CN109275661B

CN109275661B - 一种触发控释性植物抗冻剂及其制备方法

Info

Publication number: CN109275661B
Application number: CN201811092655.0A
Authority: CN
Inventors: 陶树明; 刘建国
Original assignee: Beijing Zhonggeng Oasis Ecological Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Zhonggeng Oasis Ecological Technology Co ltd
Priority date: 2018-09-13
Filing date: 2018-09-13
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2038-09-13
Also published as: CN109275661A

Abstract

本发明公开了一种触发控释性植物抗冻剂及其制备方法。该植物抗冻剂为聚合物包膜微胶囊形式，具有H₂O₂触发释放的特点。本发明提供的植物抗冻剂具有聚合物膜，有效保护微胶囊内装载的活性物质，减少在运输，使用过程中的损失。微囊中包裹具有抗冻作用的可溶性糖，既能保护活性酶，也能提高作物抗冻性能。采用聚硫醚化合物作为膜材料，利用硫醚与H₂O₂反应生成亚砜和砜的原理，增大膜材料水溶性，从而实现H₂O₂(10nmol/L‑5000nmol/L浓度范围内)触发控释功能。通过反相微胶囊制剂，制备具有纳米级微胶囊颗粒，并且具备油脂亲和性的外壳，使其更易被植物吸收，使活性物质抵达患处，高效作用。

Description

一种触发控释性植物抗冻剂及其制备方法

技术领域

本发明属于农业种植领域，具体涉及一种触发控释性植物抗冻剂及其制备方法。

背景技术

冷胁迫是影响我国北方地区作物生长发育，降低作物品质及产量的一个重要因素。冷胁迫对作物的整个生育过程都会造成不同程度的影响，如种子萌发、作物的生长发育、产量和品质形成等(秦东玲,李钊,尉菊萍等,作物抗冷性及其化学控制机理研究进展[J],作物杂志,2016(4)：26-35)。遭受冷胁迫后，作物会主动调节适应，自身能诱导特异性基因表达来降低冷胁迫的危害来适应逆境，但当胁迫强度过大或持续时间过长会对作物造成不可逆的伤害。

相关研究发现发生低温冷害时生物膜首先发生膜脂相变，从液晶相向凝胶相转变膜，膜发生收缩并出现裂缝或孔道，使膜的透性大大增加，质体内离子、可溶性物质、电解质大量外渗，失去离子平衡，同时膜上ATP酶活力降低，酶促反应失调，氧化磷酸化解偶联，代谢失调。受害后常表现出呼吸作用下降，能量供应减少，植物体积累大量有毒物质，尤其是活性氧和自由基大量积累，使膜脂过氧化，破坏膜结构亚单位功能，造成细胞伤害。同时，低温可使得叶绿素合成受抑制和破坏叶绿体结构，导致光合能力下降。主要作物生理指标表现为膜稳定性减弱，过量活性氧自由基积累，膜脂过氧化造成丙二醛(MDA)积累，席夫碱类物质积累等。

近年来，国内外学者在提高作物抗冷性方面进行了大量研究，当前研究热点主要集中在作物抗冷基因鉴别、筛选及表达；作物抗冷生理生化变化；以及化学控制的研究等方面，作物化学调控技术是添加植物生长调节剂，通过改变作物细胞内化学环境及内源激素作用调节作物生长发育。由于化学控制具有见效快，成本低，易于操作实施等特点，成为应用推广热门方向，目前已经研究的化学调控外援激素类主要包括脱落酸ABA、多效唑(PP333)、烯效唑(S-3307)、6-苄基腺嘌呤(6-BA)、油菜素内酯(BR)、GB、水杨酸(SA)、茉莉酸类(JAs)和5-氨基乙酰丙酸(ALA)等；无机调节剂主要有钙、锌、铜、锰等中微量元素；化学物理覆盖保暖制剂主要有白石灰，壳聚糖等。具体使用方式也分为土施，浸种，叶面喷施，种子包衣处理等。

但是化学调控制剂，尤其是激素及生物酶类物质存在易光解，易失活，与其它肥料和药剂配伍性差等缺点，并且单一化学生长调节制剂加入，很难到达预期作用位置高效的发挥作用，对作物冷害胁迫缓解效果十分有限，因此，开发一种具有响应释放功能的微囊型植物抗冻剂具有重大意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种触发控释性植物抗冻剂及其制备方法。

