CN109276615A

CN109276615A - 丹红化瘀组合物的新应用

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Publication number: CN109276615A
Application number: CN201811362140.8A
Authority: CN
Inventors: 林娟; 林宝琴; 王德勤; 李楚源; 张凡; 张一凡; 覃仁安
Original assignee: GUANGZHOU BAIYUNSHAN HEJI HUANGPU CHINESE MEDICINE CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU BAIYUNSHAN HEJI HUANGPU CHINESE MEDICINE CO Ltd
Priority date: 2018-11-15
Filing date: 2018-11-15
Publication date: 2019-01-29

Abstract

本发明公开了一种丹红化瘀组合物作为SIRT1激动剂的应用，所述丹红化瘀组合物包括丹参、当归、川芎、桃仁、红花、柴胡和枳壳七味中药，丹红化瘀组合物作为SIRT1激动剂，能够调节血管中SIRT1蛋白的表达，在相关疾病的防治中可起到关键作用，特别地，丹红化瘀组合物起效时间快，作用确切，可用于静脉栓塞性疾病的早期预防。

Description

丹红化瘀组合物的新应用

技术领域：

本发明涉及丹红化瘀方的新用途，具体涉及丹红化瘀组合物作为组蛋白去乙酰化酶激动剂的应用。

背景技术：

SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog 1)是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的组蛋白去乙酰化酶，其生理作用非常复杂，与细胞衰老、寿命延长、抗氧化应激和能量代谢调节等细胞多种功能活动有关。SIRT1的底物包含组蛋白(组蛋白H1的K26，组蛋白H3的K9和组蛋白H4的K16)和非组蛋白(涉及细胞凋亡，神经元保护，器官代谢功能，细胞衰老和肿瘤发生等)和各种转录因子等。SIRT1蛋白由500个氨基酸残基组成，翻译后的蛋白质相对分子量大小约60kD。

丹红化瘀口服液收载于《中国药典》2015年版，具有活血化瘀、行气通络的功效。用于气滞血瘀引起的视物模糊不清，突然不见症；视网膜中央静脉阻塞症的吸收期见上述证候者。现代药理学研究发现(参见CN 101653499 B)，丹红化瘀方(DHK)对早期糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病均有很好的防治作用。另外，丹红化瘀方(DHK)可显著延长凝血时间和出血时间，抑制静、动脉血栓的形成和发展。但是，目前未有相关研究表明丹红化瘀方(DHK)作为SIRT1激动剂的应用，对SIRT1蛋白具有调节作用。

发明内容：

本发明的目的是提供一种丹红化瘀组合物作为SIRT1激动剂的应用，丹红化瘀组合物作为SIRT1激动剂，能够调节血管中SIRT1蛋白的表达，在相关疾病的防治中可起到关键作用。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

丹红化瘀组合物作为SIRT1激动剂的应用。

所述丹红化瘀组合物(简称DHK)包括丹参、当归、川芎、桃仁、红花、柴胡和枳壳七味中药，七味中药的质量百分比分别为10％-51％、5％-46％、8％-50％、5％-46％、5％-46％、5％-46％和3％-42％。

丹红化瘀组合物作为SIRT1激动剂能够调节血管中SIRT1蛋白的表达，起效时间快，作用确切，可用于静脉栓塞性疾病的早期预防。

SIRT1是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的组蛋白去乙酰化酶。

丹红化瘀组合物作为SIRT1的激动剂，上调SIRT1蛋白，抑制炎症反应。

丹红化瘀组合物作为SIRT1的激动剂，可以上调SIRT1蛋白，从而促进SIRT1蛋白去乙酰化修饰NF-κB p65，直接抑制NF-κB转录炎症因子和TF。

丹红化瘀组合物作为SIRT1的激动剂，可以上调SIRT1蛋白，从而促进SIRT1蛋白去乙酰化修饰Akt，通过Akt/GSK3β信号通路间接抑制NF-κB转录活性，抑制炎症反应。

本发明还保护一种SIRT1激动剂，其特征在于，包括丹参、当归、川芎、桃仁、红花、柴胡和枳壳七味中药。

特别地，七味中药的质量百分比分别为10％-51％、5％-46％、8％-50％、5％-46％、5％-46％、5％-46％和3％-42％。

本发明还保护SIRT1激动剂的应用，SIRT1激动剂能够调节血管中SIRT1蛋白的表达，起效时间快，作用确切，SIRT1激动剂在制备预防或治疗静脉栓塞性疾病药物中的应用。

