CN109280037B - 3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物及在制备药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种3‑氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物及在制备药物中的应用，所述3‑氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物，显示出对中枢神经系统的作用，特别是对5‑HT1A受体选择性高亲和作用，而对多巴胺D1和D2受体、肾上腺素能受体α1和α2、SERT(5‑HT转运体蛋白)、NET(肾上腺素转运体蛋白)、DAT(多巴胺转运体蛋白)等其它中枢相关受体和蛋白无明显亲和作用。体内发挥多种生理和药理作用，可用作药物活性物质，特别是用于抗抑郁、抗焦虑、抗神经性疼痛等疾病，并且还可以用作制备其它药物活性化合物的中间体。本发明的化合物，起效快、毒副作用小，能够满足临床应用的需要，为具有如下结构式的化合物或其游离碱或盐：
Description
技术领域
本发明涉及一种3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物以及在制备抗抑郁、抗焦虑药物中的应用。
背景技术
抑郁症是一种常见的精神疾病，呈现慢性、易复发等特征。据世界卫生组织统计，全球约有3.5亿人口遭受抑郁症的折磨。预计到2020年，抑郁症将成为第二大影响人类生活质量的疾病。目前，抗抑郁症药物的作用机制尚未完全阐明。有明确疗效的药物基本作用于神经末梢突触部位，通过调节突触间隙神经递质的水平而发挥治疗作用。其病因学的生化研究表明抑郁症主要与中枢5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NA)、多巴胺(DA)、乙酰胆碱(Ach)和γ-氨基丁酸(GABA)等5种神经递质相关。
自上世纪50年代首次发现三环类抗抑郁药以来，已有多种抗抑郁药物被发现并广泛使用。目前临床使用的抗抑郁药物主要为：(1)单胺氧化酶抑制剂(MAOIs)，如吗氯贝胺(Moclobemide)；(2)三环类抗抑郁药(TCAs)，如地昔帕明(Desipramine)；(3)选择性5-羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂(SSRIs)，如氟西汀(Fluoxetine)、帕罗西汀(Paroxetine)；(4)去甲肾上腺素(NA)再摄取抑制剂(NRIs)，如瑞波西汀(Reboxitine)；(5)去甲肾上腺素能和特异性5-HT再摄取抑制剂(NDRIs)，如米氮平(Mirtazapine)；(6)5-HT和NA双重再摄取抑制剂(SNRIs)，如文拉法辛(Venlafaxine)和度洛西汀(Duloxetine)；(7)5-HT再吸收促进剂，如噻奈普汀(Tianeptine)等。
现有抗抑郁药不能满足临床治疗需求，主要仍存在起效迟缓、不能有效改善认知功能损伤、性功能障碍、胃肠道不良反应、失眠及潜在的药物相互作用等缺陷，药物耐受性差。例如：选择性5-羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂SSRIs存在起效延迟，通常在人体内数周之后才能产生抗抑郁疗效。而且，SSRIs对5-HT1和5-HT2受体作用不具有选择性，激活脊髓的5-HT1A受体有利于治疗抑郁症，但激活前脑的5-HT2受体可能导致激动或焦虑，因此SSRIs仍存在激动、焦虑、静坐不能和性功能障碍等不良反应。
临床数据显示，SSRIs药物对约30％的患者没有明显抗抑郁疗效[EssentPsychopharmacol,2003,5(3):217.]，而较新型的SNRIs双重作用药物的疗效虽较SSRIs更加明显，但仍有相当数量的患者疗效不满意[Journal of Clinical Psychiatry,2002,63(9):826-37.]。此外，目前临床使用的多数抗抑郁药耐受性较差，仍存在诸多不良反应，例如：眩晕、呕吐、亢奋、心血管系统影响、性功能障碍等。
5-HT1A受体是第一个具有药理学特征的5-羟色胺受体亚型，并始终是药物研究的焦点，此外，还涉及焦虑和抑郁障碍的发病机制和治疗。近年来，针对5-HT1A受体的新化学物质已经被广泛用于抗焦虑、抗抑郁、镇痛、神经保护，认知障碍，帕金森病，以及恶性类癌综合征等治疗用途[Journal of Medicinal Chemistry,2014,57(11):4407-4426]。
在抗抑郁治疗应用方面，5-HT1A激动剂在各种动物模型中显示出显著的抗抑郁活性，例如：尾悬挂试验和强迫游泳试验。尽管5-HT1A激动剂抗抑郁作用的精确机制尚不明确，但突触前5-HT1A受体与这种药理作用有关[Biol.Psychiatry 2003,53,193-203.]，采用5-HT1A激动剂重复治疗可使上皮细胞核中的突触前5-HT1A受体脱敏，从而使5-HT神经元与自身受体介导的抑制作用分离，5-HT神经元通过5-HT1A激动剂的慢性治疗而被激活，从而抵消了抑郁症中的5-HT缺陷，达到快速抗抑郁作用。5-HT1A受体激动剂可通过完全激动突触后膜的5-HT1A受体，负反馈抑制海马5-HT能神经元上的自身受体，减少投射到海马的中缝核5-HT能神经元在海马区释放神经递质发挥抗抑郁作用。5-HT1A受体激动剂能克服大多数临床抗抑郁药物存在起效延迟的缺陷，并通过兴奋突触前后膜5-HT1A受体，减少不良反应。
此外，5-HT1A激动剂或拮抗剂的联合治疗增强抑郁症一线治疗的5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)的作用。特别地，5-HT1A拮抗剂可以通过阻断抑制性5-HT1A自身受体来改善SSRIs的疗效。同样，5-HT1A激动剂可以通过触发突触后5-HT1A受体和/或产生更快的5-HT1A自身受体的脱敏来产生抗抑郁样活性。而5-HT1A部分激动剂联合5-HT再摄取抑制作用，亦可产生抗抑郁样作用。例如，盐酸维拉唑酮(SSRI/5-HT1A部分激动剂)于2011年被FDA批准用于治疗重度抑郁障碍[Int.J.Clin.Pract.2012,66,356-368]。
在抗焦虑治疗应用方面，5-HT1A激动剂可同时激动突触前后膜的5-HT1A受体，对DA能系统具有独特的双向效应：小剂量激动DA受体，高剂量时则表现出DA的受体拮抗作用，被认为具有广泛的抗焦虑、抗抑郁作用。例如：5-HT1A受体激动剂丁螺环酮和flesinoxan显示缓解焦虑和抑郁症的功效，丁螺环酮和坦度螺酮目前被批准用于世界各地的这些适应症。一些非典型抗精神病药如阿立哌唑也是5-HT1A受体的部分激动剂，有时以低剂量用于标准抗抑郁药如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)的增加。
在神经保护和认知功能改善方面，文献报道：5-HT1A受体激动剂在创伤性脑损伤治疗及认知功能改善研究中都产生重要作用[Brain Research,2015,1640(Pt A):5.]。相关研究表明位于学习记忆功能相关区域如海马，额叶皮层和内嗅皮质的大脑区域中5-HT1A受体直接或间接参与认知损伤神经递质的调节[Frontiers in Pharmacology,2015,6(1534)]。因此，高效选择性的5-HT1A受体激动剂有助于神经保护和认知功能改善，将有望解决现有抗抑郁药物不能有效改善认知功能损伤方面的缺陷。
在镇痛治疗应用方面，选择性5-HT1A受体激动剂目前已被证实在动物急性、慢性疼痛，以及炎症疼痛模型中可有效减轻疼痛。例如:[Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.1999,21:161-165]；[Shannon和Lutz(Psychopharmacology)2000,149:93-97]；[Eur.J.Pharmacol.)2004,497,285-292],等。高选择性和高效的5-HT1A激动剂Befiradol已经进入III期临床试验，用于治疗包括神经性疼痛的多种疼痛适应症。
总之，高选择性高效的5-HT1A受体激动剂(包括：完全激动剂或部分激动剂)具有快速起效的抗抑郁作用，具有抗焦虑、抗神经痛活性。目前，开发新结构选择性5-HT1A受体作用活性化合物，尤其是具有偏爱激动作用的新结构化合物，具有药效强、起效快、耐受性好、毒副作用小等特点，并有望改善认知功能损伤，已成为全球新型抗抑郁、抗焦虑、抗神经痛新药开发的重要方向，该领域研究具有新颖性、创造性和重要科学价值。
专利WO2014112729中公开了一类具有双重作用化合物，其通过抑制儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)，同时部分激动或拮抗D2受体、或激动D1受体，或同时作用D1和D2受体，代表化合物包括化合物4和化合物6，化学结构如下。
更具体地，所代表的优选化合物为化合物817630-66-3(CAS：817630-66-3)和化合物817630-59-4(CAS：817630-59-4)，其化学结构如下：
该专利公开了上述化合物对精神紊乱性疾病的治疗作用，例如精神分裂症、认知损伤，尤其是治疗精神分裂症的阴性和阳性症状，以及治疗中等程度的认知损伤。
文献WO2014112729中化合物4和化合物6化合物结构，尽管与本发明专利有类似之处，但本专利公开的3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪类化合物，在化学结构上，存在苯环上特定地取代基团和连接链长度的不同，正是这些特定化学结构特征的不同，本发明专利化合物在药理作用机制和治疗适应症方面与其存在本质的不同。
本专利公开的3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物，选择性作用于5-HT1A受体，而与D1、D2等其它17个中枢相关受体和蛋白无明显亲和作用。本申请专利化合物在小鼠强迫游泳、小鼠尾悬挂动物体内试验中，发现具有显著抗抑郁作用。本专利公开的化合物通过与5-HT1A受体的高选择性亲和作用，调节情绪控制产生抗抑郁作用，而WO2014112729专利中公开的化合物是通过调节多巴胺相关受体及蛋白，从而可产生抗精神分裂作用，两者在药理作用机制和治疗适应症存在本质区别。
WO2014112729专利中公开的化合物作用于儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)，以及多巴胺系统D1或D2受体，不可避免地带来多巴胺(dopamine,DA)功能的平衡失调，引起较严重锥外体系的副作用(EPS)，例如：运动不能、肌张力高、震颤和自主神经功能紊乱等副作用。由于这些明显毒副作用，难于治疗应用于多种适应症，亦是该类药物存在最难以克服的缺陷。本专利公开的3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物，高选择性作用于5-HT1A受体，对多巴胺的D1或D2等受体无亲和作用，动物体内无明显锥外体系副作用，因此具有高效、低毒的临床治疗应用前景。
发明内容
本发明的目的是公开一种3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物及在制备药物中的应用，通过高效高选择性作用于5-HT1A受体，达到快速起效、较少不良反应，并实现神经保护和认知功能改善等特点，以克服现有技术存在的缺陷。
所述的3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物，为具有式(III)所示的化合物或其游离碱或盐，盐为盐酸盐、溴氢酸盐、硫酸盐、三氟醋酸盐或甲磺酸盐等；
优选的盐为盐酸盐、溴氢酸盐，其盐可含0.5-3分子的结晶水：
一方面，本发明提供一种3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物，如式(III)所示的化合物或其游离碱或盐：
其中：R1代表氢，C1-5烷氧基、卤素、取代或未取代的C1-5烷基，所述C1-5烷基的取代基选自氨基、羟基或氟中的一种或几种；
R2代表氢，三氟甲基、卤素或取代或未取代的C1-5烷基；
R3代表氢，或卤素；
X代表CH或N；
n＝1或2。
进一步的，式(III)化合物中，所述的卤素为氟、氯、溴或碘。
进一步的，式(III)化合物中，所述的C1-5烷氧基为甲氧基、乙氧基或丙氧基、丁氧基；未取代的C1-5烷基为甲基、乙基、丙基、丁基、正戊基、异戊基或新戊基；取代的C1-5烷基为三氟甲基、氟代乙基、羟甲基或羟乙基。
进一步的，具有式(III)所示的化合物或其游离碱或盐：
其中：
R1代表H，OCH3、Cl、CH3或CF3；
R2代表H，CF3、Cl或CH3；
