CN115886005B - 一种含槲皮素和棉子糖的植物抗冻剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种含槲皮素和棉子糖的植物抗冻剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种含槲皮素和棉子糖的植物抗冻剂及其制备方法和应用，涉及植物生长调节剂和农业种植管理技术领域。一种含槲皮素和棉子糖的植物抗冻剂，其主要有效成分是槲皮素和棉子糖，其中槲皮素体积百分比为0.1％‑0.5％，棉子糖质量百分比为0.6％‑6％，还包括其他成分，吐温20和甘油。本发明突破了槲皮素和棉子糖在植物抗低温作用中的研究，能够提高植物自身抗氧化酶活性、增加体内渗透调节物质来应对低温胁迫，增强植物抗冻能力。本发明的复合抗冻剂成分简单、不含激素或农药类成分、安全环保、可自行配置、成本低、操作简单、适合推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及植物生长调节剂和农业种植管理技术领域，尤其涉及一种含槲皮素和棉子糖的植物抗冻剂及其制备方法和应用。
背景技术
植物在生长发育过程中会遭遇多种逆境，其中早春气温较低，植物面临的主要环境问题是低温胁迫。植物遭遇低温胁迫时，通常影响光合作用、导致幼苗生长缓慢、细胞代谢紊乱甚至引起植株的死亡。
低温胁迫是影响植物生长发育的重要非生物胁迫。低温胁迫包括冷害(<15℃)和冻害(<0℃)，其中冻害对植物的影响最大。在我国北方，倒春寒是一种常见的自然灾害，严重影响作物的生长及产量。春季正值蔬菜、烟草等作物生长的季节，倒春寒严重影响植物生长，甚至造成幼苗冻伤，无法正常生长等问题，造成严重的经济损失。
多种作物对低温敏感，比如烟草、番茄、黄瓜、水稻和玉米等。
烟草(Nicotiana tabacum L.)是我国重要的经济作物，且是一种喜温植物，对低温比较敏感。3-4月正值烟草苗床期，烟苗处于十字期，即两叶一心期，此时遭遇倒春寒易使棚内温度较低，导致烟苗冻伤，易使叶片畸形、变黄，影响烟苗正常发育。5月左右烟草移栽前后经常发生低温危害，此时正值烟苗五叶至六叶时期，导致烟苗发育迟缓甚至产生早花现象。可见研究烟草低温具有实际的应用价值。
番茄和黄瓜是我国主栽的蔬菜品种。番茄最适宜的生长温度是20-30℃，对低温反应敏感。低温对番茄的主要危害体现在苗期，10℃以下的温度可使番茄幼苗生长发育迟缓，且在两片真叶遭遇6℃低温处理时，即可导致畸形果的产生。黄瓜幼苗最适宜的生长温度是18-30℃，对低温敏感。温度低于12℃时，黄瓜幼苗叶片会出现水渍状，生长迟缓，影响幼苗的正常生长发育。早春黄瓜幼苗在两片真叶时易受低温伤害。低温导致蔬菜幼苗萎蔫、黄化、生长迟缓，影响植物产量，造成经济损失。
春季正值番茄和黄瓜的苗期，因此提高番茄和黄瓜幼苗的低温抗性，对于保障幼苗的产量、提高经济效益具有非常重要的意义。
目前的防冻措施主要有培育植物新品种、大棚育苗、覆膜等措施，但这些措施费时费力，耗费周期长，成本较高。市面上还有通过叶面喷施或者灌根处理的植物抗冻剂，但目前市面常见的植物抗冻剂成分复杂、多含激素或农药类成分等。
槲皮素(Quercetin)是一种黄酮类生物活性化合物，同时是一种抗氧化剂，能有效减轻氧化应激诱导的过量ROS的产生，提高超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)等抗氧化酶的活性。在动物中，槲皮素具有抗炎、抗病毒以及调节血糖等作用。在植物中研究发现槲皮素能参与多种生理过程，如促进花粉管发育，促进种子萌发和生长等。也有研究表明槲皮素能缓解生物胁迫(如病害、虫害)和非生物胁迫(如盐、重金属等)，但关于槲皮素参与植物低温胁迫的报道鲜见。如能将槲皮素在植物抗低温中进行研究并推广应用，可大大推动槲皮素的在植物中应用的研究以及植物低温管理的发展。