该植物抗冻剂为聚合物包膜微胶囊形式，具有H₂O₂触发释放的特点。

本发明所提供的制备抗冻剂的方法，包括如下步骤：

1)将水溶性糖、活性酶、聚乙二醇-二烯丙基硫醚嵌段聚合物、缓冲液和水相表面活性剂溶于水中混匀，得到水相；

2)将成膜单体、助表面活性剂和油相表面活性剂于有机溶剂中混匀，得到油相；

3)将所述水相和油相混合，乳化，搅拌反应，得到反相微胶囊悬浮乳液，干燥后收集固体得到所述抗冻剂。

上述方法的步骤1)中，水溶性糖选自水溶性单糖、二糖和寡糖中至少一种；具体选自蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖、棉子糖、果糖、壳聚糖、麦芽糖、半乳糖、木糖和大豆低聚糖中至少一种；

所述活性酶选自辣根过氧化物酶、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)中至少一种；

所述聚乙二醇-二烯丙基硫醚嵌段聚合物由聚乙二醇(PEG)、丙烯基溴(DA)和具烯烃硫醚聚合而得；其中，所述PEG具体选自PEG-600、PEG-800和PEG-1000中至少一种；所述具烯烃硫醚具体选自二烯丙基硫醚(DAS)、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、苯基乙烯基硫醚、甲基乙烯基硫醚和乙基乙烯基硫醚中至少一种；所述聚乙二醇-二烯丙基硫醚嵌段聚合物更具体为PEG800-DAS；该PEG800-DAS可按照包括如下步骤的方法制得：选用烯丙基聚乙二醇800(cas号：27274-31-3，购于江苏海安石油化工厂)，和二烯丙基硫醚(购于阿拉丁)。在500mL反应瓶中加入100mL乙醇，投入10g烯丙基聚乙二醇800，5g二烯丙基硫醚，加入0.2g光引发剂安息香，在波长420nm紫光灯下照射6h，以300r/s持续搅拌至反应完全，旋蒸后得到聚合物PEG800-DAS。

所述缓冲液选自PBS缓冲液、HCl-tris缓冲液和TE缓冲液中至少一种；所述缓冲液的pH值为6.8-8.5；具体为7.2-8.0；

所述水相表面活性剂选自磺酸酯、C1～C20的羧酸或脂肪酸、琥珀酸酯、烷基苯磺酸钠、聚氧乙烯基壬基苯基醚磺酸钠、烷基吡啶盐、硬脂酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、十二烷基苯磺酸钠(LAS)、脂肪胺盐、季铵盐、吐温-60、吐温-80、聚氧乙烯醇、壬基酚聚氧乙烯醚和烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10)至少一种；

所述水溶性糖、活性酶、聚乙二醇-二烯丙基硫醚嵌段聚合物、缓冲液、水相表面活性剂和水的用量比为(1～12)g:(1～10)g:(1～50)g:(1～10)ml:(1～10)g:100ml；具体为6-12g:5-6g:10-12g:1-4ml:2g:100ml或为12g:2g:10g:2ml:2g:100ml；

所述混匀步骤中，温度为0～60℃；具体为30℃-35℃；时间为10min～60min；具体为10-15min；搅拌转速为100～900rpm；具体为600-800rpm。

所述步骤2)中，所述有机溶剂选自乙醚、苯甲醚、乙二醇二乙醚、丁醚、环己烷、异辛烷、松脂基植物油、油酸甲酯、环氧化植物油、植物精油和生物柴油中至少一种；

所述成膜单体选自甲苯二异氰酸酯(TDI)、二苯基甲烷二异羟酸酯(MDI)、六亚甲基二异氰酸酯(HDI)和异佛尔酮二异氰酸酯(IPDI)中至少一种；

所述助表面活性剂选自正丁醇、异丁醇、正戊醇、异戊醇、1-己醇、2-辛醇、C12～C30的脂肪酸、脂肪酸甘油酯、乙二醇低碳醇醚和丙二醇低碳醇醚中至少一种；所述C12～C30的脂肪酸具体可为月桂酸；

