组织块中长出菌丝体时，采用尖端菌丝挑取法，立即把菌丝体转移到纯化培养基平板上进行纯化培养，直到得到纯净无污染的菌落。
优选的，所述步骤（8）之后还包括步骤（9）内生真菌的形态学鉴定：将分离纯化得到的菌种在分离培养基上培养数日后，通过肉眼观察菌落形态进行真菌菌落形态观察并记录；然后采用直接挑取制片法，在显微镜下进行真菌形态观察，根据菌核的特征及结构，孢子着生部位及形态、大小、排列方式和有无隔膜显微特征，进行初步鉴定。
优选的，所述步骤（8）之后还包括步骤（10）对橙黄玉凤兰内生真菌进行PCR鉴定，具体包括如下步骤：
A、菌株的培养：取橙黄玉凤兰内生真菌的菌丝进行培养；
B、DNA提取：采用CTAB法提取菌体DNA；
C、电泳检测：将提取的样品DNA进行电泳检测；
D、PCR扩增：将提取的样品DNA和设计好的引物配制成PCR反应体系，进行PCR扩增；
E、电泳检测：对PCR扩增产物进行电泳检测；
F、序列分析：将条带清晰、检测合格的PCR扩增产物进行测序，并进行序列分析。
优选的，所述步骤A具体为：用无菌接种针挑取橙黄玉凤兰内生真菌的菌丝于盛有4-6mLPDB培养基的摇菌管中，于27-29℃、140-160rpm条件下振荡培养5～7d。
本发明通过采用震荡培养，能够使菌丝内的活性增强，增加溶解氧含量。
优选的，所述步骤B包括如下步骤：
B1、将菌体用接种环挑出来放进研钵，加入液氮，然后加入400-600μL的CTAB溶液，再加入8-12μL蛋白酶K进行研磨；研磨后将液体装入离心管，并放入63-67℃水浴，保温0.8-1.2h；蛋白酶K能对蛋白质进行降解。
B2、冷却后，加入400-600μL的氯仿/异戊醇混合液，混匀，于11000-13000rpm转速下离心13-17min；吸取上清液，装入一新的离心管，再加入400-600μL的氯仿/异戊醇混合液，混匀，于11000-13000rpm转速下离心13-17min；
B3、吸取上清液，装入一新的离心管中，加入1.5-2.5倍体积的无水乙醇，混匀后置于-75～-85℃静置3～10min，然后于11000-13000rpm转速下离心8-12min，弃上清；向离心管中加入质量分数为70%-80%的乙醇洗涤1次，然后于11000-13000rpm转速下离心8-12min，置于吸水纸上倒置晾干8-12min；
B4、加入80-120μL的ddH2O溶解，得样品DNA，置于冰盒中，或放入-15～-25℃冰箱中保存；
所述步骤B1中，CTAB溶液需在使用前加入1.5%-2.5%体积的巯基乙醇；巯基乙醇能够打开蛋白质的结构，二硫键被打开后可以使蛋白质的四级或三级结构被破坏。
所述步骤B2中，氯仿/异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为22-26:1。本发明通过氯仿和异戊醇能够抽取DNA，氯仿的作用是使蛋白质变性，并加速有机相与液相分层；异戊醇的作用是调整极性，能降低分子表面张力，使氯仿更高效的令蛋白质变性；两者结合能够使提取DNA的方法变得简单方便。
优选的，所述步骤C包括如下步骤：
C1、称取琼脂糖3.0～5.0g，量取30-50mL的1×TBE，加到150mL锥形瓶中，然后微波加热1.5-2.5min，取出后加入1.5-2.5μL的GoldView进行染色，待温度适中后倒胶；
C2、点样：6μL样品混合2.5μL的6×Loading Buffer；Maker 6μL，电压为100V条件下电泳30-40min，在凝胶成像系统中拍照。
GoldView是一种可代替溴化乙锭(EB)的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测DNA分子时，GoldView与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而且也可用于染RNA。
优选的，所述步骤D中，引物的核苷酸序列如下：
Its4：5´TCCTCCGCTTATTGATATGC3´
Its5：5´GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3´。
优选的，所述步骤D中，PCR反应体系以23μL计包括：DNA模板1μL、2个引物各1μL、Mix10μL和ddH2O10μL；所述步骤D中，PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s、55℃退火40s、72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸5min。