棉子糖系列寡糖(Raffinose Family Oligosaccharides，RFO)是由棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖组成。其中棉子糖(Raffinose)是由1个α-1,6-半乳糖连接到蔗糖上的6-葡萄糖基生成。RFOs广泛存在于植物中，具有广泛的功能。研究表明，在逆境胁迫下，植物体内积累大量的RFOs，并参与细胞的渗透调节，从而提高植物的抗逆能力。目前关于外施棉子糖是否能提高植物低温抗性的研究尚未报道，因此是否可将其作为提高植物低温抗性的有效外源物质具有重要的研究意义。
槲皮素和棉子糖的复合应用尚未见研究报道，因此，如能将槲皮素和棉子糖的复合应用植物抗冻剂研究并应用推广可极大的推动植物低温胁迫管理的发展。
发明内容
本发明目的在于提供一种含槲皮素和棉子糖的植物抗冻剂，推进了槲皮素和棉子糖在植物低温胁迫管理方面的应用和发展，解决了目前失眠上常见的植物抗冻剂成分复杂、多含激素或农药类的成分等问题。
一种提高烟草幼苗低温抗性的方法，用体积百分比为0.1％-0.5％的槲皮素溶液进行叶面喷施处理，所述叶面喷施处理其方法为喷至叶片正反两面均药液欲滴。
在上述方案基础上，优选的，所述槲皮素溶液体积百分比为0.1％，所述槲皮素溶液含0.02％表面活性剂吐温20。
同时，另一种提高烟草幼苗低温抗性的方法，用质量百分比为0.6％-6％的棉子糖溶液进行叶面喷施处理，所述叶面喷施处理其方法为喷至叶片正反两面药液欲滴。
在上述方案基础上，优选的，所述棉子糖溶液的质量百分比为0.6％，所述棉子糖溶液含0.02％表面活性剂吐温20。
为实现上述目的，本申请提供一种含槲皮素和棉子糖的植物抗冻剂，其主要有效成分是槲皮素和棉子糖，其中槲皮素体积百分比为0.1％-0.5％，棉子糖质量百分比为0.6％-6％。
在上述方案基础上，还包括其他成分，甘油、吐温20。
优选的，槲皮素体积百分比0.1％、棉子糖质量百分比0.6％、甘油体积百分比0.02％、吐温20体积百分比0.02％，余量为水。
可选的，如上任一所述的使用方法，所述含槲皮素和棉子糖的植物抗冻剂的使用时期和方法如下：
两叶一心期幼苗，使用时间在上午10点前或下午4点后，在低温来临前1天使用，使用时气温不低于0℃，叶面喷施1次，喷施至所述植物抗冻剂在叶片正反两面均药液欲滴为止，或按照每公顷750kg的剂量喷施；
五叶一心期幼苗，使用时间在上午10点前或下午4点后，在低温来临前，每隔一天叶面喷施1次，共喷施4次；喷施至所述植物抗冻剂在叶片正反两面均药液欲滴为止，或按照每公顷750kg的剂量喷施。
在上述方案基础上，所述含槲皮素和棉子糖的植物抗冻剂(本文中或被简称为植物抗冻剂)最适应用植物包括烟草、番茄和黄瓜。
一种含槲皮素和棉子糖的植物抗冻剂的制备方法，其特征在于：以总体积1L为计，包括如下步骤：
S1：将0.0338g植物活性物质槲皮素粉末于10ml无水乙醇中溶解，制备成槲皮素母液，备用；
S2：按照配比所需量取1ml槲皮素母液、6g棉子糖、0.2ml甘油、0.2ml吐温20，备用；
S3：将S2中备料添加至水中，充分搅拌混匀；
S4：配制完成后，转移至储藏瓶中，避光保存。
本发明的有益效果为：
本申请利用槲皮素、棉子糖与甘油、吐温进行复配制成的高效环保的植物抗冻剂，通过叶面喷施此植物抗冻剂可显著提高植物幼苗的存活率、增强植物自身抗氧化酶活性及增强渗透调节物质积累等，从而增强植株的抗低温能力，缓解低温对植物幼苗的伤害。
本申请的研究突破了槲皮素在植物抗低温胁迫作用中的研究与应用、突破了棉子糖在植物抗低温胁迫作用中的研究与应用、突破了槲皮素和棉子糖与甘油、吐温复配在植物抗低温胁迫作用中的研究与应用。