R3代表H，F或Cl；
X代表CH或N；
n＝1或2。
3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物，为如下化合物或其盐：
Ⅲ-1 3-(3-(4-(2,3-二氯苯基)哌嗪-1-基)丙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-2 3-(3-(4-(2,3-二甲基苯基)哌嗪-1-基)丙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-3 3-(2-(4-(2,3-二氯苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-4 3-(2-(4-(2,3-二甲基苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-5 3-(2-(4-(2,3-二氯-4-氟代苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-6 3-(2-(4-(2-氯-4-氟代苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-7 3-(2-(4-(4-氟-3-氯苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-8 3-(2-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-9 3-(2-(4-(3-(三氟甲基)苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-10 3-(2-(4-(3-氯苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-11 3-(3-(4-(2,3-二三氟甲基苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-12 3-(2-(4-(吡啶-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-13 3-(2-(4-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈或
Ⅲ-14 3-(2-(4-(4-氯吡啶-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈。
另一方面，本发明提供3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物在制备治疗抑郁症、神经性疼痛方面的应用。
本发明提供3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物，还可用于在中枢神经系统紊乱性疾病药物中的应用，进一步的，所述的中枢神经系统紊乱性疾病，包括焦虑症、躁狂症、各种双向情感障碍、帕金森病(PD)、亨廷顿舞蹈病(HD)、阿尔茨海默氏病、老年性痴呆、阿尔茨海默氏型痴呆、记忆障碍、执行功能丧失、血管性痴呆和其它痴呆，以及与智力、学习或记忆相关的功能障碍性疾病。
进一步的，本发明提供包含本发明化合物的药物组合物，包括治疗有效量的3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物和医药学上可接受的载体。
具体的化学结构式如下表所示：
其中，进一步优选的化合物包括：
III-3 3-(2-(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈或
III-4 3-(2-(4-(2，3-二甲基苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈。
本发明化合物可采用如下合成路线合成，具体制备实验操作见本专利的实施例部分。
R1＝H，CH3O，Cl，CH3，CF3；R2＝H，CF3，C1，CH3；R3＝H，F；X＝CH，N；n＝1，2
a.DIPEA/KI，CH3CN；b.CaCO3/KI，CH3CN
芳基哌嗪化合物(I)与氯代烷基溴反应生成氯烷基苯基哌嗪化合物(II)，再与3-氰基苯酚进行缩合反应，制备目标产物(III)，可获得具体目标化合物III-1至III-14。
上述合成路线中，所涉及的原料化合物均可采用商业化产品，部分关键中间体制备方法如下。
关键中间体的化学结构如下：
关键中间体大部分采用直接商购买获得，部分中间体可参考Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，22(21)，6766-6769；2012中报道的方法，经以下合成路线制备。
部分中间体亦可参考WO2011072174(2011)中公开报道的方法，经以下合成路线进行制备。
动物试验证明，本发明所述的3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物，对于中枢神经系统紊乱性疾病具有显著的疗效，可以用于制备治疗中枢神经系统紊乱性疾病的药物；
所述的中枢神经系统紊乱性疾病，包括抑郁症、抗焦虑、神经性疼痛、躁狂症、焦虑症、各种双向情感障碍、精神分裂症、帕金森病(PD)、亨廷顿舞蹈病(HD)、阿尔茨海默氏病、老年性痴呆、阿尔茨海默氏型痴呆、记忆障碍、执行功能丧失、血管性痴呆和其它痴呆，以及与智力、学习或记忆相关的功能障碍性疾病；
本发明发现3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物在体外5-HT1A受体亲和试验中，表现出与5-HT1A受体的高选择性高亲和活性。特别是化合物Ⅲ-3和化合物Ⅲ-4体外与5-HT1B受体、5-HT2A受体、5-HT2A受体、5-HT2C受体、5-HT6受体、5-HT7受体、SERT(5-HT转运体蛋白)、NET(肾上腺素转运体蛋白)、DAT(多巴胺转运体蛋白)、多巴胺D1受体、多巴胺D2受体、多巴胺D3受体、组织胺H1受体、组织胺H3受体、α型肾上腺素能受体α1和α2、NMDA受体(N-甲基-D-天冬氨酸受体)，M1受体(M胆碱受体)受体均无明显亲和作用。
动物模型研究结果表明：在小鼠强迫游泳试验中，化合物Ⅲ-3的盐酸盐和化合物Ⅲ-4的盐酸盐经灌胃给药，三组剂量下均具有明显抗抑郁作用，在小鼠尾悬挂试验中，化合物Ⅲ-3的盐酸盐经灌胃给药，三组剂量下均具有明显抗抑郁作用。化合物Ⅲ-3和Ⅲ-4的盐酸盐口服吸收较好，Ames试验均呈阴性，可作为新型抗抑郁药物开发。
本发明的衍生物可以组合物的形式通过口服、注射等方式施用于需要这种治疗的患者。给药剂量一般为0.02～5mg/kg(口服)或0.01～2mg/kg(注射)，具体可根据临床实验结果及患者的病情、年龄等由医师决定。
所述组合物，包括治疗治疗有效量所述的3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物和医药学上可接受的载体，所述及的载体是指药学领域常规的载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等；粘合剂如纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂如淀粉等；崩裂剂如碳酸钙、碳酸氢钠；润滑剂如硬脂酸钙或硬脂酸镁等。另外，还可以在组合物中加入其他辅助剂如香味剂和甜味剂。用于口服时，可将其制备成常规的固体制剂如片剂、粉剂或胶囊等；用于注射时，可将其制备成注射液。
本发明的组合物的各种剂型可以采用医学领域常规的方法进行制备，其中活性成分的含量为0.1％～99.5％(重量)。
本发明的3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物及其生理上可接受的盐，具有非常有用的药学性质，它们显示出对中枢神经系统的作用及良好的耐受性，特别是与5-HT1A受体的高亲和活性。
这类化合物对各种类型的抑郁症、焦虑症、各种双向情感障碍、精神分裂症、帕金森病(PD)、亨廷顿舞蹈病(HD)、阿尔茨海默氏病、老年性痴呆、阿尔茨海默氏型痴呆、记忆障碍、执行功能丧失、血管性痴呆和其它痴呆，以及与智力、学习或记忆相关的功能障碍性疾病具有治疗作用。
这类化合物对各种类型的疼痛具有广泛镇痛作用，包括各种伤害感受性疼痛、急性疼痛、慢性疼痛、神经性疼痛、精神性疼痛和混合性疼痛等。它特别包括但不限于：手术后疼痛、神经原性疼痛、中枢性痛、躯体痛、内脏痛、慢性后背痛、颈和腰痛、癌症痛、炎症疼痛、糖尿病性神经痛、坐骨神经痛、紧张性头痛、丛集性头痛、每日慢性头痛、疱疹神经痛、面部和口腔神经痛以及肌筋膜痛综合征、假性肢痛、残肢痛和截瘫痛、牙痛、耐阿片样物质疼痛、包括心脏手术和乳房切除术在内的术后疼痛、心绞痛、骨盆疼痛、膀胱炎以及阴道前庭炎和睾丸痛在内的泌尿生殖道疼痛、月经前期疼痛综合症、中风后疼痛、过敏性肠综合征、劳累和分娩疼痛、分娩后疼痛、因烧伤和化学损伤或日晒导致的疼痛和骨损伤性疼痛。
本发明所述3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物，显示出对中枢神经系统的作用，特别是选择性对5-HT1A受体选择性高亲和作用，体内发挥多种生理和药理作用，可用作药物活性物质，特别是用于抗抑郁、抗焦虑、抗神经性疼痛、抗双向情感障碍、抗精神分裂症、抗精神类疾病、并且还可以用作制备其它药物活性化合物的中间体。
具体实施方式
目标化合物Ⅲ-1～Ⅲ-14的合成通法：
将苯基哌嗪化合物(I)(0.05mol)、氯代烷基溴(0.1mol)、丙酮15ml、重量比25％氢氧化钠水溶液9ml，混合搅拌，室温搅拌反应12h，至苯基哌嗪化合物(I)转化完全，减压浓缩蒸除丙酮，30ml二氯甲烷萃取，分液，水相经15ml二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得粗品，采用硅胶柱层析法进行分离纯化，洗脱液浓缩至干，得氯烷基苯基哌嗪化合物(II)。
将间氰基苯酚(8.0mmol,1.0eq)，氯烷基苯基哌嗪化合物(II)(8.0mmol,1.0eq)，K2CO3 4.42g(32mmol,4.0eq)，碘化钾1.33g(8.0mmol,1.0eq)溶于50ml乙腈，升温回流，搅拌反应5h，停止加热，减压蒸馏除去溶剂，加水和乙酸乙酯各50ml，静置分层，水相用20ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，经饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得粗品，采用硅胶柱层析法或中性氧化铝柱层析法进行分离纯化，二氯甲烷或二氯甲烷/甲醇混合溶剂洗脱，收集纯样品洗脱液浓缩，得目标化合物固体，加30ml乙酸乙酯溶解，滴加5M HCl/EtOAc调节pH<3，固体析出，过滤，真空干燥，得白色固体目标化合物Ⅲ-1～Ⅲ-14的盐，收率65-76％。
具体实施例
实施例1
3-(3-(4-(2,3-二氯苯基)哌嗪-1-基)丙氧基)苯甲腈(Ⅲ-1)盐酸盐和氢溴酸盐的制备
将间氰基苯酚0.95g(8.0mmol,1.0eq)，1-(3-氯丙基)-4-(2,3-二氯苯基)哌嗪2.46g(8.0mmol,1.0eq)，K2CO3 4.42g(32mmol,4.0eq)，碘化钾1.33g(8.0mmol,1.0eq)溶于50ml乙腈，升温回流，搅拌反应5h，停止加热，减压蒸馏除去溶剂，加水和乙酸乙酯各50ml，静置分层，水相用20ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，经饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，经柱层析纯化得淡黄色油状物，加30ml乙酸乙酯溶解，滴加5M HCl/EtOAc调节pH<3，固体析出，过滤，真空干燥，得白色固体2.6g，收率76.2％。
元素分析：C20H21Cl2N3O·HCl(理论值％：C 56.29，H 5.20，N 9.85，Cl 24.92；实验值％C 56.46，H 5.22，N 9.81，Cl 24.77)
ESI-MS[M+H]+:m/z 390.1
1H-NMR(400MHz)，DMSO-d6：δ11.17(s,1H),7.52(t,J＝8.0Hz,1H),7.46(d,J＝2.0,1H),7.43(d,J＝8.0Hz,1H),7.40-7.34(m,2H),7.30(dd,J＝8.4Hz,2.0Hz,1H),7.22(dd,J＝6.8,2.0Hz,1H),4.16(t,J＝5.2Hz,2H),3.65-3.62(m,2H),3.46-3.43(m,2H),3.34–3.32(m,2H),3.25-3.17(m,4H),2.25-2.20(m,2H).