优选的，所述步骤E具体为：取5μLPCR扩增产物采用琼脂糖浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，Maker 6μL，电压为100V条件下电泳30-40min，在凝胶成像仪下观察结果。
本发明的有益效果在于：本发明的分离培养方法使用PDA培养基，采用硫酸链霉素选择出内生真菌，并在分离培养基上培养数日后，通过肉眼观察菌落形态进行真菌菌落形态观察，确定了菌株最适培养基和培养时间，为今后橙黄玉凤兰内生真菌的大批量培养奠定了基础。
附图说明
图1是本发明的橙黄玉凤兰内生真菌第一次拍照形态图。
图2是本发明的橙黄玉凤兰内生真菌第一次镜检结果图。
图3是本发明的橙黄玉凤兰内生真菌第二次拍照形态图。
图4是本发明的橙黄玉凤兰内生真菌第二次镜检结果图。
图5是本发明选取的橙黄玉凤兰内生真菌在PDA培养基上的菌落形态图。
图6是本发明引物为通用引物Its1和Its4时的电泳结果图。
图7是本发明引物为通用引物ITS4和ITS5时的电泳结果图。
图8-11是本发明构建的系统发育树图。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1-11对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
本发明的研究材料橙黄玉凤兰植株为2018年3月11日于惠州市林科所带回的植株，连同土层带回实验室培养，用于后续相关试验。
本发明采用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）的配方为：马铃薯200g、琼脂20g、葡萄糖20g和蒸馏水1000mL；马铃薯葡萄糖水培养基（PDB）的配方为：马铃薯200g、琼脂20g和蒸馏水1000mL。
本发明所采用的试剂制备如下：
（1）2×CTAB提取液(pH8.0)：2%CTAB，1.4mol NaCl，0.02mol EDTA，0.1mol Tris-cl，0.2%巯基乙醇。即称取CTAB 2g加蒸馏水40mL，加1mol Tris-cl(pH8.0)10mL，0.5mol EDTA(pH8.0)4mL和5mol NaCl 28mL，待CTAB溶解后用蒸馏水定容到100mL(提取前加入2%的巯基乙醇，100mL加2mL巯基乙醇)；
（2）1mol Tris-cl(pH8.0)100 mL:12.11g Tris碱；ddH2O，80mL；HCl，4.9 mL三者混匀充分溶解后，滴加浓盐酸调pH至8.0，定容至100mL；
（3）0.5mol EDTA(pH8.0)100mL：在80mL水中加入18.01g EDTANa2.2H2O搅拌溶解，用NaOH调pH至8.0(约2gNaOH颗粒)，定容至100mL；
（4）5mol NaCl 100mL：称取29.22g NaCl，用ddH2O定容到100mL；
（5）5×TBE：54gTris碱；27.5g硼酸；20mL 0.5mol EDTA；采用ddH2O溶解混匀，NaOH调pH至8.0，溶液体积1L。
实施例1 内生真菌的分离培养及纯化培养
一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，包括如下步骤：
（1）取橙黄玉凤兰植株，冲洗干净植物表面的沙土，用滤纸吸干植株表面的水分，置于有滤纸的干净培养皿中自然风干，然后转移至超净工作台；
（2）将风干后的植株分解为主茎、叶片、根和块茎，并剪切成3～4cm长的小段；
（3）将剪切后的小段用质量分数为70%的乙醇浸泡处理1～3min；
（4）将乙醇浸泡后的小段取出，再用质量分数为2.5%的次氯酸钠浸泡处理1～2min；
（5）将次氯酸钠浸泡后的小段取出，置于无菌吸水纸上吸干水分；
（6）将吸干水分后的根块分为面积为1.0cm2的小薄片，主茎和块茎剪成0.5～1.0cm长的小段，叶片切成面积为0.5～1.0cm2的小片，然后分别接种于含25μg/mL硫酸链霉素的PDA培养基中；
（7）将接种后的PDA培养基置于28℃恒温培养箱中，培养。
内生真菌的纯化培养：定期检查，当发现从组织块中长出菌丝体时，采用尖端菌丝挑取法，立即把菌丝体转移到纯化培养基平板上进行纯化培养，直到得到纯净无污染的菌落。
实施例2 内生真菌的形态学鉴定
将分离纯化得到的菌种在分离培养基上培养数日后，通过肉眼观察菌落形态进行真菌菌落形态观察并记录；然后采用直接挑取制片法，在显微镜下进行真菌形态观察，根据菌核的特征及结构，孢子着生部位及形态、大小、排列方式和有无隔膜显微特征，进行初步鉴定。