本申请提供的一种含槲皮素和棉子糖的植物抗冻剂，其成分简单、不含激素或农药类成分，安全环保、无毒无污染；而且本申请提供的一种含槲皮素和棉子糖的植物抗冻剂可以自行配置、成本低、操作简单，值得推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一种实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1：本发明实施例一外施槲皮素对低温胁迫烟草幼苗表型的影响；
图2：本发明实施例一外施槲皮素对低温胁迫五叶一心期烟草幼苗生理指标的影响；
图3：本发明实施例二外施棉子糖对低温胁迫烟草幼苗表型的影响；
图4：本发明实施例二外施棉子糖对低温胁迫五叶一心期烟草幼苗生理指标的影响；
图5：本发明实施例四外施植物抗冻剂对低温胁迫烟草幼苗表型的影响；
图6：本发明实施例四外施植物抗冻剂对低温胁迫五叶一心期烟草幼苗生理指标的影响；
图7：本发明实施例四外施植物抗冻剂对大田生长烟草幼苗的影响；
图8：本发明实施例五外施植物抗冻剂对低温胁迫番茄幼苗表型的影响；
图9：本发明实施例五外施植物抗冻剂对低温胁迫两叶一心期番茄幼苗生理指标的影响；
图10：本发明实施例五外施植物抗冻剂对低温胁迫黄瓜幼苗表型的影响；
图11：本发明实施例五外施植物抗冻剂对低温胁迫两叶一心期黄瓜幼苗生理指标的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
实施例一：外施槲皮素对低温胁迫烟草幼苗的影响筛选验证实验1、实验材料：
烟草(Nicotiana tabacum L.)‘K326’品种，由青岛农业大学植物逆境生理与分子生物学实验室保存；
槲皮素(Quercetin)购自上海瑞永生物科技有限公司；
吐温20(Tween 20)购自国药集团化学试剂有限公司。
2、实验方法：
表型观察采用两个时期的烟草幼苗为实验材料，分别为两叶一心期和五叶一心期。
两叶一心期：
1)材料培养：将烟草种子播种于含草炭木营养土的育苗穴盘中，置于温度为25℃，湿度为55％，光周期为16/8h的温室中培养，两周后选取长势一致的烟草幼苗单棵移栽于育苗穴盘中进行后续处理。
2)对两叶一心期烟草幼苗设置以下处理：
①对照组：叶面喷施蒸馏水；
②处理1：叶面喷施体积百分比为0.1％的槲皮素溶液；
③处理2：叶面喷施体积百分比为0.5％的槲皮素溶液。
处理方法：将两叶一心期烟草幼苗用体积百分比为0、0.1、0.5％的槲皮素溶液(含0.02％表面活性剂吐温20)进行叶面喷施处理，叶片正反两面均喷至药液欲滴为止，放置12h，放置低温光照培养箱中进行梯度降温处理，4℃处理2h，0℃处理1h，-1℃处理1h，-2℃处理1h，-3℃处理1h，置于温室(25℃)中恢复生长3d，观察表型，统计幼苗存活率，各处理30棵幼苗，每处理重复3次以上。
五叶一心期：
1)材料培养：将烟草种子播种于含草炭木营养土的育苗穴盘中，置于温度为25℃，湿度为55％，光周期为16/8h的温室中培养，两周后选取长势一致的烟草幼苗单棵移栽于花盆中继续培养至四叶一心期，挑选长势一致的幼苗进行后续处理。
2)对四叶一心期烟草幼苗设置以下处理：
①对照组：叶面喷施蒸馏水；
②处理组：叶面喷施体积百分比为0.1％的槲皮素溶液；
处理方法：将四叶一心期烟草幼苗用体积百分比为0、0.1％的槲皮素溶液(含0.02％表面活性剂吐温20)进行叶面喷施处理，叶片正反两面均喷至药液欲滴为止，每隔24h喷施1次，共处理4次后至五叶一心期，放置低温光照培养箱中进行梯度降温处理，4℃处理2h，0℃处理1h，-1℃处理1h，-2℃处理1h，-3℃处理1h，-4℃处理1h，置于温室(25℃)中恢复生长3d观察表型，统计幼苗存活率，各处理12棵幼苗，每处理重复3次以上。
