CN109280681A - 一种红景天苷的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种红景天苷的制备方法。本发明将β‑葡萄糖苷与CoFe2O4颗粒形成交联聚集体，能够有效地催化β‑D‑葡萄糖与酪醇进行反应，进而提高红景天苷的收率，且本发明的制备方法步骤简短、操作简单，易于工业化生产。

Description

一种红景天苷的制备方法
技术领域
本发明属于红景天苷制备领域，具体涉及一种红景天苷的制备方法。
背景技术
红景天苷，化学名为2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-葡萄糖苷，CAS为10338-51-9，是从景天科植物大株红景天的干燥根及根茎或干燥全草中提取的一种化合物，具有预防肿瘤，增强免疫功能，延缓衰老，抗疲劳，抗缺氧，防辐射，双向调节中枢神经，修复保护机体等作用。
目前，红景天苷可从植物中提取红景天苷提取，但提取过程繁琐，提取率较低。另外，红景天苷还可通过化学法和酶催化法来合成；但化学合成法需采用化学试剂，毒性大且对环境不友好。而酶催化合成红景天苷具有反应条件温和，立体选择性高，反应过程简单，环境污染少等特点，显示了一定的优越性。
目前红景天苷的合成大多使用游离β-葡萄糖苷酶，其稳定性差，特别在一些具有较强亲水性的有机溶剂介质反应体系中，会导致游离酶的稳定性和催化活性大幅度下降。申请号201711141952.5的专利申请公开了一种β-葡萄糖苷酶催化剂，使用该催化剂催化β-D-葡萄糖和正丁醇机构进行逆水解反应合成正丁基-β-D-葡萄糖苷，再以正丁基-β-D-葡萄糖苷为糖基供体在β-葡萄糖苷酶催化剂催化下进行转糖苷反应合成红景天苷，产率最高仅为35％，仍然不尽人意。
鉴于此，本发明提供了一种红景天苷的制备方法，以提高红景天苷的收率。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明目的在于提供一种红景天苷的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种红景天苷的制备方法，包括如下步骤：
(1)将β-葡萄糖苷酶加入磷酸盐-柠檬酸缓冲液后，加入聚丙烯酰胺交联的空心CoFe2O4颗粒，振荡后加入沉降剂、戊二醛、硼氢化钠，振荡，320～480rpm离心5～10min，送入到40-45℃的恒温水浴中，保温搅拌1-2小时，出料，收集沉淀，得到β-葡萄糖苷酶交联聚集体；
(2)取β-D-葡萄糖和酪醇，加入溶剂中，加入缓冲液和步骤(1)得到的所述β-葡萄糖苷酶交联聚集体进行反应，得到反应液；
(3)将步骤(2)得到的所述反应液过滤，滤液减压蒸馏，得到粗产品；将所述粗品进行重结晶，得到所述红景天苷。
所述聚丙烯酰胺交联的空心CoFe2O4颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)取1-2重量份的过硫酸铵，加入到其重量20-30倍的去离子水中，搅拌均匀；
(2)取40-45重量份的甲基丙烯酸甲酯，加入到其重量5-8倍的去离子水中，搅拌均匀，送入到反应釜中，通入氮气，调节反应釜温度为60-75℃，保温搅拌3-5小时，出料，冷却，加入300-500重量份的0.8-1mol/l的硝酸铁溶液、200-240重量份的1.7-2mol/l的硝酸钴溶液，搅拌均匀，加入柠檬酸，调节pH为3-4，100-110℃下蒸汽加热至水干，出料，送入到烧结炉中，在500-550℃下煅烧2-3小时，出料冷却，送入到丙酮溶液中，在60-70℃下浸泡100-110分钟，出料，常温干燥，与0.3-0.4重量份的过硫酸钠、20-25重量份的丙烯酰胺、5-7重量份的氯化钙共混，搅拌均匀，加入到混合料重量10-20倍的去离子水中，送入到反应釜中，通入氮气，调节反应釜稳定为70-80℃，保温搅拌3-5小时，出料，将产物送入烘箱中，90-100℃下真空干燥3-5小时，出料冷却，即得所述聚丙烯酰胺交联的空心CoFe2O4颗粒。
在上述制备方法中，作为一种优选实施方式，在所述步骤(1)中，所述β-葡萄糖苷酶与所述聚丙烯酰胺交联的空心CoFe2O4颗粒的质量比为1:0.5-1.2(比如1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.1)。
在上述制备方法中，作为一种优选实施方式，在所述步骤(1)中，所述磷酸盐-柠檬酸缓冲液的pH值为5.0-6.0。
在上述制备方法中，作为一种优选实施方式，在所述步骤(2)中，所述溶剂为二氧六环、四氢呋喃、二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。
