CN109280098A - 一种肝素钠的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肝素钠的制备方法。该方法包括下述步骤：1)离解：按照水∶猪小肠粘膜的重量比为4～5∶1向猪小肠粘膜内加入水，并加入盐使其溶液盐度为5度，加入碱调节pH值至9，搅拌升温至55℃，保温30分钟后，按照猪小肠粘膜∶碱性蛋白酶2709的重量比为2000～3000∶1向反应罐内加入碱性蛋白酶2709，保温2小时后，升温至85℃，即行过滤；2)将步骤1)所得的滤液经吸附、洗脱、沉淀过滤、烘干后制得肝素钠。本发明采用盐解和酶解联合工艺彻底使肝素从肠粘膜细胞中解离出来，从而完全提取，在现有技术工艺基础上，提高了约三分之一的单位产值，而增加的成本不到增加产值部分的1％。

Description

一种肝素钠的制备方法

技术领域

本发明属于生化行业领域，具体地说，涉及一种肝素钠的制备方法。

背景技术

肝素钠是肝素的钠盐形式产物。肝素广泛存于动物体液及组织中。在动物体内一般肝素与蛋白结合形成蛋白质-多糖复合物而存在。市面上所用肝素绝大多数是从猪、牛的小肠粘膜及肺提取的。肝素的结构式一般认为如下：

我们所见肝素多是由多个四糖单元构成的一类肝素化合物，从猪肠粘膜及肺提取的高活性肝素其分子量一般在3000-30000之间。

肝素的用途非常广泛，主要用于抗血凝、抗血栓、抗细胞衰老、抗肿瘤转移、抗病毒、抗酶这几大方面。

由于是生物制剂，其高效、多效、低附作用备受人们青睐。从最开始开发出的单一药品，发展到现在的多个药物，原料药物肝素钠也从刚开始产的2000元/亿活性单位，发展到现在的40000元/亿活性单位。

自从八十年代四川大学生物系肝素课题组推广盐解离交工艺从猪肠粘膜里提取肝素钠以来，人们一般都需要3500条以上猪的肠粘膜才能产1亿活性单位。

九十年代人们采用酶解离交工艺生产肝素一般需2500付小肠粘膜产1亿活性单位。

中国专利01108278.X也公开了一种酶解法生产肝素钠的工艺，该工艺生产肝素钠一般需1800～2000根猪小肠粘膜产1亿活性单位。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种肝素钠的制备方法，该方法能解决单纯性盐解和单纯性酶解不能使肝素钠从肠粘膜细胞中彻底释放出来的问题，采用盐解和酶解联合工艺彻底使肝素从肠粘膜细胞中解离出来，从而完全提取。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种肝素钠的制备方法，包括下述步骤：

1)离解：按照水∶猪小肠粘膜的重量比为4～5∶1向猪小肠粘膜内加入水，并加入盐使其溶液盐度为5度，加入碱调节PH值至9，搅拌升温至55℃，保温30分钟后，按照猪小肠粘膜∶碱性蛋白酶2709的重量比为2000～3000∶1向反应罐内加入碱性蛋白酶2709，保温2小时后，升温至85℃，即行过滤；

2)将步骤1)所得的滤液经吸附、洗脱、沉淀过滤、烘干后制得肝素钠。

具体地，所述吸附为按每公斤猪小肠粘膜加20g购于上海(RMHS)罗蒙哈斯分公司的98型强碱性阴离子交换树脂在55℃时吸附6～8小时。

所述洗脱为将吸附好肝素钠的树脂用盐度10～14度的水溶液洗脱。

所述洗脱时间为每次1小时，共二次。

所述沉淀过滤为向洗脱液加入重量浓度95～100％的乙醇，调节溶液酒精浓度按酒精计测为40～45度，混匀，沉淀24小时即过滤，压干。此处重量浓度95～100％的乙醇可以是工业酒精。

所述烘干为将沉淀过滤后的肝素钠在65～75℃烘干即可。

所述碱为NaOH。

所述水∶猪小肠粘膜的重量比为4～5∶1。

本发明的工艺方法是比较过盐解离交、酶解离交、盐解络合沉淀、细菌解离络合沉淀工艺，及盐解酶解离交联合工艺后，从中选择确立最理想、最具操作性、产值最高的盐解、酶解联合离交工艺。经试验达到每月生产最大规模用80万条猪的肠粘膜生产肝素钠，已稳定达到1300付小肠生产1亿活性单位肝素钠。达到和稳定此收率，是一个复杂的系统工程。本发明经过长期生产性工艺研究和实验，完善了整个工艺体系，这其中一部分是发明性的，更多部分是整个工艺理想参数的新发现。采用上述工艺参数，可以很好的达到和稳定此收率。