采用上述方法制备化合物(Ⅲ-1)，取1.5g上述固体溶于30ml乙酸乙酯中，滴加溴化氢/乙酸乙酯(3M)溶液，调节pH<3，室温搅拌析出白色固体，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，抽干，真空干燥，得化合物(Ⅲ-1)氢溴酸盐，白色粉末状固体1.52g。
ESI-MS[M+H]+:m/z 390.1
实施例2
3-(3-(4-(2,3-二甲基苯基)哌嗪-1-基)丙氧基)苯甲腈(Ⅲ-2)盐酸盐的制备
将间氰基苯酚0.95g(8.0mmol,1.0eq)，1-(3-氯丙基)-4-(2,3-二甲基苯基)哌嗪2.13g(8.0mmol,1.0eq)，K2CO3 4.42g(32mmol,4.0eq)，碘化钾1.33g(8.0mmol,1.0eq)溶于50ml乙腈，升温回流，搅拌反应5h。减压蒸馏除去溶剂，加水和乙酸乙酯各50ml，静置分层，水相用20ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，经饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，经柱层析纯化得淡黄色油状物，加30ml乙酸乙酯溶解，滴加5M HCl/EtOAc调节pH<3，固体析出，过滤，真空干燥，得白色固体2.3g，收率74.5％。
ESI-MS[M+H]+:m/z 350.2
1H-NMR(400MHz)，DMSO-d6：δ11.35(s,2H),7.52(t,J＝8.0Hz,1H),7.46(d,J＝2.4Hz,1H),7.44(d,J＝7.6Hz,1H),7.32(dd,J＝8.4Hz,J＝2.4Hz,1H),7.10(t,J＝7.6Hz,1H),6.93(d,J＝7.6Hz,1H),6.91(d,J＝8.4Hz,1H),4.18(t,J＝6.0Hz,2H),3.58(d,J＝10.8Hz,2H),3.34-3.28(m,2H),3.28-3.09(m,6H),2.34–2.24(m,2H),2.22(s,3H),2.18(s,3H).
实施例3
3-(2-(4-(2,3-二氯苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈(Ⅲ-3)盐酸盐的制备
将间氰基苯酚0.95g(8.0mmol,1.0eq)，1-(3-氯乙基)-4-(2,3-二氯苯基)哌嗪2.35g(8.0mmol,1.0eq)，K2CO3 4.42g(32mmol,4.0eq)，碘化钾1.33g(8.0mmol,1.0eq)溶于50ml乙腈，升温回流，搅拌反应5h，停止加热，减压蒸馏除去溶剂，加水和乙酸乙酯各50ml，静置分层，水相用20ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，经饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，经柱层析纯化得淡黄色油状物，加30ml乙酸乙酯溶解，滴加5M HCl/EtOAc调节pH<3，固体析出，过滤，真空干燥，得白色固体2.2g，收率66.7％。
ESI-MS[M+H]+:m/z 376.1
1H-NMR(400MHz)，DMSO-d6：δ11.88(s,1H),7.56(s,1H),7.55(t,J＝7.2Hz,1H),7.47(d,J＝6.8Hz,1H),7.40(dd,J＝7.2Hz,J＝1.2Hz,1H),7.37(d,J＝7.2Hz,1H),7.36(t,J＝7.6Hz,1H),7.21(dd,J＝7.2Hz,J＝1.6Hz,1H),4.71-4.46(m,2H),3.70-3.64(m,4H)，3.46-3.43(m,2H),3.38–3.29(m,4H).
实施例4
3-(2-(4-(2,3-二甲基苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈(Ⅲ-4)盐酸盐的制备
将间氰基苯酚0.95g(8.0mmol,1.0eq)，1-(3-氯乙基)-4-(2,3-二甲基苯基)哌嗪2.02g(8.0mmol,1.0eq)，K2CO3 4.42g(32mmol,4.0eq)，碘化钾1.33g(8.0mmol,1.0eq)溶于50ml乙腈，升温回流，搅拌反应5h。减压蒸馏除去溶剂，加水和乙酸乙酯各50ml，静置分层，水相用20ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，经饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，经柱层析纯化得淡黄色油状物，加30ml乙酸乙酯溶解，滴加5M HCl/EtOAc调节pH<3，固体析出，过滤，真空干燥，得白色固体2.1g，收率70.6％。
ESI-MS[M+H]+:m/z 336.2
1H-NMR(400MHz)，DMSO-d6：δ11.56(s,1H),7.58–7.53(m,2H),7.47(d,J＝5.2Hz，1H),7.39(dd,J＝5.2Hz,J＝1.2Hz,1H),7.08(t,J＝5.2Hz,1H),6.93(d,J＝4.8Hz,1H),6.91(d,J＝5.2Hz,1H)，4.60–4.57(m,2H),3.64–3.62(m,4H),3.38–3.32(m,2H),3.21-3.10(m,4H),2.22(s,3H),2.18(s,3H).
实施例5
3-(2-(4-(2,3-二氯-4-氟代苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈(Ⅲ-5)盐酸盐的制备
将间氰基苯酚0.95g(8.0mmol,1.0eq)，1-(3-氯乙基)-4-(2,3-二氯-4-氟苯基)哌嗪2.49g(8.0mmol,1.0eq)，K2CO3 4.42g(32mmol,4.0eq)，碘化钾1.33g(8.0mmol,1.0eq)溶于50ml乙腈，升温回流，搅拌反应5h，停止加热，减压蒸馏除去溶剂，加水和乙酸乙酯各50ml，静置分层，水相用20ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，经饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，经柱层析纯化得淡黄色油状物，加30ml乙酸乙酯溶解，滴加5M HCl/EtOAc调节pH<3，固体析出，过滤，真空干燥，得白色固体2.5g，收率72.5％。
ESI-MS[M+H]+:m/z 394.1
1H-NMR(400MHz)，DMSO-d6：δ11.81(s,1H),7.56-7.46(m,3H),7.40-7.25(m,3H),4.72-4.45(m,2H),3.72-3.61(m,4H)，3.49–3.21(m,6H).
实施例6
3-(2-(4-(2-氯-4-氟苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈(Ⅲ-6)盐酸盐的制备
将间氰基苯酚0.95g(8.0mmol,1.0eq)，1-(3-氯乙基)-4-(2-氯-4-氟苯基)哌嗪2.22g(8.0mmol,1.0eq)，K2CO3 4.42g(32mmol,4.0eq)，碘化钾1.33g(8.0mmol,1.0eq)溶于50ml乙腈，升温回流，搅拌反应5h，停止加热，减压蒸馏除去溶剂，加水和乙酸乙酯各50ml，静置分层，水相用20ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，经饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，经柱层析纯化得淡黄色油状物，加30ml乙酸乙酯溶解，滴加5M HCl/EtOAc调节pH<3，固体析出，过滤，真空干燥，得白色固体2.4g，收率75.7％。
ESI-MS[M+H]+:m/z 360.1
1H-NMR(400MHz)，DMSO-d6：δ11.72(s,1H),7.59-7.45(m,3H),7.41-7.18(m,4H),4.73-4.45(m,2H),3.73-3.61(m,4H)，3.49–3.20(m,6H).
实施例7
3-(2-(4-(4-氟-3-氯苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈(Ⅲ-7)盐酸盐的制备
将间氰基苯酚0.95g(8.0mmol,1.0eq)，1-(3-氯乙基)-4-(2-氯-3-氟苯基)哌嗪2.22g(8.0mmol,1.0eq)，K2CO3 4.42g(32mmol,4.0eq)，碘化钾1.33g(8.0mmol,1.0eq)溶于50ml乙腈，升温回流，搅拌反应5h，停止加热，减压蒸馏除去溶剂，加水和乙酸乙酯各50ml，静置分层，水相用20ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，经饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，经柱层析纯化得淡黄色油状物，加30ml乙酸乙酯溶解，滴加5M HCl/EtOAc调节pH<3，固体析出，过滤，真空干燥，得白色固体2.2g，收率69.4％。
ESI-MS[M+H]+:m/z 360.1
1H-NMR(400MHz)，DMSO-d6：δ11.65(s,1H),7.70-7.41(m,3H),7.40-7.14(m,4H),4.70-4.44(m,2H),3.75-3.60(m,4H)，3.50–3.18(m,6H).
实施例8
3-(2-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈(Ⅲ-8)盐酸盐的制备
将间氰基苯酚0.95g(8.0mmol,1.0eq)，1-(3-氯乙基)-4-(4-氯-3-氟苯基)哌嗪2.22g(8.0mmol,1.0eq)，K2CO3 4.42g(32mmol,4.0eq)，碘化钾1.33g(8.0mmol,1.0eq)溶于50ml乙腈，升温回流，搅拌反应5h，停止加热，减压蒸馏除去溶剂，加水和乙酸乙酯各50ml，静置分层，水相用20ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，经饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，经柱层析纯化得淡黄色油状物，加30ml乙酸乙酯溶解，滴加5M HCl/EtOAc调节pH<3，固体析出，过滤，真空干燥，得白色固体2.2g，收率70.2％。
ESI-MS[M+H]+:m/z 356.2
1H-NMR(400MHz)，DMSO-d6：δ11.65(s,1H),7.70-7.29(m,4H),7.21-6.84(m,3H),4.70-4.44(m,2H),3.75-3.60(m,4H)，3.50–3.18(m,6H).
实施例9
3-(2-(4-(3-(三氟甲基)苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈(Ⅲ-9)盐酸盐的制备
将间氰基苯酚0.95g(8.0mmol,1.0eq)，1-(3-氯乙基)-4-(3-三氟甲基苯基)哌嗪2.34g(8.0mmol,1.0eq)，K2CO3 4.42g(32mmol,4.0eq)，碘化钾1.33g(8.0mmol,1.0eq)溶于50ml乙腈，升温回流，搅拌反应5h，停止加热，减压蒸馏除去溶剂，加水和乙酸乙酯各50ml，静置分层，水相用20ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，经饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，经柱层析纯化得淡黄色油状物，加30ml乙酸乙酯溶解，滴加5M HCl/EtOAc调节pH<3，固体析出，过滤，真空干燥，得白色固体2.3g，收率69.9％。
ESI-MS[M+H]+:m/z 376.2
1H-NMR(400MHz)，DMSO-d6：δ11.24(s,1H),7.59-7.45(m,4H),7.40-7.35(m,1H),7.33-7.26(m,2H),7.19-7.14(m,1H),4.60-4.50(m,2H),4.05-3.91(m,2H)，3.72-3.59(m,4H),3.35–3.18(m,4H).
实施例10
3-(2-(4-(3-氯苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈(Ⅲ-10)盐酸盐的制备
将间氰基苯酚0.95g(8.0mmol,1.0eq)，1-(3-氯乙基)-4-(3-氯苯基)哌嗪2.34g(8.0mmol,1.0eq)，K2CO3 4.42g(32mmol,4.0eq)，碘化钾1.33g(8.0mmol,1.0eq)溶于50ml乙腈，升温回流，搅拌反应5h，停止加热，减压蒸馏除去溶剂，加水和乙酸乙酯各50ml，静置分层，水相用20ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，经饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，经柱层析纯化得淡黄色油状物，加30ml乙酸乙酯溶解，滴加5MHCl/EtOAc调节pH<3，固体析出，过滤，真空干燥，得白色固体2.0g，收率66.0％。
ESI-MS[M+H]+:m/z 342.1
1H-NMR(400MHz)，DMSO-d6：δ11.81(s,1H),7.57-7.35(m,4H),7.25(t,1H),7.10-6.84(m,3H),4.72-4.47(m,2H),3.70-3.64(m,4H)，3.45-3.41(m,2H),3.37–3.26(m,4H).