在上述制备方法中，作为一种优选实施方式，在所述步骤(2)中，所述β-D-葡萄糖和所述酪醇的摩尔比为1:1-1.5(比如1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4)。
在上述制备方法中，作为一种优选实施方式，在所述步骤(2)中，所述缓冲液为磷酸盐-柠檬酸缓冲液、柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液、磷酸二氢钠-磷酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸缓冲液；优选地，所述缓冲液的pH值为5.0-6.0。
在上述制备方法中，作为一种优选实施方式，在所述步骤(2)中，所述反应温度为25-70℃(比如30℃、40℃、50℃、60℃)，反应时间为6-16h(比如7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h)。
在上述制备方法中，作为一种优选实施方式，在所述步骤(3)中，所述重结晶溶剂为正己烷-甲醇或正己烷-乙醇。
本发明制备红景天苷的原理如下：首先，以戊二醛作为交联剂，二氧六环作为沉降剂，并以铁磁性材料为核心，并利用其共价键结合酶分子，进而形成具有一定磁性核的固定化酶，进一步提高了β-葡萄糖苷酶的固定化稳定性，本发明选用的磁性材料为空心的CoFe2O4颗粒，其不仅可以为固定化酶提供更多稳定的附着位点，且可以扩大对β-葡萄糖苷酶的固定化容量，从而进一步提高催化效率，增大产率；本发明将得到的空心的CoFe2O4颗粒采用聚丙烯酰胺进行交联改性，在交联过程中引入钙离子进行掺杂，钙离子在水浴温度下对β-葡萄糖苷酶具有很好吸附螯合作用，而通过聚丙烯酰胺的交联，不仅可以提高钙离子掺杂的稳定性，而且聚丙烯酰胺也具有一定的吸附效果，可以与钙离子起到协同的效果，且聚丙烯酰胺具有很好的絮凝沉降效果，与沉降剂协同，能够促进沉淀率，从而提高β-葡萄糖苷酶交联聚集体的产率；
通过实验发现，当磁性材料CoFe2O4颗粒与本发明的β-葡萄糖苷酶结合，不仅可以高产率地得到的β-葡萄糖苷酶交联聚集体，且以CoFe2O4颗粒为核心形成的β-葡萄糖苷酶交联聚集体分散性好、体积小，催化合成红景天苷时活性高、催化效率高，进而提高了红景天苷的产率；另外，本发明的β-葡萄糖苷酶还耐高温，从而使酶催化反应可以在高温条件下进行，进一步提高了红景天苷的产率。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
目前市面上的β-葡萄糖苷酶主要来源于微生物发酵或从植物中提取，若在生产上直接使用游离酶，由于酶的稳定性低以及酶不能重复利用，而使产品成本升高。由于β-葡萄糖苷酶比较昂贵，采用固定化技术将其固定在载体上反复使用，可以达到简化工艺、降低成本的目的。本发明将β-葡萄糖苷与CoFe2O4颗粒形成交联聚集体，能够有效地催化β-D-葡萄糖与酪醇进行反应，进而提高红景天苷的收率，且本发明的固定化酶交联聚集体具有贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用等多种优点。本发明红景天苷的制备方法步骤简短、操作简单，易于工业化生产。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的解释。
图1是本发明实施例的固定化酶的操作稳定性测试图。
图2是本发明实施例的固定化酶和游离酶的热稳定性比较图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式并非旨在对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定。
以下实施例中使用的西梅籽β-葡萄糖苷酶、黑布林籽β-葡萄糖苷酶从市场购买，其他化学试剂及药品也均为市售产品，未特别标注的仪器为常规仪器。
实施例1
(1)取1g西梅籽β-葡萄糖苷酶，加入到pH值为5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液中，然后加入0.5g聚丙烯酰胺交联的空心CoFe2O4颗粒，振荡后加入适量二氧六环、戊二醛、硼氢化钠，振荡，320rpm离心6min，送入到40℃的恒温水浴中，保温搅拌1小时，出料，收集沉淀，得到1.2g西梅籽β-葡萄糖苷酶交联聚集体；