综上，本发明的有益效果是：

1、在现有技术工艺基础上，提高了约三分之一的单位产值，而增加的成本仅为增加产值部分的1％都不到，此三分之一产值几乎全是纯利润(如：2000付肠粘膜产1亿肝素钠，每付产值仅为20元，而1300付产1亿，则每付小肠产值为33.3元，每付增加产值13.3元，而辅料消耗仅为每付多耗不到0.2元)，且产品纯度高，非活性小分子肝素也被回收利用了(此类肝素主要用于抗血栓)。

2、采用85度高温灭活酶，解决了离子交换树脂的毒化问题，保障了工业循环大生产的正常进行。

具体实施方式

实施例1：

本发明的目的在于解决单纯性盐解和单纯性酶解不能使肝素钠从肠粘膜细胞中彻底释放出来即用盐解和酶解联合工艺彻底使肝素从肠粘膜细胞中解离出来，从而完全提取的问题。以及发现了工业性规模生产的更多客观性生产参数。

本发明具体步骤如下：

试验前先对所用器具，试剂，耗材进行高压灭菌；

1)离解：按照水∶猪小肠粘膜的重量比为4～5∶1向猪小肠粘膜内加入水，并加入盐使其液盐度为5度，加入NaOH调节PH值至9，搅拌升温至55℃，保温30分钟后，按每公斤猪小肠粘膜加0.5g碱性蛋白酶2709至反应罐内，保温2小时后，升温至85℃，即行过滤；

2)将步骤1)所得的滤液按每公斤猪小肠粘膜加20g98型强碱性阴离子交换树脂在55℃时吸附6～8小时；

3)将上述吸附好肝素钠的树脂用盐度10～14度的水溶液洗脱，洗脱时间为每次1小时，共二次；

4)向洗脱液加入工业酒精使得溶液酒精浓度按酒精计测为40～45度(酒精含量60％～70％)，混匀，沉淀24小时即过滤，压干；

5)将沉淀过滤后的肝素钠在65～75℃烘干即为市售90以上活性单位/毫克的肝素钠粗品。

在盐解的参数离解液中加入碱性蛋白每2709型，从而使盐解和酶解相结合而达到肝素彻底解离，附生产性实验对比记录如下：

生产性实验对比记录表

从上表可看出盐解三罐其平均折合需2122付离解出1亿活性单位。酶解三罐其平均折合需1873付才能解离出1亿活性单位肝素。盐解酶解联合工艺三罐其平均折合需1166付才能解离出1亿活性单位肝素。

上表对比为规模化生产性实验对比记录，此数据的可靠件远远超出实验室所作的对比实验数据，因为实验室所作数据其系统误差会大些。

从上面各一天盐解、酶解、盐解与酶解联合工艺可以看出，盐解与酶解的联合工艺比任何一种单纯性解离工艺都彻底得多，离解率高得多，最终产品收率映证了检测结果正确。

实施例2：

(1)、在2000升的反应罐内抽400付猪小肠粘膜和水至占90％的空间，加盐120公斤、加碱调节PH值至9，升温至55℃，保温30分钟后，加碱性蛋白酶(2709型)1000克，保温2小时后，再继续升温到85℃，过滤冷却至55℃左右。

(2)、在55℃液中加入碱性树脂98型8000克，搅拌吸附8小时，过滤洗尽树脂。

(3)、加树脂一倍量的15度盐水，洗脱二次，每次1小时，将上述洗脱水混在一起。

(4)、在上洗脱液中加入工业酒精使酒精浓度为45度，静置24小时，将下层沉淀用涤纶布过滤干，在65-75℃的热水浴中烘干即为纯度90以上活性单位/毫克肝素钠产品。

Claims (2)

1.一种肝素钠的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)离解：

按照水∶猪小肠粘膜的重量比为4～5∶1向猪小肠粘膜内加入水，并加入盐使其溶液盐度为5度，加入碱调节PH值至9，搅拌升温至55℃，保温30分钟后，按照猪小肠粘膜∶碱性蛋白酶2709的重量比为2000～3000∶1向反应罐内加入碱性蛋白酶2709，保温2小时后，升温至85℃，即行过滤；

2)吸附；

3)洗脱：将吸附好肝素钠的树脂用盐度10～14度的水溶液洗脱，且洗脱时间为每次1小时，共二次；

4)沉淀过滤：向洗脱液加入重量浓度95～100％的乙醇，调节溶液酒精浓度按酒精计测为40～45度，混匀，沉淀24小时即过滤，压干；

5)烘干：将沉淀过滤后的肝素钠在65～75℃烘干即可。

2.根据权利要求1所述的一种酶解与盐解联合制备肝素钠的方法，其特征在于，所述碱为NaOH。