实施例11
3-(3-(4-(2,3-二三氟甲基苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈(Ⅲ-11)盐酸盐的制备
将间氰基苯酚0.95g(8.0mmol,1.0eq)，1-(3-氯乙基)-4-(2,3-二三氟甲基苯基)哌嗪2.89g(8.0mmol,1.0eq)，K2CO3 4.42g(32mmol,4.0eq)，碘化钾1.33g(8.0mmol,1.0eq)溶于50ml乙腈，升温回流，搅拌反应5h，停止加热，减压蒸馏除去溶剂，加水和乙酸乙酯各50ml，静置分层，水相用20ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，经饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，经柱层析纯化得淡黄色油状物，加30ml乙酸乙酯溶解，滴加5M HCl/EtOAc调节pH<3，固体析出，过滤，真空干燥，得白色固体2.9g，收率75.5％。
ESI-MS[M+H]+:m/z 444.1
1H-NMR(400MHz)，DMSO-d6：δ11.34(s,1H),7.80-7.35(m,5H),7.33-7.16(m,2H),4.66-4.42(m,2H),4.15-3.59(m,6H),3.35–3.10(m,4H).
实施例12
3-(2-(4-(吡啶-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈(Ⅲ-12)盐酸盐的制备
将间氰基苯酚0.95g(8.0mmol,1.0eq)，1-(3-氯乙基)-4-(吡啶-2-基)哌嗪1.81g(8.0mmol,1.0eq)，K2CO3 4.42g(32mmol,4.0eq)，碘化钾1.33g(8.0mmol,1.0eq)溶于50ml乙腈，升温回流，搅拌反应5h，停止加热，减压蒸馏除去溶剂，加水和乙酸乙酯各50ml，静置分层，水相用20ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，经饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，经柱层析纯化得淡黄色油状物，加30ml乙酸乙酯溶解，滴加5MHCl/EtOAc调节pH<3，固体析出，过滤，真空干燥，得白色固体2.1g，收率76.1％。
ESI-MS[M+H]+:m/z 309.2
1H-NMR(400MHz)，DMSO-d6：δ11.36(s,1H),8.70-7.31(m,6H),7.14-6.56(m,2H),4.70-4.46(m,2H),4.11-3.41(m,6H),3.39–3.13(m,4H).
实施例13
3-(2-(4-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈(Ⅲ-13)盐酸盐的制备
将间氰基苯酚0.95g(8.0mmol,1.0eq)，1-(3-氯乙基)-4-((4-三氟甲基)吡啶-2-基)哌嗪2.35g(8.0mmol,1.0eq)，K2CO3 4.42g(32mmol,4.0eq)，碘化钾1.33g(8.0mmol,1.0eq)溶于50ml乙腈，升温回流，搅拌反应5h，停止加热，减压蒸馏除去溶剂，加水和乙酸乙酯各50ml，静置分层，水相用20ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，经饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，经柱层析纯化得淡黄色油状物，加30ml乙酸乙酯溶解，滴加5M HCl/EtOAc调节pH<3，固体析出，过滤，真空干燥，得白色固体2.3g，收率69.7％。
ESI-MS[M+H]+:m/z 377.2
1H-NMR(400MHz)，DMSO-d6：δ11.24(s,1H),7.59-7.45(m,4H),7.40-7.18(m,3H),4.62-4.50(m,2H),4.10-3.81(m,2H)，3.74-3.53(m,4H),3.37–3.11(m,4H).
实施例14
3-(2-(4-(4-氯吡啶-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈(Ⅲ-14)盐酸盐的制备
将间氰基苯酚0.95g(8.0mmol,1.0eq)，1-(3-氯乙基)-4-(4-氯吡啶-2-基)哌嗪2.08g(8.0mmol,1.0eq)，K2CO3 4.42g(32mmol,4.0eq)，碘化钾1.33g(8.0mmol,1.0eq)溶于50ml乙腈，升温回流，搅拌反应5h，停止加热，减压蒸馏除去溶剂，加水和乙酸乙酯各50ml，静置分层，水相用20ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，经饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，经柱层析纯化得淡黄色油状物，加30ml乙酸乙酯溶解，滴加5M HCl/EtOAc调节pH<3，固体析出，过滤，真空干燥，得白色固体1.9g，收率62.6％。
ESI-MS[M+H]+:m/z 343.1
1H-NMR(400MHz)，DMSO-d6：δ11.31(s,1H),7.70-7.31(m,5H),7.25-6.91(m,2H),4.70-4.47(m,2H),4.05-3.41(m,6H),3.37–3.12(m,4H).
实施例15
制备方法：将活性成分与蔗糖、玉米淀粉混合，加水湿润，搅拌均匀，干燥，粉碎过筛，加入硬脂酸镁，混合均匀，压片。每片重250mg，活性成分含量为25mg。
实施例16
针剂：本发明的衍生物 10mg
注射用水 90mg
制备方法：将活性成分溶解于注射用水，混合均匀，过滤，将所获得的溶液在无菌条件下分装于安瓿瓶中，每瓶10mg，活性成分含量为1mg/瓶。
实施例17
化合物Ⅲ-1～Ⅲ-14体外与5-HT1A受体结合作用
1.化合物体外与5-HT1A受体结合试验
1.1实验材料
1.1.1溶媒
表1.溶媒相关信息
| 溶媒名称 | 来源 | 批号 | 备注 |
| DMSO | 国药集团 | 20150508 | 分析纯 |
| 超纯水 | 江苏恩华 | - | - |
| HCl | 上海苏懿 | 20150414 | 分析纯 |
| 冰醋酸 | 上海凌峰 | 20140730 | 分析纯 |
1.1.2标记配体
表2.标记配体相关信息及配制
1.1.3非标记配体
表3.非标化合物相关信息
1.1.4CHO-5-HT1A细胞：转染人源5-HT1A受体并稳定表达，购于perkinElmer公司。
1.1.5主要仪器
表4.仪器信息
| 名称 | 型号 | 生产厂家 |
| PH计 | PHS-3C | 上海精科 |
| 精密电子天平 | MS105DU | METTLER TOLEDO |
| 液体闪烁计数仪 | 425-304 | 芬兰HIDEX |
| 液闪仪 | Microbeta 2450 | Perkin Elmer公司 |
| 高速离心机 | J26xpi | Thermo |
| 高速分散机 | IKA-T10 | IKA |
1.1.6主要试剂及耗材
表5.主要试剂及耗材
1.2实验方法
1.2.1配制溶液：
50mM Tris-HCl缓冲液配制：取96.8g Tris溶于双蒸水中总体积为4000ml，用HCl调PH为7.3，稀释到16000mL，pH＝7.4。
5-HT1A缓冲液配制：称取0.117gEDTA，1.56mg优降宁，0.4g抗坏血酸，0.48g MgSO4，加入50mM的Tris-HCl缓冲液总体积为400ml，调整pH＝7.4。
放射性配体的配制：取放射性配体母液4.487μl，用无水乙醇稀释成5ml，备用。
非标记配体的配制：取5-HT适量，用超纯水配成终浓度为2*10-5M的溶液。
配制各种受试药物溶液：取各药物适量，先加用DMSO稀释到1ml，配成贮备液。临用时再从贮备液中取10μl，用超纯水依次稀释，使其浓度为2*10-5M。
甲苯闪烁液：取5.0g PPO，0.1g POPOP，加入到1000ml甲苯中。
1.2.2制备膜受体：
CHO-5-HT1A Cell由-80℃冰箱取出后自然解冻,在1000g，4℃下离心10分钟。取沉淀，弃上清液。沉淀加A液(50mM的Tris-HCl缓冲液，1mM EDTA含0.1％的抗坏血酸、20μM优降宁和10mM MgSO4，pH＝7.4)。细胞混匀20-30秒，然后50000g，4℃离心15min。小心的弃去上层液，再次加入A液(50mM的Tris-HCl缓冲液，1mM EDTA含0.1％的抗坏血酸、20μM优降宁和10mM MgSO4，pH＝7.4)，混匀，50000g，4℃离心15min离心。重复三次。-80℃储存。
1.2.3受体竞争结合实验:
第一步：先将制备好的膜用匀浆液A制成8mg/ml膜的混悬液，备用。
第二步：各反应管分别加入膜制备物100μl。
第三步：总结合管(TB)加入100μl A液，非特异性结合管(NB)加入5-HT 100μl(终浓度1.0*10-5M)，各受试化合物管(CB)加入100μl受试化合物。
第四步：各反应管分别加入放射性配体0.56nM[3H]-8-OH-DPAT 10μl。
第五步：将各反应管25℃温孵60min，反应完毕，结合的配基通过减压快速过滤，Whatman试纸GF/C板提前用0.5％PEI浸泡1h以上，过滤后将滤膜于烘箱60℃烘干，贴上底膜后加入45μl闪烁液，封好上膜，静置。
第六步：将闪烁瓶放入液闪计数仪计数。
1.2.4数据处理和统计分析
GraphPad计算各化合物IC50；
通过Scatchard作图得出各放射性配基Kd值及Bmax；
其中：TB代表总结合管CPM值；CB代表待测化合物的CPM值；NSB代表非标的CPM值；L代表放射性配基浓度，单位为nM；Kd代表仅在非标存在的情况下放射性配基平衡解离常数，单位为nM；IC50代表待测化合物的半数抑制浓度，单位为nM。
1.3.实验结果
化合物体外与5-HT1A受体结合试验见表6.。
表6.化合物Ⅲ-1～Ⅲ-14的盐酸盐与5-HT1A受体亲和力实验
2.化合物体外5-HT1A受体结合Ki值测定
化合物Ⅲ-2、Ⅲ-3、Ⅲ-4的盐酸盐进行5-HT1A受体结合的浓度梯度实验，测定其Ki值，结果如下表7.。
表7.Ⅲ-2、Ⅲ-3、Ⅲ-4的盐酸盐与5-HT1A受体亲和作用的Ki
试验表明，浓度为10μmol/L时，化合物Ⅲ-1～Ⅲ-14的盐酸盐具有5-HT1A受体较高亲和活性。特别地，再摄取浓度梯度实验结果表明，化合物Ⅲ-2、Ⅲ-3、Ⅲ-4盐酸盐对5-HT1A受体具有高亲和作用，其作用强度强于阳性对照利培酮。
实施例18
化合物Ⅲ-3、Ⅲ-4的体外多个靶点选择性测试试验
采用同位素配基结合试验，分别进行Ⅲ-3、Ⅲ-4盐酸盐对5-HT1A受体、5-HT1B受体、5-HT2A受体、5-HT2A受体、5-HT2C受体、5-HT6受体、5-HT7受体、SERT(5-HT转运体蛋白)、NET(肾上腺素转运体蛋白)、DAT(多巴胺转运体蛋白)、多巴胺D1受体、多巴胺D2受体、多巴胺D3受体、组织胺H1受体、组织胺H3受体、α型肾上腺素能受体α1和α2、NMDA受体(N-甲基-D-天冬氨酸受体)，M1受体(M胆碱受体)受体亲和试验。
1.实验材料
1.1溶媒
表8.溶媒相关信息
| 溶媒名称 | 来源 | 批号 | 备注 |
| DMSO | 国药集团 | 20150508 | 分析纯 |
| 超纯水 | 江苏恩华 | - | - |
| HCl | 上海苏懿 | 20150414 | 分析纯 |
| 冰醋酸 | 上海凌峰 | 20140730 | 分析纯 |