(2)取β-D-葡萄糖(1mmol，180mg)和酪醇(1.2mmol，165.6mg)，加入10ml二氧六环中，加入pH＝6的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、50mg步骤(1)得到的西梅籽β-葡萄糖苷酶交联聚集体，于60℃反应12h进行反应，得到反应液；
(3)将步骤(2)得到的反应液过滤，滤液减压蒸馏，得到粗产品；将所述粗品采用正己烷-甲醇进行重结晶，得到210mg红景天苷，收率为70％。
实施例2
(1)取0.5g西梅籽β-葡萄糖苷酶，加入到pH值为5.5的磷酸盐-柠檬酸缓冲液中，然后加入0.5g聚丙烯酰胺交联的空心CoFe2O4颗粒，振荡后加入适量二氧六环、戊二醛、硼氢化钠，振荡，360rpm离心8min，送入到45℃的恒温水浴中，保温搅拌1小时，出料，收集沉淀，得到0.8g西梅籽β-葡萄糖苷酶交联聚集体；
(2)取β-D-葡萄糖(2mmol，360mg)和酪醇(2.6mmol，358.8mg)，加入25ml二氧六环中，加入pH＝5的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液、100mg步骤(1)得到的西梅籽β-葡萄糖苷酶交联聚集体，于70℃反应6h进行反应，得到反应液；
(3)将步骤(2)得到的反应液过滤，滤液减压蒸馏，得到粗产品；将所述粗品采用正己烷-甲醇进行重结晶，得到432mg红景天苷，收率为72％。
实施例3
(1)取0.5g黑布林籽β-葡萄糖苷酶，加入到pH值为6.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液中，然后加入0.3g聚丙烯酰胺交联的空心CoFe2O4颗粒，振荡后加入适量二氧六环、戊二醛、硼氢化钠，振荡，400rpm离心8min，送入到42℃的恒温水浴中，保温搅拌1小时，出料，收集沉淀，得到0.6g黑布林籽β-葡萄糖苷酶交联聚集体；
(2)取β-D-葡萄糖(0.5mmol，90mg)和酪醇(0.7mmol，96.6mg)，加入10ml二氧六环中，加入pH＝6柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液，20mg步骤(1)得到的黑布林籽β-葡萄糖苷酶交联聚集体，于50℃反应10h进行反应，得到反应液；
(3)将步骤(2)得到的反应液过滤，滤液减压蒸馏，得到粗产品；将所述粗品采用正己烷-乙醇进行重结晶，得到103.5mg红景天苷，收率为69％。
实施例4
(1)取0.5g黑布林籽β-葡萄糖苷酶，加入到pH值为5.5的磷酸盐-柠檬酸缓冲液中，然后加入0.6g聚丙烯酰胺交联的空心CoFe2O4颗粒，振荡后加入适量二氧六环、戊二醛、硼氢化钠，振荡，380rpm离心8min，送入到41℃的恒温水浴中，保温搅拌1.5小时，出料，收集沉淀，得到0.9g黑布林籽β-葡萄糖苷酶交联聚集体；
(2)取β-D-葡萄糖(1mmol，180mg)和酪醇(1.5mmol，207mg)，加入20ml二氧六环中，加入pH＝5.5的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液，40mg步骤(1)得到的黑布林籽β-葡萄糖苷酶交联聚集体，于40℃反应10h进行反应，得到反应液；
(3)将步骤(2)得到的反应液过滤，滤液减压蒸馏，得到粗产品；将所述粗品采用正己烷-乙醇进行重结晶，得到195mg红景天苷，收率为65％。
实施例5
(1)取0.5g黑布林籽β-葡萄糖苷酶，加入到pH值为5.5的磷酸盐-柠檬酸缓冲液中，然后加入0.4g聚丙烯酰胺交联的空心CoFe2O4颗粒，振荡后加入适量二氧六环、戊二醛、硼氢化钠，振荡，380rpm离心8min，送入到44℃的恒温水浴中，保温搅拌2小时，出料，收集沉淀，得到0.6g黑布林籽β-葡萄糖苷酶交联聚集体；
(2)取β-D-葡萄糖(1mmol，180mg)和酪醇(1.2mmol,165.6mg)，加入15ml二氧六环中，加入pH＝6柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液，80mg步骤(1)得到的黑布林籽β-葡萄糖苷酶交联聚集体，于30℃反应10h进行反应，得到反应液；
(3)将步骤(2)得到的反应液过滤，滤液减压蒸馏，得到粗产品；将所述粗品采用正己烷-乙醇进行重结晶，得到177mg红景天苷，收率为68％。
对比例1(不加磁性粒子)
(1)取β-D-葡萄糖(2mmol，360mg)和酪醇(2.6mmol，358.8mg)，加入25ml二氧六环中，加入pH＝5的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液、100mg西梅籽β-葡萄糖苷酶，于50℃反应6h进行反应，得到反应液；