3)生理指标测定：选取生长一致的四叶一心期烟草幼苗，用体积百分比为0、0.1％的槲皮素溶液(含0.02％表面活性剂吐温20)进行叶面喷施处理，每隔24h喷施1次，共处理4次后，于低温处理前和低温处理后(4℃处理2h，0℃处理1h，-1℃处理1h)在第三和四片真叶处分别取样并混样，检测低温相关的生理指标。
测定指标：细胞膜透性、MDA(丙二醛)、SOD(超氧化物歧化酶)、POD(过氧化物酶)、CAT(过氧化氢酶)、Pro(脯氨酸)、SS(可溶性糖)、活性氧含量(H2O2和O2 .-)，相关测试指标本文后续以英文简称的形式撰写。
细胞膜透性测定参考(Zhang et al.,2021)方法，MDA含量参考(Tang et al.,2017)所述方法进行测定，O2 .-和H2O2含量测定参考(Wang et al.,2019)方法，SOD、POD、CAT活性参考(Shen et al.,2021)方法进行测定，Pro含量测定根据(Quan et al.,2022)进行，SS含量测定参考(Gurrieri et al.,2020)方法测定。3、实验数据：
表1外施槲皮素对低温胁迫烟草幼苗存活率的影响
表2外施槲皮素对低温胁迫五叶一心期烟草幼苗生理指标的影响
4、实验结果与分析：
如图1A,B和表1可知，低温胁迫下，外施体积百分比0.1％的槲皮素溶液后，两叶一心期烟草幼苗的存活率较对照提高2.75倍，外施体积百分比0.5％的槲皮素溶液后，两叶一心期烟草幼苗的存活率较对照提高1.08倍，可见低温胁迫下外施体积百分比为0.1％的槲皮素提高两叶一心期烟草幼苗存活率的作用更显著。因此后续实验选用该最适浓度继续进行研究。
将体积百分比为0.1％的槲皮素溶液应用在五叶一心期烟草幼苗，如图1C,D和表1可知，低温胁迫下外施体积百分比为0.1％的槲皮素溶液同样能提高五叶一心期烟草幼苗的存活率，且较对照提高1.88倍。
选择体积百分比为0.1％的槲皮素溶液进行低温相关生理指标的检测，如图2和表2所示。与对照相比，低温胁迫下外施体积百分比为0.1％的槲皮素溶液处理的烟草幼苗，其叶片中的MDA含量、H2O2、O2 .-含量显著降低，渗透调节物质可溶性糖(SS)和脯氨酸(Pro)的含量显著增加，并且外施体积百分比为0.1％的槲皮素溶液处理可减轻细胞膜相对透性，提高体内生物酶(SOD、POD、CAT酶)活性。
上述实验说明，体积百分比为0.1％的槲皮素溶液可有效缓解低温胁迫对烟草幼苗的影响，提高烟草幼苗自身抗性。
实施例二：外施棉子糖对低温胁迫烟草幼苗的影响筛选验证实验1、实验材料：
烟草(Nicotiana tabacum L.)‘K326’品种，为青岛农业大学植物逆境生理与分子生物学实验室保存；
棉子糖(Raffinose)购自上海瑞永生物科技有限公司；
吐温20(Tween 20)购自国药集团化学试剂有限公司。
2、实验方法：
表型观察采用两个时期的烟草幼苗为实验材料，分别为两叶一心期和五叶一心期。
两叶一心期：
1)材料培养：将烟草种子播种于含草炭木营养土的育苗穴盘中，置于温度为25℃，湿度为55％，光周期为16/8h的温室中培养，两周后选取长势一致的烟草幼苗单棵移栽于育苗穴盘中进行后续处理。
2)对两叶一心期烟草幼苗设置以下处理：
①对照组：叶面喷施蒸馏水；
②处理1：叶面喷施质量百分比0.6％的棉子糖溶液；
③处理2：叶面喷施质量百分比为6％的棉子糖溶液；
处理方法：将两叶一心期烟草幼苗用质量百分比为0、0.6、6％的棉子糖溶液(含0.02％表面活性剂吐温20)进行叶面喷施处理，叶片正反两面均喷至药液欲滴为止，放置12h，放置低温光照培养箱中进行梯度降温处理，4℃处理2h，0℃处理1h，-1℃处理1h，-2℃处理1h，-3℃处理1h，置于温室(25℃)中恢复生长3d，观察表型，统计幼苗存活率，各处理30棵幼苗，每处理重复3次以上。