1.2标记配体
表9.标记配体相关信息
1.3非标记配体
表10.非标化合物相关信息
1.4受体膜来源
表11.受体膜来源相关信息
1.5主要仪器
表12.仪器信息
| 名称 | 型号 | 生产厂家 |
| PH计 | PHS-3C | 上海精科 |
| 精密电子天平 | MS105DU | METTLER TOLEDO |
| 液体闪烁计数仪 | 425-304 | 芬兰HIDEX |
| 液闪仪 | Microbeta 2450 | Perkin Elmer公司 |
| 高速离心机 | J26xpi | Thermo |
| 高速分散机 | IKA-T10 | IKA |
1.6主要试剂及耗材
表13.主要试剂及耗材
1.7对照品相关信息
表14.阳性对照品相关信息表
| 对照品名称 | 纯度 | 理化性质 | 保存条件 | 备注 |
| risperidone | ≥99％ | 白色粉末 | 阴凉、干燥室温 | - |
| Duloxetine | ≥99％ | 白色粉末 | 阴凉、干燥室温 | - |
| clozapine | ≥99％ | 白色粉末 | 阴凉、干燥室温 | - |
| olanzapine | ≥99％ | 白色粉末 | 阴凉、干燥室温 | - |
| A-960656 | ≥99％ | 白色粉末 | 阴凉、干燥室温 | - |
| PCP | ≥99％ | 白色粉末 | 阴凉、干燥室温 | - |
2.供试品的配制
依据文献及本实验室经验，选定1.0*10-5M-1.0*10-10M(终浓度)为实验研究剂量，根据实验结果，对于Ki值超出该剂量范围的扩大范围验证。
3.实验方法及步骤
3.1实验动物信息
种属和品系：SD大鼠
等级：SPF
数量和性别：雄42只，雌4只
供应单位：浙江省实验动物中心
动物生产许可证：SCXK(浙)2014-0001
动物使用许可证：SYXK(苏)2014-0049
3.2组织取材
大鼠断头后，打开颅骨，冰上操作分离皮层、纹状体，分离后-80℃冰箱单独存放以供受体实验使用。存放时间不超过6个月。
3.3匀浆液配制
A：(用于制备CHO-5-HT1A受体膜)：称取0.117gEDTA，1.56mg优降宁，0.4g抗坏血酸，0.48g MgSO4，加入50mM的Tris-HCl缓冲液总体积为400ml，调整pH＝7.4。使其终浓度分别为EDTA 1mM、抗坏血酸0.1％、优降宁20μM、和MgSO4 10mM。
B：(用于制备5-HT2A和5-HT2C受体膜)：50mM的Tris-HCl缓冲液：取96.8g Tris溶于双蒸水中总体积为4000ml，用HCl调PH为7.5，稀释到16000mL，pH＝7.4
C：(用于制备CHO-5-HT6膜)：称取0.812g MgCl2.6H2O，0.058g EDTA加入50mM的Tris-HCl缓冲液总体积为400ml，调整pH＝7.4。使其终浓度分别为MgCl2 10mM、EDTA0.5mM。
D：(用于制备SERT、NET受体膜)：称取2.805g NaCl，0.149g KCl加入50mM的Tris-HCl缓冲液总体积为400ml，调整pH＝7.4。使其终浓度分别为NaCl 120mM，KCl 5mM。
E：(用于制备H1受体膜)：50mM的Tris-HCl缓冲液：取96.8g Tris溶于双蒸水中总体积为4000ml，用HCl调PH为7.5，稀释到16000mL，pH＝7.4。
F：(用于制备H3受体膜)：称取0.254g MgCl2.6H2O，加入50mM的Tris-HCl缓冲液总体积为250ml，调整pH＝7.4。使其终浓度为MgCl2 5mM。
G：(M1受体膜)：
①匀浆液：称取0.152g MgCl2.6H2O，14.6mg EDTA，加入50mM的Tris-HCl缓冲液总体积为250ml，调整pH＝7.4。使其终浓度分别为MgCl2 3mM，EDTA 0.2mM。
②孵育液：称取HEPES 2.975g，NaCl 1.607g，KCl 100mg，CaCl2 52mg，MgSO4 30mg，glucose 1.125g，Sucrose 4.959g，加入纯化水总体积为250ml，调整pH＝7.4。使其终浓度分别为NaCl 110mM，KCl 5.4mM，CaCl21.8mM，MgSO4 1mM，glucose 25mM，HEPES 50mM，Sucrose 58mM。
H：(用于制备CHO-D1受体膜)：称取1.753g NaCl，93.1mg KCl，508mg MgCl2.6H2O，55.4mg CaCl2，加入50mM的Tris-HCl缓冲液总体积为250ml，调整pH＝7.4。使其终浓度分别为NaCl 120mM、KCl 5mM、MgCl2 10mM、CaCl2 2mM。
I：(用于制备CHO-D2受体膜)：称取1.191g HEPES，101.6mg MgCl2.6H2O，加入纯化水总体积为250ml，调整pH＝7.4。使其终浓度分别为HEPES 20mM、MgCl2 2mM。
J：(用于制备CHO-D3受体膜)：称取50.8mg MgCl2.6H2O，加入50mM的Tris-HCl缓冲液总体积为250ml，调整pH＝7.4。使其终浓度为MgCl21mM。
K：(用于制备α1和α2受体膜)：称取146mg EDTA，加入50mM的Tris-HCl缓冲液总体积为1000ml，调整pH＝7.7。使其终浓度为EDTA 0.5mM。
L：(用于制备DAT受体膜)：称取1.361g KH2PO4、1.122g NaCl、43.813g蔗糖，使用纯化水充分溶解，总体积为400ml，调整PH＝7.7。使其终浓度为分别为KH2PO4 25mM，NaCl48mM，蔗糖320mM。
M：(5-HT7受体膜)
①同匀浆液G①
②孵育液：称取111mg CaCl2，0.49mg优降宁，44mg Vc，加入50mM的Tris-HCl缓冲液总体积为250ml，调整pH＝7.7。使其终浓度为分别为CaCl24mM，0.1％Vc，优降宁10uM。
N：(用于制备CHO-5-HT1B受体膜)：称取111mg CaCl2，0.49mg优降宁，44mg Vc，加入50mM的Tris-HCl缓冲液总体积为250ml，调整pH＝7.7。使其终浓度为分别为CaCl24mM，0.1％Vc，优降宁10uM。
3.4受体膜的制备
1)CHO-5-HT1A受体膜的制备
CHO-5-HT1A Cell由-80℃冰箱取出后自然解冻,在1000g，4℃下离心10分钟。取沉淀，弃上清液。沉淀加A液(50mM的Tris-HCl缓冲液，1mM EDTA含0.1％的抗坏血酸、20μM优降宁和10mM MgSO4，pH＝7.4)。细胞混匀20-30秒，然后50000g，4℃离心15min。小心的弃去上层液，再次加入A液(50mM的Tris-HCl缓冲液，1mM EDTA含0.1％的抗坏血酸、20μM优降宁和10mM MgSO4，pH＝7.4)，混匀，50000g，4℃离心15min离心。重复三次。-80℃储存。
2)5-HT2A和5-HT2C(组织)膜的制备
-80℃冰箱取出大鼠皮层自然解冻，加入B液于4档3-4s匀浆，匀浆4次，然后加入B液，于37℃孵育10min，孵育完后试管用天平调整重量，在48000g，4℃离心20min，弃上清液，加入B液，用旋涡混合器混匀，再加入B液，48000g，4℃离心，(重复三次离心)，离心完毕，弃上清液，将沉淀于-80℃储存备用。
3)CHO-5-HT6受体膜的制备
Cell CHO-5-HT6由-80℃冰箱取出后自然解冻，1000g离心10min，沉淀加入匀浆液C，用旋涡混合器混匀，在50000g，4℃离心15min，弃上清液，取沉淀，再次加入C缓冲液(PH＝7.4)洗涤，重复三次离心，离心完毕，弃上清液，将沉淀于-80℃储存备用。4)SERT和NET(组织)受体膜的制备
-80℃冰箱取出大鼠皮层自然解冻，加入匀浆液D(50mM Tris-HCl，120mM NaCl，5mM KCl，pH＝7.4)，用旋涡混合器混匀，在50000g，4℃离心10min，弃上清液，加入匀浆液匀浆于37℃孵育10min，离心后取沉淀，再加入50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)洗涤，重复三次离心，离心完毕，弃上清液，将沉淀于-80℃储存备用。
5)H1(细胞)受体膜的制备
Cell CHO-H1由-80℃冰箱取出后自然解冻，2000g离心10min，沉淀加入匀浆液E，用旋涡混合器混匀，在50000g，4℃离心10min，弃上清液，取沉淀。沉淀再次加入E液，在50000g，4℃离心10min，重复两次，离心完毕，弃上清液。将沉淀于-80℃冰箱储存备用。
6)H3(细胞)受体膜的制备
Cell CHO-H3由-80℃冰箱取出后自然解冻，2000g离心10min，沉淀加入匀浆液F，用旋涡混合器混匀，在50000g，4℃离心12min，弃上清液，取沉淀，再次加入F缓冲液(pH＝7.4)洗涤，重复三次离心，离心完毕，弃上清液，将沉淀于-80℃储存备用
7)CHO-D1受体膜的制备
Cell CHO-D1由-80℃冰箱取出后自然解冻，3000g离心5min，沉淀加入匀浆液H，用旋涡混合器混匀，在50000g，4℃离心12min，弃上清液，取沉淀，再次加入H缓冲液(pH＝7.4)洗涤，重复三次离心，离心完毕，弃上清液，将沉淀于-80℃储存备用。
8)CHO-D2受体膜的制备
Cell CHO-D2由-80℃冰箱取出后自然解冻，3000g离心5min，沉淀加入匀浆液I，用旋涡混合器混匀，在50000g，4℃离心12min，弃上清液，取沉淀，再次加入I缓冲液(pH＝7.4)洗涤，重复三次离心，离心完毕，弃上清液，将沉淀于-80℃储存备用。
9)CHO-D3受体膜的制备
Cell CHO-D3由-80℃冰箱取出后自然解冻，2000g离心10min，沉淀加入匀浆液J，用旋涡混合器混匀，在45000g，4℃离心15min，弃上清液，取沉淀，再次加入J缓冲液(pH＝7.4)洗涤，重复三次离心，离心完毕，弃上清液，将沉淀于-80℃储存备用。
10)α1和α2(组织)受体膜的制备
-80℃冰箱取出大鼠皮层自然解冻，加入匀浆液K，用旋涡混合器混匀，在48000g，4℃离心15min，弃上清液，取沉淀，加入50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.7)洗涤，重复三次离心，离心完毕，弃上清液，将沉淀于-80℃储存备用。
11)DAT受体膜的制备
-80℃冰箱取出大鼠纹状体自然解冻，加入溶液L匀浆，50000g，4℃离心10min，弃上清液，取沉淀，再加入溶液B洗涤，重复三次离心，离心完毕，弃上清液，将沉淀于-80℃储存备用。
12)5-HT1B受体膜制备
Cell CHO-5-HT1B由-80℃冰箱取出后自然解冻，加入匀浆液M，1000g，4℃离心10分钟。用冰凉的缓冲液M重新悬浮细胞，在50000g，4℃，离心15min。弃上清液，取沉淀，再加入匀浆液，于37℃孵育10min(去除内源性5-HT)，离心，重复离心后，取沉淀于-80℃冰箱储存备用。
13)M1受体膜制备
Cell CHO-M1由-80℃冰箱取出后自然解冻，3000g，4℃离心5分钟。小心的弃去上层液，用G①缓冲液重新悬浮细胞。细胞混匀20-30秒，然后50000g，4℃离心12min。离心后弃去上层清液，用G①缓冲液再悬浮。细胞混匀20-30s，然后50000g，4℃离心12min。-80℃储存。
14)5-HT7受体膜的制备
-80℃冰箱取出大鼠皮层自然解冻，加入匀浆液M①匀浆，在45000g，4℃离心12min，弃上清液，取沉淀，加入匀浆液M①于37℃孵育20min，离心后取沉淀，重复2次离心，离心完毕，弃上清液，将沉淀于-80℃储存备用。
3.5受体竞争结合试验