在制备预防或治疗静脉栓塞性疾病药物时，还包括药学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。

药学上可以接受的载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂；所述剂型包括片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。

本发明的有益效果如下：

1)丹红化瘀组合物作为SIRT1的激动剂，可以上调SIRT1蛋白，从而促进SIRT1蛋白去乙酰化修饰NF-κB p65，直接抑制NF-κB转录炎症因子和TF。

2)丹红化瘀组合物作为SIRT1的激动剂，可以上调SIRT1蛋白，从而促进SIRT1蛋白去乙酰化修饰Akt，通过Akt/GSK3β信号通路间接抑制NF-κB转录活性，抑制炎症反应。

3)丹红化瘀组合物作为SIRT1激动剂，通过调控炎性反应等作用机制，具有抑制静脉血栓伴行的炎症反应，抑制中性粒细胞和单核细胞浸润，抑制血清中CRP、IL-1β和TNF-α的释放的作用，在静脉栓塞性疾病的防治中可起到关键作用，

总之，丹红化瘀组合物作为SIRT1激动剂，能够显著调节血管中SIRT1蛋白的表达，在相关疾病的防治中可起到关键作用，特别地，丹红化瘀组合物起效时间快，作用确切，可用于静脉栓塞性疾病的早期预防。

附图说明：

图1是造模1d时DHK对血管壁和血栓内的TF表达的影响(HE染色，×400)；

图2是造模1d时DHK对血管内壁炎性细胞的影响(±SD,n＝5)；

图3是造模1d时DHK对血清CRP,IL-1β和TNF-α的影响(±SD,n＝6-10)；

图4是造模1d时DHK对血管壁蛋白表达的影响(±SD,n＝3-4)。

具体实施方式：

以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：DHK调控SIRT1/NF-κB信号通路的作用研究

1、实验动物：SPF级SD大鼠；雌雄各半；共30只；250-280g

2、实验药物与仪器：

生理盐水(佛山双鹤药业有限公司)、赛拉嗪注射液(吉林省华牧动物保健品有限公司)、戊巴比妥钠(德国默克公司)、注射用头孢曲松钠(深圳立健药业有限公司)、2％盐酸利多卡因(湖北天药药业有限公司)、大鼠CRP ELISA试剂盒(南京建成公司)、大鼠IL-1βELISA试剂盒(美国eBioscience公司)、大鼠TNF-αELISA试剂盒(联科生物科技有限公司)、大鼠PAI-1ELISA试剂盒(英国Abcam公司)、大鼠tPAELISA试剂盒(英国Abcam公司)、BCA蛋白检测试剂盒(康维世纪有限公司)、Anti-SIRT1antibody(abcam公司)、Anti-Akt antibody(CST公司)、Anti-p-Akt antibody(CST公司)、Anti-p65antibody(CST公司)、Anti-p-p65antibody(CST公司)、Anti-GAPDH antibody(CST公司)、Anti-TF antibody(abcam公司)、Rabbit lgG antibody(HRP)二抗(GeneTex公司)、Goat anti-Mouse IgG(HRP)二抗(联科生物科技有限公司)。

针灸针(0.35×50mm)、注射器、剃毛刀、手术刀、碘伏、棉签、医用纱布、固定板、棉线、5-0号爱惜康线、玻璃分针、缝合针、手术剪、镊子、枸橼酸钠抗凝管、真空采血管等。

3.溶液配制

(1)注射用头孢曲松钠1.0g溶于1wt％盐酸利多卡因3.5mL中，即浓度为285.8mg/mL。可知头孢曲松钠的给药体积剂量为：1.46mL/kg；

(2)1wt％盐酸利多卡因：精确吸取2wt％盐酸利多卡因10mL，加入至含10mL生理盐水的50mL EP管中即得，现配现用；

(3)3wt％戊巴比妥钠溶液：精确称取0.6000g戊巴比妥钠粉末于50mL试剂瓶中，量取20mL生理盐水充分混匀，室温保存；

(4)1mol/LNaOH溶液：精确称取0.4000gNaOH粉末，加入至含10mL蒸馏水的20mL EP管中溶解即得，放置4℃冰箱保存；

(5)PBS溶液的配制：精确称取NaCl：4.0000g、KCl：0.1000g、Na₂HPO₄：0.7000g、KH₂PO₄：0.1200g溶于500mL蒸馏水中混匀，加入1mol/L的NaOH溶液调节PH至7.20-7.40，放置4℃冰箱保存。

(6)4wt％多聚甲醛溶液：精确称取多聚甲醛20.0000g，溶解于500mLPBS溶液中，用1mol/L的NaOH调节pH至7.40后，在37℃下加热搅拌至溶解，放置4℃冰箱保存。