五叶一心期：
1)材料培养：将烟草种子播种于含草炭木营养土的育苗穴盘中，置于温度为25℃，湿度为55％，光周期为16/8h的温室中培养，两周后选取长势一致的烟草幼苗单棵移栽于花盆中继续培养至四叶一心期，挑选长势一致的幼苗进行后续处理。
2)对四叶一心期烟草幼苗设置以下处理：
①对照组：叶面喷施蒸馏水；
②处理组：叶面喷施质量百分比为0.6％的棉子糖溶液；
处理方法：将四叶一心期烟草幼苗用质量百分比为0、0.6％的棉子糖溶液(含0.02％表面活性剂吐温20)进行叶面喷施处理，叶片正反两面均喷至药液欲滴为止，每隔24h喷施1次，共处理4次后至五叶一心期，放置低温光照培养箱中进行梯度降温处理，4℃处理2h，0℃处理1h，-1℃处理1h，-2℃处理1h，-3℃处理1h，-4℃处理1h，置于温室(25℃)中恢复生长3d观察表型，统计幼苗存活率，各处理12棵幼苗，每处理重复3次以上。
3)生理指标测定：选取生长一致的四叶一心期烟草幼苗，用质量百分比为0、0.6％的棉子糖溶液(含0.02％表面活性剂吐温20)进行叶面喷施处理，每隔24h喷施1次，共处理4次后，于低温处理前和低温处理后(4℃处理2h，0℃处理1h，-1℃处理1h)在第三和四片真叶处分别取样并混样，检测低温相关的生理指标。
测定指标：细胞膜透性、MDA(丙二醛)、SOD(超氧化物歧化酶)、POD(过氧化物酶)、CAT(过氧化氢酶)、Pro(脯氨酸)、SS(可溶性糖)、活性氧含量(H2O2和O2 .-)。
细胞膜透性测定参考(Zhang et al.,2021)方法，MDA含量参考(Tang et al.,2017)所述方法进行测定，O2 .-和H2O2含量测定参考(Wang et al.,2019)方法，SOD、POD、CAT活性参考(Shen et al.,2021)方法进行测定，脯氨酸含量测定根据(Quan et al.,2022)进行，可溶性糖含量测定参考(Gurrieri et al.,2020)方法测定。
3、实验数据
表3外施棉子糖对低温胁迫烟草幼苗存活率的影响
表4外施棉子糖对低温胁迫五叶一心期烟草幼苗生理指标的影响
4、实验结果及分析：
如图3A,B和表3可知，低温胁迫下外施质量百分比0.6％的棉子糖溶液后，两叶一心期烟草幼苗的存活率较对照提高3.54倍，外施质量百分比6％的棉子糖溶液后，两叶一心期烟草幼苗的存活率较对照提高1.43倍，可见低温胁迫下外施质量百分比为0.6％的棉子糖提高两叶一心期烟草幼苗存活率的作用更显著。因此后续实验选用该最适浓度继续研究。
将质量百分比为0.6％的棉子糖溶液应用在五叶一心期烟草幼苗，如图3C,D和表3可知，低温胁迫下外施质量百分比为0.6％的棉子糖溶液同样能提高五叶一心期烟草幼苗的存活率，且较对照提高2.62倍。
选择质量百分比为0.6％的棉子糖溶液进行低温相关生理指标的检测，如图4和表4所示。与对照相比，低温胁迫下外施质量百分比为0.6％的棉子糖溶液处理的烟草幼苗，其叶片中的MDA含量、H2O2、O2 .-含量显著降低，渗透调节物质可溶性糖(SS)和脯氨酸(Pro)的含量显著增加，并且外施质量百分比为0.6％的棉子糖溶液处理可减轻细胞膜相对透性，提高体内生物酶(SOD、POD、CAT酶)活性。
上述实验说明，质量百分比为0.6％的棉子糖溶液可有效缓解低温胁迫对烟草幼苗的影响，提高烟草幼苗自身抗性。
实施例三：植物抗冻剂的配制
1、实验材料：
槲皮素(Quercetin)和棉子糖(Raffinose)均购自上海瑞永生物科技有限公司；
吐温20(Tween 20)和甘油(丙三醇)购自国药集团化学试剂有限公司。
2、实验方法：以制备1L植物抗冻剂为例
(1)将0.0338g植物活性物质槲皮素粉末溶解在10ml无水乙醇中，<50℃加热溶解，制备成槲皮素母液，备用；