1)CHO-5-HT1A受体竞争结合试验
第一步：先将制备好的膜用匀浆液A制成8mg/ml膜的混悬液，备用。
第二步：各反应管分别加入膜制备物100μl。
第三步：总结合管(TB)加入100μl A液，非特异性结合管(NB)加入5-HT 100μl(终浓度1.0*10-5M)，各受试化合物管(CB)加入100μl受试化合物。
第四步：各反应管分别加入放射性配体0.56nM[3H]-8-OH-DPAT 10μl。
第五步：将各反应管25℃温孵60min，反应完毕，结合的配基通过减压快速过滤，Whatman试纸GF/C板提前用0.5％PEI浸泡1h以上，过滤后将滤膜于烘箱60℃烘干，贴上底膜后加入45μl闪烁液，封好上膜，静置。
第六步：将闪烁瓶放入液闪计数仪计数。
2)5-HT2A受体竞争结合试验
第一步：先将制备好的膜用匀浆液B制成210mg/ml膜的混悬液备用，备用。
第二步：各反应管分别加入膜制备物100μl。
第三步：总结合管(TB)加入100μl B液，非特异性结合管(NB)加入Methysergide100μl(终浓度1.0*10-5M)，各受试化合物管(CB)加入100μl受试化合物。
第四步：各反应管分别加入放射性配体2.98nM[3H]-Ketanserin 10μl。
第五步：将各反应管37℃温孵25min，反应完毕，结合的配基通过减压快速过滤，Whatman试纸GF/C提前1h使用0.5％PEI溶液饱和，用冰冷的Tris缓冲液充分洗涤，将滤片取出放到2ml闪烁杯中，加入1ml的甲苯闪烁液并混匀。
第六步：将闪烁瓶放入液闪计数仪计数。
3)5-HT2C受体竞争结合试验
第一步：先将制备好的膜用匀浆液B制成210mg/ml膜的混悬液备用，备用。
第二步：各反应管分别加入膜制备物100μl。
第三步：总结合管(TB)加入100μl B液，非特异性结合管(NB)加入Ketanserin(终浓度1.0*10-5M)100μl，各受试化合物管(CB)加入100μl受试化合物。
第四步：各反应管分别加入放射性配体3nM[3H]-Mesulergine 10μl。
第五步：将各反应管37℃温孵25min，反应完毕，结合的配基通过减压快速过滤，Whatman试纸GF/C提前1h使用0.5％PEI溶液饱和，用冰冷的Tris缓冲液充分洗涤，将滤片取出放到2ml闪烁杯中，加入1ml的甲苯闪烁液并混匀。
第六步：将闪烁瓶放入液闪计数仪计数。
4)5-HT6受体竞争结合试验
第一步：先将制备好的膜用匀浆液C制成5mg/ml膜的混悬液备用，备用。
第二步：各反应管分别加入膜制备物100ul。
第三步：总结合管(TB)加入100μl C液，非特异性结合管(NB)加入100μl10μM 5-HT(终浓度1.0*10-5M)，各受试化合物管(CB)加入100μl受试化合物。
第四步：各反应管分别加入放射性配体2.5nM[3H]-LSD 10μl。
第五步：将各反应管37℃温孵60min，反应完毕，结合的配基通过减压快速过滤，Whatman试纸GF/C提前1h使用0.5％PEI溶液饱和，用冰冷的Tris缓冲液充分洗涤过滤后将滤膜60℃烘干，贴上底膜后加入45μl闪烁液，封好上膜，静置。
第六步：将闪烁瓶放入液闪计数仪计数。
5)SERT受体竞争结合试验
第一步：先将制备好的膜用匀浆液D制成210mg/ml膜的混悬液备用，备用。
第二步：各反应管分别加入膜制备物100μl。
第三步：总结合管(TB)加入100μl匀浆液D，非特异性结合管(NB)加入paroxetine100μl(终浓度1.0*10-5M，各受试化合物管(CB)加入100μl受试化合物。
第四步：各反应管分别加入放射性配体0.5nM[3H]-paroxetine 10μl(各反应管均设2个平行管，加样时各管置于冰上)。
第五步：将各反应管23℃温孵60min，反应完毕，结合的配基通过减压快速过滤，Whatman试纸GF/C提前1h使用0.5％PEI溶液饱和，用冰冷的Tris缓冲液充分洗涤，将滤片取出放到2ml闪烁杯中，加入1ml的甲苯闪烁液并混匀。
第六步：将闪烁瓶放入液闪计数仪计数。
6)NET受体竞争结合试验
第一步：先将制备好的膜用匀浆液D制成210mg/ml膜的混悬液备用，备用。
第二步：各反应管分别加入膜制备物100μl。
第三步：总结合管(TB)加入100μl匀浆液D，非特异性结合管(NB)加入100μldesipramine(终浓度1.0*10-5M，各受试化合物管(CB)加入100μl受试化合物。
第四步：各反应管分别加入放射性配体0.5nM[3H]-Nisoxetine 10μl(各反应管均设2个平行管，加样时各管置于冰上)。
第五步：将各反应管25℃温孵30min，反应完毕，结合的配基通过减压快速过滤，Whatman试纸GF/C提前1h使用0.5％PEI溶液饱和，用冰冷的Tris缓冲液充分洗涤，将滤片取出放到2ml闪烁杯中，加入1ml的甲苯闪烁液并混匀。
第六步：将闪烁瓶放入液闪计数仪计数。
7)H1受体竞争结合试验
第一步：先将制备好的膜用匀浆液E制成8mg/ml膜的混悬液备用，备用。
第二步：各反应管分别加入100μl膜制备物。
第三步：总结合管(TB)加入100μl匀浆液E，非特异性结合管(NB)加入100μlChiorpheniramine(终浓度1.0*10-5M)，各受试化合物结合管(CB)加入100μl受试化合物。
第四步：各反应管分别加入放射性配体0.9nM[3H]-pyrilamine 10μl(个反应管均设2个平行管，加样时各管置于冰上)。
第五步：将各反应管30℃温孵60min，反应完毕，通过减压快速过滤(whatman试纸GF/C用0.5％PEI浸泡1h以上)，过滤后将滤膜60℃烘干，贴上底膜后加入45μl闪烁液，封好上膜，静置。
第六步：将闪烁杯放入液闪计数仪计数。
8)H3受体竞争结合试验
第一步：先将制备好的膜用匀浆液F制成8mg/ml膜的混悬液备用，备用。
第二步：各反应管分别加入膜制备物100μl。
第三步：总结合管(TB)加入100μl匀浆液F，非特异性结合管(NB)加入100μlthioperamide(1μM终浓度1.0*10-5M)，各受试化合物结合管(CB)加入100μl受试化合物。
第四步：各反应管分别加入放射性配体[3H]-methylhistamine 10μl(终浓度1nM)(各反应管均设2个平行管，加样时各管置于冰上)。
第五步：将各反应管30℃温孵40min，反应完毕，Whatman试纸GF/C提前1h使用0.5％PEI溶液饱和，用冰冷的Tris缓冲液充分洗涤。过滤后将滤膜60℃烘干，贴上底膜后加入45μl闪烁液，封好上膜，静置。
第六步：将闪烁瓶放入液闪计数仪计数。
9)CHO-D1受体竞争结合试验
第一步：先将制备好的膜用匀浆液H制成8mg/ml膜的混悬液备用，备用。
第二步：各反应管分别加入膜制备物100μl。
第三步：总结合管(TB)加入100μl H液，非特异性结合管(NB)加入Butaclamol(终浓度1.0*10-5M)100μl，各受试化合物结合管(CB)加入100μl受试化合物。
第四步：各反应管分别加入放射性配体2nM[3H]-SCH23390 10μl。
第五步：将各反应管37℃温孵15min，反应完毕，结合的配基通过减压快速过滤，Whatman试纸GF/C提前1h使用0.5％PEI溶液饱和，用冰冷的Tris缓冲液充分洗涤。过滤后将滤膜60℃烘干，贴上底膜后加入45μl闪烁液，封好上膜，静置。
第六步：将闪烁瓶放入液闪计数仪计数。
10)CHO-D2L受体竞争结合试验
第一步：先将制备好的膜用匀浆液I制成8mg/ml膜的混悬液备用，备用。
第二步：各反应管分别加入膜制备物100μl。
第三步：总结合管(TB)加入100μl I液，非特异性结合管(NB)加入100μlHaloperidol(终浓度1.0*10-5M)，各受试化合物结合管(CB)加入100μl受试化合物。
第四步：各反应管分别加入放射性配体1.176nM[3H]-Spiperone 10μl。
第五步：将各反应管37℃温孵25min，反应完毕，结合的配基通过减压快速过滤Whatman试纸GF/B板提前用0.5％PEI浸泡1h以上，过滤后将滤膜60℃烘干，贴上底膜后加入45μl闪烁液，封好上膜，静置。
第六步：将闪烁瓶放入液闪计数仪计数。
11)D3受体竞争结合试验
第一步：先将制备好的膜用匀浆液J制成8mg/ml膜的混悬液备用，备用。
第二步：各反应管分别加入膜制备物100μl。
第三步：总结合管(TB)加入100μl J液，非特异性结合管(NB)加入10μMhaloperidol(终浓度1.0*10-5M)100μl，各受试化合物结合管(CB)加入100μl受试化合物。
第四步：各反应管分别加入放射性配体1.176nM[3H]-Spiperone 10μl。
第五步：将各反应管27℃温孵30min，反应完毕，结合的配基通过减压快速过滤Whatman试纸GF/C提前1h使用0.5％PEI溶液饱和，用冰冷的Tris缓冲液充分洗涤，过滤后将滤膜60℃烘干，贴上底膜后加入45μl闪烁液，封好上膜，静置。
第六步：将闪烁瓶放入液闪计数仪计数。
12)α1去甲肾上腺素受体竞争结合试验
第一步：先将制备好的膜用匀浆液K制成200mg/ml膜的混悬液备用，备用。
第二步：各反应管分别加入膜制备物100μl。
第三步：总结合管(TB)加入100μl K液，非特异性结合管(NB)加入prazosin(终浓度1.0*10-5M)100μl，各受试化合物结合管(CB)加入100μl受试化合物。
第四步：各反应管分别加入放射性配体0.7nM[3H]-prazosin 10μl。
第五步：将各反应管25℃温孵60min，反应完毕，结合的配基通过减压快速过滤，Whatman试纸GF/C提前1h使用0.5％PEI溶液饱和，用冰冷的Tris缓冲液充分洗涤，将滤片取出放到2ml闪烁杯中，加入1ml的甲苯闪烁液并混匀。
第六步：将闪烁瓶放入液闪计数仪计数。
13)α2去甲肾上腺素受体竞争结合试验
第一步：先将制备好的膜用匀浆液K制成200mg/ml膜的混悬液备用，备用。
第二步：各反应管分别加入膜制备物100μl。
第三步：总结合管(TB)加入100μl K液，非特异性结合管(NB)加入rauwolscine(终浓度1.0*10-5M)100μl，各受试化合物结合管(CB)加入100μl受试化合物。
第四步：各反应管分别加入放射性配体[3H]-rauwolscine(终浓度1nM)10μl。
第五步：将各反应管25℃温孵60min，反应完毕，结合的配基通过减压快速过滤，Whatman试纸GF/C提前1h使用0.5％PEI溶液饱和，用冰冷的Tris缓冲液充分洗涤，将滤片取出放到2ml闪烁杯中，加入1ml的甲苯闪烁液并混匀。
第六步：将闪烁瓶放入液闪计数仪计数。
14)DAT受体亲和试验
第一步：先将制备好的膜用匀浆液L制成200mg/ml膜的混悬液备用，备用。
第二步：各反应管分别加入膜制备物100uL。
第三步：总结合管(TB)加入100uL L液，非特异性结合管(NB)加入nomifensine(终浓度1.0*10-5M)100uL，各受试化合物结合管(CB)加入100uL受试化合物。
第四步：各反应管分别加入放射性配体0.5nM 3H-WIN35,428 10uL。
第五步：将各反应管4℃温孵120min，反应完毕，结合的配基通过减压快速过滤，Whatman试纸GF/C提前1h使用0.5％PEI溶液饱和，用冰冷的Tris缓冲液充分洗涤，将滤膜取出放到2ml闪烁杯中，加入1ml的甲苯闪烁液并混匀。
第六步：将闪烁瓶放入液闪计数仪计数。
15)5-HT1B受体竞争结合试验
第一步：先将制备好的膜用匀浆液N制成8mg/ml膜的混悬液备用，备用。
第二步：各反应管分别加入膜制备物100ul。