所述油相表面活性剂为非离子型乳化剂；具体选自SPAN-20、SPAN-40、农乳600、农乳700和农乳1602中的至少一种；

所述成膜单体、助表面活性剂、油相表面活性剂和有机溶剂的用量比为：(0～3)g：(0～5)g:(0～5)g:100ml；且所述成膜单体、助表面活性剂、油相表面活性剂的用量均不为0；具体的，所述成膜单体、助表面活性剂、油相表面活性剂和有机溶剂的用量比为：2-2.5g：5-5.3g:5-5.3g:100ml或2g：4g:2.5g:100ml；

所述混匀步骤中，温度为0～70℃；具体为25℃；时间为10min～60min；具体为20min；搅拌转速为100～900rpm；具体为500-600rpm。

所述步骤3)乳化步骤中，转速为1000～6000rpm；具体为3000-4000rpm；时间30s～600s；具体为200s-300s。

所述水相和所述油相的质量比为1：(1～5)。

所述步骤3)搅拌反应步骤中，温度为常温；转速为300～1000rpm；具体为500～800rpm或600rpm；反应时间为3～12h；具体为5～10h或6h或8h。

所述方法还包括：在所述步骤3)干燥步骤之前，向所得反相微胶囊悬浮乳液中加入破乳剂。

具体的，所述破乳剂选自丙酮、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醇醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基苯酚醚和聚氧乙烯聚氧丙烯多乙烯多胺醚中至少一种；

所述反相微胶囊悬浮乳液和所述破乳剂的质量比为(400～10000)：1；具体为450-700：1；更具体为450:1、566:1或638:1。

另外，上述方法制备得到的抗冻剂及该抗冻剂在植物抗冻中的应用，也属于本发明的保护范围。

具体的，所述抗冻剂由聚合物膜和包裹在所述聚合物膜中的核芯组成；

其中，所述聚合物膜由所述成膜单体的聚合产物和所述聚乙二醇-二烯丙基硫醚嵌段聚合物组成；

所述聚合物膜的厚度具体为10-200nm；具体为10-50nm；

所述核芯由所述水溶性糖、活性酶和聚乙二醇-二烯丙基硫醚嵌段聚合物组成；

所述核芯的粒径具体为90-1900nm；具体为90-150nm；

所述抗冻剂的粒径具体为100～2000nm；更具体为100-200nm。

本发明提供的植物抗冻剂具有聚合物膜厚度主要通过膜材料投入量来调控，微胶囊粒度大小通过乳化速度和时间来调控，释放性能可通过上述方面及膜材料结构和分子量来调控，根据实际应用地点及作物来具体设计。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的植物抗冻剂具有聚合物膜，有效保护微胶囊内装载的活性物质，减少在运输，使用过程中的损失。

微囊中包裹具有抗冻作用的可溶性糖，既能保护活性酶，也能提高作物抗冻性能。

采用聚硫醚化合物作为膜材料，利用硫醚与H₂O₂反应生成亚砜和砜的原理，增大膜材料水溶性，从而实现H₂O₂(10nmol/L-5000nmol/L浓度范围内)触发控释功能。通过反相微胶囊制剂，制备具有纳米级微胶囊颗粒，并且具备油脂亲和性的外壳，使其更易被植物吸收，使活性物质抵达患处，高效作用。

附图说明

图1为聚乙二醇-二烯丙基硫醚嵌段聚合物合成示意图。

图2为触发控释性植物抗冻剂示意图。

图3为实施例1制备的触发控释性植物抗冻剂透射电镜图。

图4为实施例1制备触发控释性植物抗冻剂作用效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

实施例1、

首先制备聚合物PEG800-DAS：选用烯丙基聚乙二醇800(cas号：27274-31-3，购于江苏海安石油化工厂)，和二烯丙基硫醚(购于阿拉丁)。在500mL反应瓶中加入100mL乙醇，投入10g烯丙基聚乙二醇800，5g二烯丙基硫醚，加入0.2g光引发剂安息香，在波长420nm紫光灯下照射6h，以300r/s持续搅拌至反应完全，旋蒸后得到聚合物PEG800-DAS。