(2)按照配比所需量取1ml槲皮素母液、6g棉子糖、0.2ml甘油、0.2ml吐温20，备用；
(3)将步骤(2)中备料添加至水中，充分搅拌均匀，定容；
(4)配制完成后，转移至储藏瓶中，避光保存。
3、一种含槲皮素和棉子糖的植物抗冻剂
组成成分为：槲皮素体积百分比0.1％、棉子糖质量百分比0.6％、甘油体积百分比0.02％、吐温20体积百分比0.02％，余量为水。
实施例四、外施植物抗冻剂对低温胁迫下烟草幼苗的影响
1、实验材料：
盆栽实验烟草品种：烟草(Nicotiana tabacum L.)‘K326’品种，为青岛农业大学植物逆境生理与分子生物学实验室保存；
大田生长烟草品种：烟草(Nicotianatabacum L.)‘中烟301’品种，实验田位于青岛市黄岛区宝山镇。
2、实验方法：
表型观察采用两个时期的烟草幼苗为实验材料，分别为两叶一心期和五叶一心期。
两叶一心期：
1)材料培养：将烟草种子播种于含草炭木营养土的育苗穴盘中，置于温度为25℃，湿度为55℃，光周期为16/8h的温室中培养，两周后选取长势一致的烟草幼苗单棵移栽于育苗穴盘中进行后续处理。
2)对两叶一心期烟草幼苗设置以下处理：
①对照组：叶面喷施蒸馏水；
②处理组：叶面喷施植物抗冻剂；
处理方法：将两叶一心期烟草幼苗进行叶面喷施蒸馏水和植物抗冻剂处理，叶片正反两面均喷至药液欲滴为止，放置12h，放置低温光照培养箱中进行梯度降温处理，4℃处理2h，0℃处理1h，-1℃处理1h，-2℃处理1h，-3℃处理1h，置于温室(25℃)中恢复生长3d，观察表型，统计幼苗存活率，各处理30棵幼苗，每处理重复3次以上。
五叶一心期：
1)材料培养：将烟草种子播种于含草炭木营养土的育苗穴盘中，置于温度为25℃，湿度为55℃，光周期为16/8h的温室中培养，两周后选取长势一致的烟草幼苗单棵移栽于花盆中继续培养至四叶一心期，挑选长势一致的幼苗进行后续处理。
2)对四叶一心期烟草幼苗设置以下处理：
①对照组：叶面喷施蒸馏水；
②处理组：叶面喷施植物抗冻剂；
处理方法：将四叶一心期烟草幼苗进行叶面喷施蒸馏水和植物抗冻剂处理，叶片正反两面均喷至药液欲滴为止，每隔24h喷施1次，共处理4次后至五叶一心期，放置低温光照培养箱中进行梯度降温处理4℃处理2h，0℃处理1h，-1℃处理1h，-2℃处理1h，-3℃处理1h，-4℃处理1h，置于温室(25℃)中恢复生长3d，观察表型，统计幼苗存活率，各处理12棵幼苗，每处理重复3次以上。
3)生理指标测定：选取生长一致的四叶一心期烟草幼苗，分别叶面喷施蒸馏水和植物抗冻剂，每隔24h喷施1次，共处理4次后，于低温处理前和低温处理后(4℃处理2h，0℃处理1h，-1℃处理1h)在第三和四片真叶处分别取样并混样，检测低温相关的生理指标。
测定指标：细胞膜透性、MDA(丙二醛)、SOD(超氧化物歧化酶)、POD(过氧化物酶)、CAT(过氧化氢酶)、活性氧含量(H2O2和O2 .-)、Pro(脯氨酸)含量、SS(可溶性糖含量)。
细胞膜透性测定参考(Zhang et al.,2021)方法，MDA含量参考(Tang et al.,2017)所述方法进行测定，O2 .-和H2O2含量测定参考(Wang et al.,2019)方法，SOD、POD、CAT活性参考(Shen et al.,2021)方法进行测定，脯氨酸含量测定根据(Quan et al.,2022)进行，可溶性糖含量测定参考(Gurrieri et al.,2020)方法测定。
大田生长的烟草幼苗分别于移栽前(五叶一心期)喷施一次植物抗冻剂，于寒潮来临前1d叶面喷施1次，2月后观察表型，统计植株高度、叶面积、侧芽数等指标。
3、实验数据
表5外施植物抗冻剂对低温胁迫烟草幼苗存活率的影响
表6外施植物抗冻剂对低温胁迫五叶一心期烟草幼苗生理指标的影响