依据菌落形态及显微结构特征，对内生真菌进行分类。第一次第拍照及镜检结果分别如图1、2所示，第二次拍照及镜检结果分别如图3、4所示。其中，第1、2次时间分别为2018年4月20日和2018年6月11日，两次镜检的原植株生长阶段不同，组织块分离后有所不同。后续分子生物学鉴定实验采用的是第二次实验中的6个菌种，PDA培养基上菌落形态见如图5所示。
对 6 种内生真菌的菌落形态、菌落正反面颜色、质地、有无突起、菌落边缘以及菌丝形态学特征，孢子的形态、大小、排列方式、有无隔膜等显微特征进行的观察描述如表1所示。
实施例3 分子生物学鉴定
一种橙黄玉凤兰内生真菌的PCR鉴定方法，包括如下步骤：
A、菌株的培养：取橙黄玉凤兰内生真菌的菌丝进行培养；
B、DNA提取：采用CTAB法提取菌体DNA；
C、电泳检测：将提取的样品DNA进行电泳检测；
D、PCR扩增：将提取的样品DNA和设计好的引物配制成PCR反应体系，进行PCR扩增；
E、电泳检测：对PCR扩增产物进行电泳检测；
F、序列分析：将条带清晰、检测合格的PCR扩增产物进行测序，并进行序列分析。
优选的，所述步骤A具体为：用无菌接种针挑取橙黄玉凤兰内生真菌的菌丝于盛有5mLPDB培养基的摇菌管中，于28℃、150rpm条件下振荡培养5～7d。
优选的，所述步骤B包括如下步骤：
B1、将菌体用接种环挑出来放进研钵，加入液氮，然后加入500μL的CTAB溶液，再加入10μL蛋白酶K进行研磨；研磨后将液体装入离心管，并放入65℃水浴，保温1h；
B2、冷却后，加入500μL的氯仿/异戊醇混合液，混匀，于12000rpm转速下离心15min；吸取上清液，装入一新的离心管，再加入500μL的氯仿/异戊醇混合液，混匀，于12000rpm转速下离心15min；
B3、吸取上清液，装入一新的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，混匀后置于-80℃静置3～10min，然后于12000rpm转速下离心10min，弃上清；向离心管中加入质量分数为70%-80%的乙醇洗涤1次，然后于12000rpm转速下离心10min，置于吸水纸上倒置晾干10min；
B4、加入100μL的ddH2O溶解，得样品DNA，置于冰盒中，或放入-20℃冰箱中保存。
所述步骤B1中，CTAB溶液需在使用前加入2%体积的巯基乙醇。
所述步骤B2中，氯仿/异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为22-26:1。
所述步骤C包括如下步骤：
C1、称取琼脂糖3.0～5.0g，量取30-50mL的1×TBE，加到150mL锥形瓶中，然后微波加热2min，取出后加入2μL的GoldView进行染色，待温度适中后倒胶；
C2、点样：6μL样品混合2.5μL的6×Loading Buffer；Maker 6μL，电压为100V条件下电泳35min，在凝胶成像系统中拍照。
所述步骤D中，引物的核苷酸序列如下：
Its4：5´TCCTCCGCTTATTGATATGC3´
Its5：5´GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3´。
引物的设计：
Its1的核苷酸序列为 5´TCCGTAGGTGAACCTGCGG3´
Its4的核苷酸序列为 5´TCCTCCGCTTATTGATATGC3´
Its5的核苷酸序列为 5´GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3´。
引物采用通用引物Its1和Its4、Its4和Its5，电泳检测结果分别如图6、7所示。由图6、7可得出该橙黄玉凤兰内生真菌适用的引物为通用引物ITS4和ITS5。
所述步骤D中，PCR反应体系以23μL计包括：DNA模板1μL、2个引物各1μL、Mix10μL和ddH2O10μL。
所述步骤D中，PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s、55℃退火40s、72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸5min。
所述步骤E具体为：取5μLPCR扩增产物采用琼脂糖浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，Maker 6μL，电压为100V条件下电泳35min，在凝胶成像仪下观察结果。