(7)DHK配置：按大鼠平均体重0.28kg，每组10只动物，给药体积为28mL，计算给药量为9.0mL原液，则给药浓度为0.32mL原液/mL；取9.6mL原液加入20.4mL蒸馏水稀释至30mL备用。

4.实验分组

设置假手术组、模型组、DHK组，每组10只，雌雄各半。

5.给药方式

造模后1h开始给药，24h后再次给药，末次给药1.5h后取样。

6.给药剂量

(1)假手术组灌胃给予10mL/kg/d的蒸馏水，只开腹不结扎；

(2)模型组灌胃给予10mL/kg/d的蒸馏水；

(3)DHK组：临床上DHK成人给药剂量为30mL原液/60kg/d，根据等效剂量换算，大鼠的灌胃给予剂量为3.2mL原液/kg/d，给药体积为10mL/kg/d。

7.造模方法

动物禁食12h，称量禁食后的体重。手术前1h肌肉注射头孢曲松钠防止术后感染。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(3wt％，1.2mL/kg)。沿大鼠腹腔剃毛，碘酒消毒；用手轻轻按压大鼠腹部正中，将小肠盲肠分别向正中切线两侧按压。在膀胱上方大约4cm处开始沿着正中切口划开腹腔，开口两侧铺上用生理盐水浸润的纱布，用棉签打开后腹膜。左肾静脉下方与下腔静脉交界处为结扎点。使用棉签和玻璃分针仔细游离下腔静脉，在结扎点穿过5-0爱惜康线，另取0.35×50mm规格的针灸针与下腔静脉主干并排，5-0号线打结之后，谨慎抽出并排的针，完成造模。确认大鼠呼吸循环系统平稳，逐层关腹，皮下洒少许抗生素粉末。造模完成后腹腔注射1.5mL生理盐水，防止手术后缺水。

8.观测指标

8.1血管壁和血栓中TF的表达

大鼠采血后，分离IVC(含血栓)，置于4wt％多聚甲醛固定48h。固定好的组织脱水、石蜡包埋、切片(4μm)、脱蜡、3％H₂O₂灭活内源性酶，枸橼酸盐缓冲液进行热修复抗原，免疫组化法检测血栓及静脉壁上TF的表达。

8.2炎症相关指标检测

(1)组织学分析及炎性细胞计数

大鼠采血后，分离IVC(含血栓)，每组编号前五只动物的IVC置于4wt％多聚甲醛固定液中充分固定48h以上，进行HE病理切片染色，高倍镜下(400倍)观察静脉壁内的炎性细胞浸润程度。并选取5个视野，计数静脉壁内的炎性细胞数量，主要包括中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞。

(2)炎症因子

造模1d天，大鼠颈总动脉采血2mL置于4mL普通EP管中，室温静置30min后于2000×g，4℃下离心10min，分装血清并保存在-80℃冰箱中。酶联免疫吸附法检测血清IL-1β及TNF-α浓度，乳胶增强免疫比浊法检测血清中CRP水平。

8.3蛋白表达检测

大鼠采血后，分离IVC(含血栓)，每组编号后五只大鼠的IVC置于-80℃保存。Western blot法检测造模1d血栓(包含静脉壁)中SIRT1、p-Akt、TF、p-p65等蛋白的表达。

9.数据处理

采用SPSS 20.0版软件对所有数据进行统计学分析。数据以mean±SEM表示，两组数据间采用t-检验分析，各组间用ANOVA单因素方差分析，P≤0.05者认为有显著性差异。

10.实验结果

10.1血栓及静脉壁上TF表达

参见图1，造模1d时，假手术组基本不表达TF；模型组血管壁和血栓内表达大量TF；同模型组相比，DHK抑制TF表达。

10.2炎症相关指标

10.2.1炎性细胞计数

同假手术组相比，造模1d时模型组中性粒细胞和单核细胞显著增加；同模型组相比，DHK使造模1d的中性粒细胞和单核细胞显著减少(P≤0.05)。见表1、图2。

表1造模1d时DHK对血管内壁炎性细胞的影响

与空白组相比，^*P≤0.05，^**P≤0.01；与模型组相比，^aP≤0.05and^bP≤0.01.