在200ml反应瓶中加入100ml去离子水，加入pH 7.2的PBS缓冲液1ml，5g水溶性糖海藻糖，1g葡萄糖，5g活性酶超氧化物歧化酶SOD，10g聚合物PEG800-DAS，2g吐温-80，30℃转速为800rpm的条件下搅拌10min至分散均匀，得到水相Ⅰ；

在具备加热和搅拌设备的反应器中，加入有机溶剂乙醚200ml、成膜单体甲苯二异氰酸酯(TDI)5g、助表面活性剂月桂酸10g和10g油相表面活性剂SPAN-40，室温25℃转速为500rpm的条件下搅拌20min至溶解分散均匀，得到油相Ⅱ；

将所述水相Ⅰ加入到所述油相Ⅱ中，在3000rpm转速高速剪切搅拌分散(也即乳化)300s，乳化完成后室温500rpm转速搅拌10h，制备得到触发控释性植物抗冻剂悬浮乳液319g，加入0.5g破乳剂聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醇醚破乳，离心后收集固体，干燥后得到触发控释性植物抗冻剂T1。

图3为实施例1制备的触发控释性植物抗冻剂透射电镜图。由图可知，抗冻剂颗粒形状规则，粒度分布范围较窄，粒径为纳米级，为100-200nm；其中，膜厚为10-50nm；核芯的粒径为90nm-150nm。触发控释性植物抗冻剂作用实验在-10℃光照控温培养箱中，将长势相同的植株分别用制剂处理和用等量清水处理(该示意图如图2所示)，进行低温12h培养，效果如图4所示，处理组抗冻效果显著。

实施例2

在100ml反应瓶中加入50ml去离子水，加入1M pH 8.0的HCl-Tris缓冲液2ml，5g海藻糖，1g半乳糖，3g过氧化物酶CAT，6g聚合物PEG800-DAS(制备方法同实施例1)，1g OP-10。35℃转速为600rpm的条件下搅拌15min至分散均匀，得到水相Ⅰ；

在具备加热和搅拌设备的反应器中，加入乙醚150ml、3g二苯基甲烷二异羟酸酯(MDI)、脂肪酸甘油酯8g和8g农乳600，室温25℃转速为600rpm的条件下搅拌20min至溶解分散均匀，得到油相Ⅱ；

将所述水相Ⅰ加入到所述油相Ⅱ中，在4000rpm转速高速剪切搅拌分散(也即乳化)600s，乳化完成后室温600rpm转速搅拌8h，制备得到触发控释性植物抗冻剂悬浮乳液225g，加入0.5g破乳剂聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醇醚破乳，离心后收集固体，干燥后得到触发控释性植物抗冻剂T2。

实施例3

在100ml反应瓶中加入50ml去离子水，加入pH 7.2的PBS缓冲液1ml，4g海藻糖，2g大豆低聚糖，1g超氧化物歧化酶SOD，5g聚合物PEG800-DAS(制备方法同实施例1)，1g农乳1602。35℃转速为600rpm的条件下搅拌10min至分散均匀，得到水相Ⅰ；

在具备加热和搅拌设备的反应器中，加入丁醚200ml、4g二苯基甲烷二异羟酸酯(MDI)、8g异丁醇和5g农乳700，室温转速为600rpm的条件下搅拌20min至溶解分散均匀，得到油相Ⅱ；

将所述水相Ⅰ加入到所述油相Ⅱ中，在4000rpm转速高速剪切搅拌分散(也即乳化)200s，乳化完成后室温600rpm转速搅拌6h，制备得到触发控释性植物抗冻剂悬浮乳液283g，加入0.5g破乳剂聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醇醚破乳，离心后收集固体，干燥后得到触发控释性植物抗冻剂T3。

Claims

1.一种制备抗冻剂的方法，包括如下步骤：

1）将水溶性糖、活性酶、聚乙二醇-二烯丙基硫醚嵌段聚合物、缓冲液和水相表面活性剂溶于水中混匀，得到水相；

所述步骤1）中，水溶性糖选自蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖、棉子糖、果糖、壳聚糖、麦芽糖、半乳糖、木糖和大豆低聚糖中至少一种；