第三步：总结合管(TB)加入100μl N液，非特异性结合管(NB)加入100μl10μM 5-HT(终浓度1.0*10-5M)，各受试化合物结合管(CB)加入100μl受试化合物。
第四步：各反应管分别加入放射性配体0.5nM[3H]-GR125743 10μl。
第五步：将各反应管25℃温孵60min，反应完毕，结合的配基通过减压快速过滤，Whatman试纸GF/C提前1h使用0.5％PEI溶液饱和，用冰冷的Tris缓冲液充分洗涤过滤后将滤膜60℃烘干，贴上底膜后加入45μl闪烁液，封好上膜，静置。
第六步：将闪烁瓶放入液闪计数仪计数。
16)M1受体竞争结合试验
第一步：先将制备好的膜用匀浆液G②制成10mg/ml膜的混悬液备用，备用。
第二步：各反应管分别加入膜制备物100μL。
第三步：总结合管(TB)加入100μL孵育液，非特异性结合管(NB)加入100μLatropine(终浓度10-5M)，各受试化合物结合管(CB)加入100μl受试化合物。
第四步：各反应管分别加入放射性配体3H-QNB 10μL(终浓度2nM)。
第五步：将各反应管37℃温孵60min，反应完毕，结合的配基通过减压快速过滤，Whatman试纸GF/C提前1h使用0.5％PEI溶液饱和，用冰冷的Tris缓冲液充分洗涤过滤后将滤膜60℃烘干，贴上底膜后加入45μl闪烁液，封好上膜，静置。
第六步：将闪烁瓶放入液闪计数仪计数。
17)5-HT7(组织)受体竞争结合试验
第一步：先将制备好的膜用匀浆液M②制成200mg/ml膜的混悬液，备用。
第二步：各反应管分别加入膜制备物100μl。
第三步：总结合管(TB)加入100μl M②液，非特异性结合管(NB)加入10μM 5-CT(终浓度1.0*10-5M)100μl，各受试化合物结合管(CB)加入100μl受试化合物。
第四步：各反应管分别加入放射性配体[3H]-5-CT(终浓度5nM)10μl。
第五步：将各反应管37℃温孵60min，反应完毕，结合的配基通过减压快速过滤，Whatman试纸GF/C提前1h使用0.5％PEI溶液饱和，用冰冷的Tris缓冲液充分洗涤，将滤片取出放到2ml闪烁杯中，加入1ml的甲苯闪烁液并混匀。
第六步：将闪烁瓶放入液闪计数仪计数。
4.数据处理和统计分析
logit法计算各化合物IC50；
通过Scatchard作图得出各放射性配基Kd值及Bmax；
其中：TB代表总结合管CPM值；CB代表待测化合物的CPM值；NSB代表非标的CPM值；L代表放射性配基浓度，单位为nM；Kd代表仅在非标存在的情况下放射性配基平衡解离常数，单位为nM；IC50代表待测化合物的半数抑制浓度，单位为nM。
5.实验结果
化合物III-3和III-4盐酸盐体外与对5-HT1A受体、5-HT1B受体、5-HT2A受体、5-HT2C受体、5-HT6受体、5-HT7受体、SERT(5-HT转运体蛋白)、NET(肾上腺素转运体蛋白)、DAT(多巴胺转运体蛋白)、多巴胺D1受体、多巴胺D2受体、多巴胺D3受体、组织胺H1受体、组织胺H3受体、α型肾上腺素能受体α1和α2、NMDA受体(N-甲基-D-天冬氨酸受体)，M1受体(M胆碱受体)受体亲和试验结果见表15.。
表15.化合物III-3和III-4体外与18个靶点亲和试验结果
试验表明：化合物Ⅲ-2和Ⅲ-4的盐酸盐，在浓度为10μmol/L时，对5-HT1A受体具有高度选择性，而与5-HT1B、5-HT2C、D1、D2等其它17个中枢相关的受体或蛋白无明显亲和活性。
实施例19
采用小鼠尾悬挂测试化合物Ⅲ-3盐酸盐的体内抗抑郁作用
1.实验材料
1.2主要试剂
受试样品：化合物Ⅲ-3盐酸盐及其适当浓度的溶液。
对照药品：盐酸度洛西汀
CMC-Na：购自上海远宏化工有限公司
1.3实验动物
KM小鼠，雌雄兼有，体重在20-25g/只。
2.实验方法(小鼠悬尾实验)
实验前几天筛选出体重合格的小鼠并分组，实验时分两天进行，D1将小鼠放到悬尾仪的杠杆上6min，记录后4min的不动时间，筛选出不动时间在60s～180s的小鼠并设立60s～90s、90s～120s、120s～150s、150～180s四个层次然后把各个层次小鼠进行随机分组，每组12只，设立空白对照组、阳性对照组和受试药各给药组。
D2，小鼠灌胃给药1h后，将小鼠放到悬尾仪的杠杆上6min，记录后4min的不动时间。(不动标准：所谓不动是指小鼠在悬尾仪的杠杆上静止停止挣扎或呈现荡秋千状态。)3.统计学处理方法
求出各组小鼠不动时间的平均值，结果用“均值±标准差”表示，将给药组的结果与对照组进行t检验以评价受试药物是否存在抗抑郁性，以P<0.05为有显著性差异。
4.试验结果
通过实验观察到，与空白对照组相比，盐酸度洛西汀灌胃给药20mg/kg，小鼠不动时间显著减少。化合物Ⅲ-3盐酸盐在灌胃给药10、30、100mg/kg剂量组中，与空白对照组相比，小鼠不动时间显著减少，具有显著性差异。具体实验结果见表16.。
表16.化合物Ⅲ-3盐酸盐的小鼠尾悬挂试验结果
注：*P<0.05,**P<0.01
实施例20
采用小鼠强迫游泳法测试化合物Ⅲ-3盐酸盐和Ⅲ-4盐酸盐的体内抗抑郁作用
1.实验材料
1.1主要试剂
受试样品：化合物Ⅲ-3、Ⅲ-4的盐酸盐及其适当浓度的溶液。
对照药品：盐酸度洛西汀，盐酸氟西汀
CMC-Na：购自上海远宏化工有限公司
1.2实验动物
KM小鼠，雌雄兼有，体重在20-25g/只。
2.实验方法(小鼠强迫游泳实验)
实验前一天筛选出体重合格的小鼠并随机分组，每组8只，设立溶媒对照组和阳性对照对照组。各组采用灌胃(P.O.)给药，每次实验前1h给药。
强迫游泳试验中，将小鼠放入透明的玻璃圆筒(水深15cm，水温23～25℃)中6min，并视频录像6min，之后软件或人工分析小鼠在6min游泳期间后4min的不动时间。
3.统计学处理方法
求出各组小鼠不动时间的平均值，结果用“均值±标准差”表示，将给药组的结果与对照组进行t检验以评价受试药物是否存在抗抑郁性，以P<0.05为有显著性差异。
4.试验结果
通过实验观察到，与空白对照组相比，盐酸度洛西汀灌胃给药20mg/kg和盐酸氟西汀灌胃给药20mg/kg，小鼠不动时间显著减少。化合物Ⅲ-3盐酸盐在灌胃给药10、30mg/kg剂量组中，与空白对照组相比，均显著性减少小鼠不动时间，化合物Ⅲ-4盐酸盐在灌胃给药10、30、100mg/kg剂量组中，与空白对照组相比，均显著性减少小鼠不动时间。具体实验数据及结果如下表17.。
表17.化合物Ⅲ-3盐酸盐和Ⅲ-4盐酸盐的小鼠强迫游泳试验结果
注：*P<0.05,**P<0.01
实施例21
化合物对小鼠僵住症(Catalepsy)实验
1.试验目的
通过口服灌胃给予III-3盐酸盐、III-4盐酸盐等化合物，进行化合物进行僵住症试验，评估其在不同剂量下引起锥外体系副作用(EPS)的程度。观察化合物的毒性不良反应等。
2.化合物817630-66-3(CAS：817630-66-3)和化合物817630-59-4(CAS：817630-59-4)的制备
根据WO2014112729中公开的合成路线方法，分别制备了化合物817630-66-3和化合物817630-59-4的样品作为供试品，进行本对照试验。
3.供试品、对照品及溶媒
表18.供试品、对照品及溶媒相关信息
| 供试品名称 | 理化性状 | 溶媒 | 保存条件 |
| 阿立哌唑 | 白色粉末 | 50％PEG | 室温 |
| III-3盐酸盐 | 白色粉末 | 50％PEG | 室温 |
| III-4盐酸盐 | 白色粉末 | 50％PEG | 室温 |
| 817630-66-3 | 类白色粉末 | 50％PEG | 室温 |
| 817630-59-4 | 类白色粉末 | 50％PEG | 室温 |
4.实验动物
种类及品系：ICR小鼠，体重范围：24-30g。
动物饲养于含有垫料的小鼠盒内，每笼10只。动物房符合普通级要求，控制温度：20-26℃；湿度：40-70％；照明：明暗各12h；噪音：60dB以下。
5.实验动物标记识别
对小鼠尾部用标记笔进行标记识别，以一个原点表示1，一个线条表示5。
6.实验原理及方法
实验原理：动物的僵住症(catalepsy)是指一种以肌肉强直和运动不能为特征的状态，是研究锥体外系功能状况常用动物模型。通常认为，僵住症与中枢神经系统中乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)/多巴胺(dopamine,DA)功能的平衡失调有关。
分组：空白对照组，模型对照组，阳性对照组，各给药组(每组设3—5个剂量)。每组10只小鼠。
剂量设计：药物药效作用ED50起，2-3倍比值设置3-5个剂量组。
实验方法及步骤：一般症状观察：实验期间观察记录动物行为活动、外观体征等，一般在给药后20min开始观察。
试验试验步骤：小鼠按体重分层后，随机分为阴性对照组、空白组、阳性药物各剂量组以及化合物各剂量组，每组10只。空白组灌胃给予相应溶剂50％PEG，灌胃体积为0.1ml/10g。灌胃给药30min、60min、90min时，将小鼠两只前爪轻柔地放在长20cm,直径0.3cm,高于工作台5.5cm的小棒上,再将动物后肢轻放于盒底面,记录小鼠两只前爪在棒上保持姿势的持续时间，以30s僵直不动为阳性反应。如果小鼠前爪一直没有放下,60s时终止观察。统计每个化合物剂量组阳性反应动物数。
7.主要实验器材
抓棒器材：小鼠盒内放置直径0.3cm,高于工作台5cm的不锈钢棒。
8.数据统计处理
本文各组数据均以
表示，并采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。用概率单位法计算ED50。
9.结果与讨论
表19.III-3等4个化合物引起小鼠僵住症的ED50值
试验及动物观察结果如下：
1)阳性药阿立哌唑引起小鼠僵住症的ED50值为2.62mg/kg。
2)化合物817630-66-3、817630-59-4引起小鼠僵住症的剂量较低分别为2.39mg/kg和3.42mg/kg，观察到与剂量相关的毒性反应为镇静、嗜睡、身凉、肌松等。
3)化合物III-3盐酸盐、III-4盐酸盐在灌胃给药最大剂量100mg/Kg时，未见明显僵住症状，未观察到明显毒性反应。
研究结果提示：化合物III-3和III-4的锥体外系、镇静等副作用小于化合物817630-66-3和817630-59-4。
实施例22
化合物体外代谢稳定性试验
1.实验目的
建立肝微粒体孵育体系及其测定孵育体系中目标化合物含量的LC-MS检测方法，考察目标化合物在大鼠、比格犬和人肝微粒体中的体外代谢特征。
2.试验材料
2.1供试品制备
化合物1469745-84-3(CAS：1469745-84-3)按照CN 103360342 A中公开的合成路线方法制备。
2.2供试品及配制
母液配制：依次取化合物III-3、III-4和化合物1469745-84-3适量，精密称定为10.0mg，置10mL量瓶中，用甲醇/乙腈溶解，用pH7.4磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，得浓度为1.00g·L-1目标化合物母液。
底物溶液的配制：将上述1.00g·L-1目标化合物母液用pH7.4磷酸盐缓冲液稀释至20/35μM，4℃保存备用。
2.3对照品信息
表20.对照品相关信息
| 对照品名称(编号) | 来源 | 批号 | 纯度 | 理化性质 | 保存条件 | 备注 |
| 7-乙氧基香豆素(7-EC) | 百灵威 | LF90P35 | ≧99％ | 白色粉末 | 室温 | M＝190.2 |
2.4对照品的配制
取7-乙氧基香豆素(7-EC)的原料药适量，精密称定，用甲醇溶解，并用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，得浓度为1.02g·L-1的7-乙氧基香豆素(7-EC)标准溶液储备液；精密量取一定体积标准溶液储备液，用pH7.4磷酸盐缓冲液稀释得1000μM的7-乙氧基香豆素(7-EC)的标准溶液，于冰箱(4℃)内保存备用。