(2)将步骤(1)得到的反应液过滤，滤液减压蒸馏，得到粗产品；将所述粗品采用正己烷-甲醇进行重结晶，得到252mg红景天苷，收率为42％。
对比例2(加入普通的磁性粒子)
(1)取0.5g黑布林籽β-葡萄糖苷酶，加入到pH值为5.5的磷酸盐-柠檬酸缓冲液中，然后加入0.4gCoFe2O4颗粒，振荡后加入适量二氧六环、戊二醛、硼氢化钠，振荡，380rpm离心8min，收集沉淀，得到0.6g黑布林籽β-葡萄糖苷酶交联聚集体；
(2)取β-D-葡萄糖(1mmol，180mg)和酪醇(1.2mmol,165.6mg)，加入15ml二氧六环中，加入pH＝6柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液，80mg步骤(1)得到的黑布林籽β-葡萄糖苷酶交联聚集体，于30℃反应10h进行反应，得到反应液；
(3)将步骤(2)得到的反应液过滤，滤液减压蒸馏，得到粗产品；将所述粗品采用正己烷-乙醇进行重结晶，得到177mg红景天苷，收率为47％。
对比例3(加入没交联聚丙烯酰胺的空心磁性粒子)
(1)取0.5g黑布林籽β-葡萄糖苷酶，加入到pH值为5.5的磷酸盐-柠檬酸缓冲液中，然后加入0.4g空心CoFe2O4颗粒，振荡后加入适量二氧六环、戊二醛、硼氢化钠，振荡，380rpm离心8min，收集沉淀，得到0.6g黑布林籽β-葡萄糖苷酶交联聚集体；
(2)取β-D-葡萄糖(1mmol，180mg)和酪醇(1.2mmol,165.6mg)，加入15ml二氧六环中，加入pH＝6柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液，80mg步骤(1)得到的黑布林籽β-葡萄糖苷酶交联聚集体，于30℃反应10h进行反应，得到反应液；
(3)将步骤(2)得到的反应液过滤，滤液减压蒸馏，得到粗产品；将所述粗品采用正己烷-乙醇进行重结晶，得到177mg红景天苷，收率为59％。
所述空心CoFe2O4颗粒的制备方法为：
(1)取1重量份的过硫酸铵，加入到其重量20倍的去离子水中，搅拌均匀；
(2)取40重量份的甲基丙烯酸甲酯，加入到其重量5-8倍的去离子水中，搅拌均匀，送入到反应釜中，通入氮气，调节反应釜温度为60-75℃，保温搅拌3-5小时，出料，冷却，加入300重量份的0.8mol/l的硝酸铁溶液、200重量份的1.7-2mol/l的硝酸钴溶液，搅拌均匀，加入柠檬酸，调节pH为3，100℃下蒸汽加热至水干，出料，送入到烧结炉中，在500℃下煅烧2小时，出料冷却，送入到丙酮溶液中，在60℃下浸泡100分钟，出料，90℃下真空干燥3小时，出料冷却，即得空心CoFe2O4颗粒。
试验例：
酶活力的测定：取酶液1.0mL(1mg/mL)或固定化酶0.2g置于试管中，加入pH5.0醋酸缓冲溶液0.5mL和0.5mL栀子苷标准溶液(1mg/mL)；游离酶和固定化酶分别在50℃和60℃恒温反应30min。游离酶酶解反应结束后应立即沸水浴10min，使酶失活。分别立即取上清液0.5mL，加入0.5mL蒸馏水和1mLDNS试剂，沸水浴5min，水冲洗试管使反应液迅速冷却，定容至10mL，测吸光值OD540nm。以加热灭活的同量游离酶和固定化酶作空白对照。酶活力定义：在上述条件下，每一个小时内水解产生1μmol葡萄糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。相对酶活力以最高酶活为100％计算。
1.固定化酶的稳定性实验
将固定化酶(β-葡萄糖苷酶交联聚集体)于4℃冰箱密闭保存，每隔5d定时取样，测定固定化酶的酶活力。再将第一次反应过的固定化酶用醋酸缓冲液洗净，再次在相同条件进行酶解反应，如此重复5次，测定每次固定化酶的酶活力。
表1固定化酶的储存稳定性
从表1可以看出，固定化酶的酶活力30d内都保持在较高的水平内，可以4℃下贮藏，固定化β-葡萄糖苷酶的酶活力在一个月内保持稳定，说明该固定化酶的稳定性较好。
2.固定化酶的操作稳定性
进行酶解反应，分别在相同条件下连续进行20批次操作，测定其酶活力，以第一批次酶活力作为100％，计算相对活力，结果如图1所示。
由图1可知，固定化酶具有良好的操作稳定性，在连续使用18个批次后，其相对酶活仍高于90％，在连续使用20个批次后其相对酶活仍在85％以上，显示出了良好的工业化应用前景。
3.固定化酶和游离酶的热稳定性比较
将固定化酶和游离酶于不同温度下(30-80℃)保温1h，在各自反应最适温度和最适pH下测定剩余酶活力，以各自的最高酶活力为100％，结果如图2所示。