所述活性酶选自辣根过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶中至少一种；

所述聚乙二醇-二烯丙基硫醚嵌段聚合物由包括如下步骤的方法制得：选用烯丙基聚乙二醇800和二烯丙基硫醚；在500mL反应瓶中加入100mL乙醇，投入10g烯丙基聚乙二醇800，5g二烯丙基硫醚，加入0.2g光引发剂安息香，在波长420nm紫光灯下照射6h，以300r/s持续搅拌至反应完全，旋蒸后得到所述聚乙二醇-二烯丙基硫醚嵌段聚合物；

所述缓冲液选自PBS缓冲液、HCl-tris缓冲液和TE缓冲液中至少一种；所述缓冲液的pH值为7.2~8.0；

所述水相表面活性剂选自磺酸酯、C1~C20的羧酸或脂肪酸、琥珀酸酯、烷基苯磺酸钠、聚氧乙烯基壬基苯基醚磺酸钠、烷基吡啶盐、硬脂酸钠、十二烷基磺酸钠、脂肪胺盐、季铵盐、吐温、聚氧乙烯醇和烷基酚聚氧乙烯醚至少一种；

所述水溶性糖、活性酶、聚乙二醇-二烯丙基硫醚嵌段聚合物、缓冲液、水相表面活性剂和水的用量比为(1~12)g:(1~10)g:(1~50)g:(1~10)ml:(1~10)g:100ml；

所述混匀步骤中，温度为30℃~35℃；时间为10~15 min；搅拌转速为600~800 rpm；

2）将成膜单体、助表面活性剂和油相表面活性剂于有机溶剂中混匀，得到油相；

所述步骤2）中，所述有机溶剂选自乙醚、苯甲醚、乙二醇二乙醚、丁醚、环己烷、异辛烷、松脂基植物油、油酸甲酯、环氧化植物油、植物精油和生物柴油中至少一种；

所述成膜单体选自甲苯二异氰酸酯、二苯基甲烷二异羟酸酯、六亚甲基二异氰酸酯和异佛尔酮二异氰酸酯中至少一种；

所述助表面活性剂选自正丁醇、异丁醇、正戊醇、异戊醇、1-己醇、2-辛醇、C12~C30的脂肪酸、脂肪酸甘油酯、乙二醇低碳醇醚和丙二醇低碳醇醚中至少一种；

所述油相表面活性剂为非离子型乳化剂；选自SPAN-20、SPAN-40、农乳600、农乳700和农乳1602中的至少一种；

所述成膜单体、助表面活性剂、油相表面活性剂和有机溶剂的用量比为(0~3)g：(0~5)g:(0~5)g:100ml；且所述成膜单体、助表面活性剂、油相表面活性剂的用量均不为0；

所述混匀步骤中，温度为25℃；时间为10 min~20 min；搅拌转速为500~600 rpm；

3）将所述水相和油相混合，乳化，搅拌反应，得到反相微胶囊悬浮乳液，干燥后收集固体得到所述抗冻剂；

所述方法还包括：在所述步骤3）干燥步骤之前，向所得反相微胶囊悬浮乳液中加入破乳剂；

所述破乳剂选自丙酮、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醇醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基苯酚醚和聚氧乙烯聚氧丙烯多乙烯多胺醚中至少一种；

所述反相微胶囊悬浮乳液和所述破乳剂的质量比为400-700：1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，所述烷基苯磺酸钠为十二烷基苯磺酸钠；所述吐温为吐温-60；所述烷基酚聚氧乙烯醚为壬基酚聚氧乙烯醚。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤3）乳化步骤中，转速为3000-4000rpm；时间为200s-300s；

所述水相和所述油相的质量比为1：（1~5）。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤3）搅拌反应步骤中，温度为常温；转速为500~800rpm；反应时间为5~10h。

5.权利要求1-4中任一所述方法制备得到的抗冻剂。

6.根据权利要求5所述的抗冻剂，其特征在于：所述聚合物膜的厚度为10-50 nm；

所述核芯的粒径为90-150nm；

所述抗冻剂的粒径为100-200nm。

7.权利要求5或6所述抗冻剂在植物抗冻中的应用。