10.2.2炎症因子

造模1d时，同假手术组相比，模型组血清中CRP、IL-1β和TNF-α分别升高13.80％、158.47％和89.68％；同模型组相比，DHK使炎症因子水平分别降低14.15％、62.15％和21.66％。见表2、图3。

表2造模1d时DHK对血清CRP,IL-1β和TNF-α的影响

与空白组比较，*P≤0.05and**P≤0.01；与模型组比较，^aP≤0.05and^bP≤0.01

10.3血管壁蛋白表达

同假手术组相比，模型组SIRT1及p-Akt的蛋白表达显著降低(P≤0.05)，p-p65及TF的蛋白显著升高(P≤0.05)；同模型组比，DHK显著提高SIRT1和p-Akt的蛋白表达(P≤0.05)，显著降低血管p-p65、TF蛋白表达(P≤0.05)，见表3、图4。

表3造模1d时DHK对血管壁蛋白表达的影响

与空白组比较，*P≤0.05and**P≤0.01；与模型组比较，^aP≤0.05,^bP≤0.01.

11.实验结论

本发明丹红化瘀组合物DHK可显著降低造模1d时中性粒细胞和单核细胞浸润，显著减少血清中CRP、IL-1β和TNF-α的含量，提示DHK调节血栓中SIRT1蛋白可能与抗炎相关。

DHK显著提高造模1d血管SIRT1和p-Akt的蛋白表达，同时可显著降低血管p-p65、TF蛋白表达，该结果提示DHK可上调血管SIRT1蛋白，一方面去乙酰化修饰NF-κB p65，直接抑制NF-κB转录炎症因子和TF，另一方面去乙酰化修饰Akt，通过Akt/GSK3β信号通路间接抑制NF-κB转录活性，抑制炎症反应而防治血栓形成。从以上结果可得出DHK可以作为SIRT1激动剂，通过负向调控炎性反应等作用机制，在静脉栓塞性疾病的防治中可起到关键作用。

动物自发形成静脉血栓栓塞的概率极低，在大多数静脉血栓栓塞动物模型中，是将健康的实验动物通过病理生理学刺激或者物理刺激来作为产生血栓形成和闭塞的条件。常见的方法主要有：下腔静脉结扎法、股静脉结扎法、氯化铁法、电解下腔静脉法、血栓诱导剂干预法、机械损伤法、直接造成静脉内皮损伤、机械击打装置法等。

本发明所采用的模型为下腔静脉狭窄法血栓模型，该方法操作简便，且可以使内皮细胞的损伤降到最低，血液的流动可以得到维持，能较好的模拟临床上静脉血栓栓塞形成的过程。

Claims

1.丹红化瘀组合物作为SIRT1激动剂的应用。

2.根据权利要求1所述的丹红化瘀组合物作为SIRT1激动剂的应用，其特征在于，所述丹红化瘀组合物包括丹参、当归、川芎、桃仁、红花、柴胡和枳壳七味中药，七味中药的质量百分比分别为10％-51％、5％-46％、8％-50％、5％-46％、5％-46％、5％-46％和3％-42％。

3.根据权利要求1或2所述的丹红化瘀组合物作为SIRT1激动剂的应用，其特征在于，丹红化瘀组合物作为SIRT1激动剂能够调节血管中SIRT1蛋白的表达。

4.根据权利要求3所述的丹红化瘀组合物作为SIRT1激动剂的应用，其特征在于，丹红化瘀组合物作为SIRT1的激动剂，上调SIRT1蛋白，抑制炎症反应。

5.根据权利要求4所述的丹红化瘀组合物作为SIRT1激动剂的应用，其特征在于，丹红化瘀组合物作为SIRT1的激动剂，上调SIRT1蛋白，从而促进SIRT1蛋白去乙酰化修饰NF-κBp65，直接抑制NF-κB转录炎症因子和TF。

6.根据权利要求4所述的丹红化瘀组合物作为SIRT1激动剂的应用，其特征在于，丹红化瘀组合物作为SIRT1的激动剂，上调SIRT1蛋白，从而促进SIRT1蛋白去乙酰化修饰Akt，通过Akt/GSK3β信号通路间接抑制NF-κB转录活性，抑制炎症反应。

7.一种SIRT1激动剂，其特征在于，包含丹参、当归、川芎、桃仁、红花、柴胡和枳壳七味中药。

8.根据权利要求7所述的SIRT1激动剂，其特征在于，七味中药的质量百分比分别为10％-51％、5％-46％、8％-50％、5％-46％、5％-46％、5％-46％和3％-42％。

9.权利要求7或8所述的SIRT1激动剂的应用，其特征在于，SIRT1激动剂在制备预防或治疗静脉栓塞性疾病药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在制备预防或治疗静脉栓塞性疾病药物时，还包括药学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。