所述步骤F具体为：将条带清晰、检验合格的PCR产物送华大基因公司测序，对获得的ITS序列通过GenBank数据库搜索同源序列并选出与该序列相关性较高的核酸序列进行分析，利用Mega 7.0通过邻接法(NeighborJoining)聚类系统发育分析，最结合形态特征明确菌株的分类地位。
将分离到 6株内生真菌的 ITS 序列用 BLAST搜索比对，并与Gen Bank的相关参考序列进行系统发育分析，从橙黄玉凤兰分离到的可培养内生真菌6株分属2纲、3目、2属，分别为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）、绿木霉（Trichoderma virens）、茄腐镰孢（Fusarium solani），采用 NeighborJoining 方法构建系统发育树(图 8-11) 。
如表1可知K1为棘胞木霉，与KM386096.1Trichoderma asperellum的相似性为100%；K2为绿木霉，与KY800341.1Trichoderma virens的相似性为98%；G1为绿木霉，与KY800341.1Trichoderma virens的相似性为80%；Z1为绿木霉，与EU680959.1Hypocreavirens的相似性未知；Z2为茄腐镰孢，与KF918581.1Fusarium solani的相似性为98%；Y1为茄腐镰孢，与KF897909.1Fusarium solani的相似性为98%。
从上述实验结果可以看出：
（1）内生菌在植物体中的分布特点是普遍性、多样性。目前所研究过的所有植物中，均发现有内生菌，且其中的内生菌的数量、种类受植物的种类、组织、生长环境、生长阶段、营养情况及植物与内生菌两者的基因型等多种因素影响。
本实验再一次证明了同一植株，不同器官的内生真菌组成不同，实验中分别选取橙黄玉凤兰的不同部位，分别是块茎、根、主茎和叶片，从表1的结果可以证实同一植株不同器官生长着不同的内生真菌。
（2）内生真菌可通过多种途径侵染宿主植物，可渗入植物叶片的外表皮，也可以分解植物表皮细胞壁或通过各种自然开口（包括侧根发生处、气孔、水孔等）或伤口等进入植物。对橙黄玉凤兰而言，内生真菌可以通过块茎、根、主茎和叶片等不同途径进入，且通过表1可知，主茎与块茎有着同样的内生真菌绿木霉，主茎与叶片有同样的内生菌茄腐镰孢，块茎和根也有分属于同一个链孢霉科的内生真菌。橙黄玉凤兰茎长圆形，肉质。叶条状长圆形，先端渐尖，基部抱茎。结合橙黄玉凤兰不同器官的特征及其是否适合内生菌生长可大致得出内生真菌入侵橙黄玉凤兰的主要途径。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）取橙黄玉凤兰植株，冲洗干净植物表面的沙土，用滤纸吸干植株表面的水分，置于有滤纸的干净培养皿中自然风干，然后转移至超净工作台；
（2）将风干后的植株分解为主茎、叶片、根和块茎，并剪切成3～4cm长的小段；
（3）将剪切后的小段用质量分数为65%-75%的乙醇浸泡处理1～3min；
（4）将乙醇浸泡后的小段取出，再用质量分数为2%-3%的次氯酸钠浸泡处理1～2min；
（5）将次氯酸钠浸泡后的小段取出，置于无菌吸水纸上吸干水分；
（6）将吸干水分后的根块分为面积为0.5～1.0cm2的小薄片，主茎和块茎剪成0.5～1.0cm长的小段，叶片切成面积为0.5～1.0cm2的小片，然后分别接种于含20-30μg/mL硫酸链霉素的PDA培养基中；
（7）将接种后的PDA培养基置于27-29℃恒温培养箱中，培养。
2.根据权利要求1所述的一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，其特征在于：所述步骤（7）之后还包括步骤（8）内生真菌的纯化培养：当发现从组织块中长出菌丝体时，采用尖端菌丝挑取法，立即把菌丝体转移到纯化培养基平板上进行纯化培养，直到得到纯净无污染的菌落。
3.根据权利要求2所述的一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，其特征在于：所述步骤（8）之后还包括步骤（9）内生真菌的形态学鉴定：将分离纯化得到的菌种在分离培养基上培养数日后，通过肉眼观察菌落形态进行真菌菌落形态观察并记录；然后采用直接挑取制片法，在显微镜下进行真菌形态观察，根据菌核的特征及结构，孢子着生部位及形态、大小、排列方式和有无隔膜显微特征，进行初步鉴定。
4.根据权利要求2所述的一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，其特征在于：所述步骤（8）之后还包括步骤（10）对橙黄玉凤兰内生真菌进行PCR鉴定，具体包括如下步骤：