结果如图2所示，固定化酶的热稳定性相对于游离酶有显著提升，在70℃处理60min后，固定化酶仍保持高于85％的相对酶活；而游离酶在50℃以下比较稳定，当温度高于50℃时，相对酶活力开始大幅度下降。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本发明所附权利要求书所限定的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种红景天苷的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将β-葡萄糖苷酶加入磷酸盐-柠檬酸缓冲液后，加入聚丙烯酰胺交联的空心CoFe2O4颗粒，振荡后加入沉降剂、戊二醛、硼氢化钠，振荡，320～480rpm离心5～10min，送入到40-45℃的恒温水浴中，保温搅拌1-2小时，出料，收集沉淀，得到β-葡萄糖苷酶交联聚集体；
(2)取β-D-葡萄糖和酪醇，加入溶剂中，加入缓冲液和步骤(1)得到的所述β-葡萄糖苷酶交联聚集体进行反应，得到反应液；
(3)将步骤(2)得到的所述反应液过滤，滤液减压蒸馏，得到粗产品；将所述粗品进行重结晶，得到所述红景天苷。
2.根据权利要求1所述的一种红景天苷的制备方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺交联的空心CoFe2O4颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)取1-2重量份的过硫酸铵，加入到其重量20-30倍的去离子水中，搅拌均匀；
(2)取40-45重量份的甲基丙烯酸甲酯，加入到其重量5-8倍的去离子水中，搅拌均匀，送入到反应釜中，通入氮气，调节反应釜温度为60-75℃，保温搅拌3-5小时，出料，冷却，加入300-500重量份的0.8-1mol/l的硝酸铁溶液、200-240重量份的1.7-2mol/l的硝酸钴溶液，搅拌均匀，加入柠檬酸，调节pH为3-4，100-110℃下蒸汽加热至水干，出料，送入到烧结炉中，在500-550℃下煅烧2-3小时，出料冷却，送入到丙酮溶液中，在60-70℃下浸泡100-110分钟，出料，常温干燥，与0.3-0.4重量份的过硫酸钠、20-25重量份的丙烯酰胺、5-7重量份的氯化钙共混，搅拌均匀，加入到混合料重量10-20倍的去离子水中，送入到反应釜中，通入氮气，调节反应釜稳定为70-80℃，保温搅拌3-5小时，出料，将产物送入烘箱中，90-100℃下真空干燥3-5小时，出料冷却，即得所述聚丙烯酰胺交联的空心CoFe2O4颗粒。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述β-葡萄糖苷酶选自西梅籽β-葡萄糖苷酶或黑布林籽β-葡萄糖苷酶，所述沉降剂为二氧六环。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述β-葡萄糖苷酶与所述聚丙烯酰胺交联的空心CoFe2O4颗粒的质量比为1:0.5-1.2。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述磷酸盐-柠檬酸缓冲液的pH值为5.0-6.0。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述溶剂为二氧六环、四氢呋喃、二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述β-D-葡萄糖和所述酪醇的摩尔比为1:1-1.5。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述缓冲液为磷酸盐-柠檬酸缓冲液、柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液、磷酸二氢钠-磷酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸缓冲液；优选地，所述缓冲液的pH值为5.0-6.0。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述反应温度为25-70℃，反应时间为6-16h。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述重结晶溶剂为正己烷-甲醇或正己烷-乙醇。
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