2.5其他反应液的配制
40mM氯化镁(MgCl2)溶液：称取六水合氯化镁2.03g溶于100mL纯净水中即得100mM氯化镁溶液，吸取2mL 100mM氯化镁溶液再加入3mL纯净水得40mM氯化镁溶液。
10mM NADPH溶液：称取适量NADPH，溶于磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，涡旋均匀，现配现用。
2.5主要试验仪器
表21.仪器相关信息
2.6主要试剂
表22.试剂相关信息
3.实验方法
3.1分析条件
检测化合物的色谱条件：色谱柱为Agilent Zorbax SB C18柱(150mm×4.6mm,5μm，美国Agilent公司)；预柱：C18保护柱(4mm×3.0mm,5μm，美国Phenomenex公司)；流动相：甲醇(或乙腈)-10mM醋酸铵水溶液＝70:30(v/v)；流速：1.0mL·min-1；柱温：30℃。
质谱条件：离子化方式：电喷雾离子化(ESI)；温度350℃；选择性离子监测(selected-ion monitoring，SIM)，正离子检测；干燥器温度：350℃；碎裂电压：70V；雾化器压力(psi)：35；干燥气流速8.0L/min；高度真空1.3E-005Torr。
3.2实验步骤
取120μL冰冷的pH7.4磷酸盐缓冲液，20μL冰冷的40mM MgCl2溶液，混匀，再加入20μL 20μM标准工作液(底物反应浓度为2.0μM)，混匀，加入20μL冰冷的10g/L大鼠、比格犬和人肝微粒体蛋白(反应浓度为1.0g/L)，37℃恒温水浴锅内预孵5min，再加入20μL同样预孵5min的10mM NADPH(反应浓度为1.0mM)启动反应，摇匀，37℃水浴锅内孵育0h，5min，10min，20min，30min和60min，400μL冰甲醇终止反应，涡旋3min，4℃下12,000rpm离心10min，取上清液20μL利用建立好的LC-MS方法检测各孵育时间点孵育体系中目标化合物的浓度，通过与0小时样品浓度比较，测定目标化合物经与大鼠、比格犬和人肝微粒体孵育后的代谢率。
阴性对照组孵育
终浓度为2.0/3.5μM的目标化合物与不加肝微粒体的实验体系孵育，时间为1.0h，检测目标化合物在孵育体系中的稳定性。在0h和1h加入二倍体积的冰甲醇终止反应，涡旋5min后12000rpm离心10min，取上清液进行LC-MS分析，每个样品重复两份。
阳性对照组孵育
终浓度为100μM的7-乙氧基香豆素分别与大鼠、比格犬和人肝微粒体一起孵育，预孵5min后加NADPH启动反应，孵育时间为2小时，检测微粒体在孵育体系中的活性。在0和2小时，分别加入三倍体积的甲醇终止反应，涡旋5min后12000rpm离心10min，取上清液进行LC-MS分析，每个样品重复两份。
4.数据处理和统计分析
所得试验数据利用EXCEL进行统计分析。
5.实验结果及分析
化合物III-3、III-4和化合物1469745-84-3在大鼠、比格犬和人肝微粒体中孵育5min，10min，20min，30min和60min后样品利用LC-MS方法检测。检测结果以0min时间点的峰面积作为100％，其他时间点的峰面积转换为百分剩余量，取各时间点百分剩余量的自然对数对孵育时间作图，以孵育时间为横坐标，各时间点百分剩余量的自然对数为纵坐标，直线回归求算出斜率-k(截距为0)，将斜率-k代入公式t1/2＝—0.693/k求得半衰期，然后按照固有清除率Clint＝0.693/t1/2×[V]/[P]。
[V]代表孵育液的体积，[P]代表孵育体系中酶蛋白的含量，即可求得体外固有清除率。3个化合物的酶促反应动力学参数见表18。
表23.目标化合物的酶促反应动力学参数
T1/2：半衰期；CLint(mic)：固有清除率
试验结果表明：化合物1469745-84-3在大鼠、比格犬和人肝微粒体中代谢半衰期很短，说明其代谢稳定性差，预示其体内清除率高，生物利用度低。
化合物III-3、III-4在大鼠、比格犬和人肝微粒体中的代谢半衰期较长，尤其是在人肝微粒体中代谢半衰期分别为64.17min和28.4min，说明这两个化合物的代谢稳定性较好，代谢清除率较小，预示其体内清除率较小、口服生物利用度高。
实施例23
化合物Ⅲ-3和Ⅲ-4的盐酸盐的细菌回复突变试验
菌种：鼠沙门氏菌组氨酸营养缺陷突变株TA97，TA98，TA100和TA102。
结果：实验包括-S9和+S9两个部分，在无S9测试系统中TA98和加S9测试系统中TA97 5000μg/皿有抑菌作用。其它剂量对所有菌株均无抑菌作用，生长背景良好。所有测试剂量无论在无S9或加S9实验系统中，化合物Ⅲ-3和Ⅲ-4均未引起任何菌落回变数明显增加，Ames试验阴性。
上述研究结果表明：化合物Ⅲ-3和Ⅲ-4体外对5-HT1A受体具有选择性高亲和活性；Ⅲ-3盐酸盐在小鼠尾悬挂试验中，经灌胃给药，三组剂量下均具有显著抗抑郁作用，在小鼠强迫游泳试验中，经灌胃给药两组剂量下均具有显著抗抑郁作用，其口服吸收较好；化合物Ⅲ-3盐酸盐的Ames试验呈阴性；化合物Ⅲ-4盐酸盐在小鼠强迫游泳试验中，经灌胃给药两组剂量下均具有显著抗抑郁作用，其口服吸收较好；化合物Ⅲ-3盐酸盐的Ames试验呈阴性。化合物Ⅲ-3和Ⅲ-4具备作为新型抗抑郁、抗焦虑药研究开发。
Claims (10)
1.3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物，其特征在于，为具有式(III)所示的化合物或其游离碱或盐：
其中：R1代表氢，C1-5烷氧基、氯、溴、碘、取代或未取代的C1-5烷基，所述C1-5烷基的取代基选自氨基、羟基或氟中的一种或几种；
R2代表氢，氟、氯、溴或碘、或未取代的C1-5烷基或三氟甲基；
R3代表氢或卤素；
X代表CH或N；
n＝1或2；
当R1为C1-5烷氧基或取代或未取代的C1-5烷基时；R2、R3不同时为氢；当R2为未取代的C1-5烷基时；R1、R3不同时为氢；当R3为氟时，R1、R2不同时为氢；且R1、R2、R3不同时为氢。
2.根据权利要求1所述的3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物，其特征在于，所述的卤素为氟、氯、溴或碘。
3.根据权利要求1所述的3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物，其特征在于，所述的C1-5烷氧基为甲氧基、乙氧基或丙氧基、丁氧基；未取代的C1-5烷基为甲基、乙基、丙基、丁基、正戊基、异戊基或新戊基；取代的C1-5烷基为三氟甲基、氟代乙基、羟甲基或羟乙基。
4.根据权利要求1所述的3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物，其特征在于，为具有式(III)所示的化合物或其游离碱或盐：
其中：
R1代表H，OCH3、Cl、CH3或CF3；
R2代表H，CF3、Cl或CH3；
R3代表H，F或Cl；
X代表CH或N；
n＝1或2；
当R1为OCH3、CH3时，R2、R3不同时为H；当R2为CH3时，R1、R3不同时为H；当R3为F时，R1、R2不同时为H；R1、R2、R3不同时为H。
5.根据权利要求1所述的3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物，其特征在于，所述的盐为盐酸盐、溴氢酸盐、硫酸盐、三氟醋酸盐或甲磺酸盐。
6.3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物，其特征在于，为如下化合物或其盐：
Ⅲ-1 3-(3-(4-(2,3-二氯苯基)哌嗪-1-基)丙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-2 3-(3-(4-(2,3-二甲基苯基)哌嗪-1-基)丙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-3 3-(2-(4-(2,3-二氯苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-4 3-(2-(4-(2,3-二甲基苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-5 3-(2-(4-(2,3-二氯-4-氟代苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-6 3-(2-(4-(2-氯-4-氟代苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-7 3-(2-(4-(4-氟-3-氯苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-8 3-(2-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-9 3-(2-(4-(3-(三氟甲基)苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-10 3-(2-(4-(3-氯苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-11 3-(3-(4-(2,3-二三氟甲基苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-12 3-(2-(4-(吡啶-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈、
Ⅲ-13 3-(2-(4-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈或
Ⅲ-14 3-(2-(4-(4-氯吡啶-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯甲腈。
7.权利要求1～6任一项所述的3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物在制备治疗中枢神经系统紊乱性疾病药物中的应用。
8.根据权要求7所述的应用，其特征在于，所述的中枢神经系统紊乱性疾病，为抑郁症、焦虑症、神经性疼痛。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的中枢神经系统紊乱性疾病为抑郁症、焦虑症、神经性疼痛，躁狂症、各种双向情感障碍、精神分裂症、帕金森病(PD)、亨廷顿舞蹈病(HD)、阿尔茨海默氏病、老年性痴呆、阿尔茨海默氏型痴呆、执行功能丧失、血管性痴呆和其它痴呆，以及其它与智力、学习或记忆相关的功能障碍性疾病。
10.药物组合物，其特征在于，包括治疗有效量权利要求1～6任一项所述的3-氰基苯氧烷基芳基哌嗪衍生物和医药学上可接受的载体。
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| Synthesis and structure-activity relationship in 1-aryloxy-3-[N1-(N4-arylpiperazinyl)]propanes;SHIV K AGARWAL等;《Indian Journal of Chemistry》;19870731;第26B卷;第642-646页 * |
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