A、菌株的培养：取橙黄玉凤兰内生真菌的菌丝进行培养；
B、DNA提取：采用CTAB法提取菌体DNA；
C、电泳检测：将提取的样品DNA进行电泳检测；
D、PCR扩增：将提取的样品DNA和设计好的引物配制成PCR反应体系，进行PCR扩增；
E、电泳检测：对PCR扩增产物进行电泳检测；
F、序列分析：将条带清晰、检测合格的PCR扩增产物进行测序，并进行序列分析。
5.根据权利要求4所述的一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，其特征在于：所述步骤A具体为：用无菌接种针挑取橙黄玉凤兰内生真菌的菌丝于盛有4-6mLPDB培养基的摇菌管中，于27-29℃、140-160rpm条件下振荡培养5～7d。
6.根据权利要求4所述的一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，其特征在于：所述步骤B包括如下步骤：
B1、将菌体用接种环挑出来放进研钵，加入液氮，然后加入400-600μL的CTAB溶液，再加入8-12μL蛋白酶K进行研磨；研磨后将液体装入离心管，并放入63-67℃水浴，保温0.8-1.2h；
B2、冷却后，加入400-600μL的氯仿/异戊醇混合液，混匀，于11000-13000rpm转速下离心13-17min；吸取上清液，装入一新的离心管，再加入400-600μL的氯仿/异戊醇混合液，混匀，于11000-13000rpm转速下离心13-17min；
B3、吸取上清液，装入一新的离心管中，加入1.5-2.5倍体积的无水乙醇，混匀后置于-75～-85℃静置3～10min，然后于11000-13000rpm转速下离心8-12min，弃上清；向离心管中加入质量分数为70%-80%的乙醇洗涤1次，然后于11000-13000rpm转速下离心8-12min，置于吸水纸上倒置晾干8-12min；
B4、加入80-120μL的ddH2O溶解，得样品DNA，置于冰盒中，或放入-15～-25℃冰箱中保存；
所述步骤B1中，CTAB溶液需在使用前加入1.5%-2.5%体积的巯基乙醇；
所述步骤B2中，氯仿/异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为22-26:1。
7.根据权利要求4所述的一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，其特征在于：所述步骤C包括如下步骤：
C1、称取琼脂糖3.0～5.0g，量取30-50mL的1×TBE，加到150mL锥形瓶中，然后微波加热1.5-2.5min，取出后加入1.5-2.5μL的GoldView进行染色，待温度适中后倒胶；
C2、点样：6μL样品混合2.5μL的6×Loading Buffer；Maker 6μL，电压为100V条件下电泳30-40min，在凝胶成像系统中拍照。
8.根据权利要求4所述的一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，其特征在于：所述步骤D中，引物的核苷酸序列如下：
Its4：5´TCCTCCGCTTATTGATATGC3´
Its5：5´GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3´。
9.根据权利要求4所述的一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，其特征在于：所述步骤D中，PCR反应体系以23μL计包括：DNA模板1μL、2个引物各1μL、Mix10μL和ddH2O10μL；所述步骤D中，PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s、55℃退火40s、72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸5min。
10.根据权利要求4所述的一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，其特征在于：所述步骤E具体为：取5μLPCR扩增产物采用琼脂糖浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，Maker 6μL，电压为100V条件下电泳30-40min，在凝胶成像仪下观察结果。
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