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表7外施植物抗冻剂对大田生长烟草幼苗的生长指标的影响
4、实验结果及分析
如图5A,B和表5所示，低温胁迫下外施植物抗冻剂的两叶一心期烟草幼苗的存活率较对照提高4.85倍，存活率高达84.44％。如图5C,D和表5所示，低温胁迫下外施植物抗冻剂的五叶一心期烟草幼苗存活率较对照提高4.18倍，存活率高达80.08％。可见外施植物抗冻剂可提高两叶一心期和五叶一心期烟草幼苗的存活率。
如图6和表6所示，低温胁迫下检测外施植物抗冻剂后烟草幼苗的生理指标变化，发现与对照相比，外施植物抗冻剂处理可显著降低细胞膜损伤、MDA含量、H2O2、O2 .-含量，增加渗透调节物质脯氨酸和可溶性糖的含量，提高生物酶活性。
如图7及表7所示，外施植物抗冻剂后大田生长烟草幼苗的叶面积和植株高度较对照显著提高，显著降低植株的侧芽数，可见植物抗冻剂在缓解烟草低温损伤中发挥非常重要的作用。
实施例五、外施植物抗冻剂对低温胁迫下番茄和黄瓜幼苗的影响1、实验材料：
番茄(Solanum lycopersicum)‘金棚一号’品种，购自盛圃农业种子农药网店；
黄瓜(Cucumis sativus L.)‘津研四号’品种，购自一号农庄种业网店。
2、实验方法：
1)材料培养：将番茄和黄瓜种子播种于含草炭木营养土育苗穴盘中，置于温度为25℃，湿度为55℃，光周期为16/8h的温室中培养，一周后移栽于花盆中继续培养至两叶一心期，分别选取长势一致的材料进行后续处理。
2)对番茄和黄瓜幼苗分别设置以下处理：
①对照组：叶面喷施蒸馏水；
②处理组：叶面喷施植物抗冻剂
表型观察实验：对两叶一心期番茄和黄瓜幼苗进行叶面喷施蒸馏水和植物抗冻剂处理，叶片正反两面均喷至药液欲滴为止，放置12h，放置低温光照培养箱中进行梯度降温处理，番茄幼苗(4℃处理2h，0℃处理1h，-1℃处理1h，-2℃处理1h)，黄瓜幼苗(4℃处理2h，0℃处理1h，-1℃处理1h，-2℃处理0.5h)，置于温室(25℃)中恢复生长3d观察表型，统计幼苗存活率，各处理30幼苗，每处理重复3次以上，
3)生理指标测定：选取生长一致的两叶一心期番茄和黄瓜幼苗，分别叶面喷施蒸馏水和植物抗冻剂，放置12h，于低温处理前和低温处理后(4℃12h)在第三和四片真叶处分别取样并混样，检测低温相关的生理指标。
测定指标：细胞膜透性、MDA(丙二醛)、SOD(超氧化物歧化酶)、POD(过氧化物酶)、CAT(过氧化氢酶)、活性氧含量(H2O2和O2 .-)、Pro(脯氨酸)含量、SS(可溶性糖含量)。
细胞膜透性测定参考(Zhang et al.,2021)方法，MDA含量参考(Tang et al.,2017)所述方法进行测定，O2 .-和H2O2含量测定参考(Wang et al.,2019a)方法，SOD、POD、CAT活性参考(Shen et al.,2021)方法进行测定，脯氨酸含量测定根据(Quan et al.,2022)进行，可溶性糖含量测定参考(Gurrieri et al.,2020)方法测定。
3、实验数据
表8外施植物抗冻剂对低温胁迫番茄和黄瓜幼苗存活率的影响
表9外施植物抗冻剂对低温胁迫两叶一心期番茄幼苗生理指标的影响
表10外施植物抗冻剂对低温胁迫两叶一心期黄瓜幼苗生理指标的影响
4、实验结果及分析
如图8、图10和表8所示，低温胁迫下对照组的番茄和黄瓜幼苗存活率较低，外施植物抗冻剂处理的幼苗存活率显著提高。低温胁迫下外施植物抗冻剂的番茄幼苗存活率较对照提高3.14倍，黄瓜幼苗的存活率较对照提高3.83倍。
通过检测低温处理后的番茄和黄瓜幼苗生理指标的变化，如图9、图11、表9和表10所示，发现外施植物抗冻剂处理可降低番茄和黄瓜的细胞膜损伤、MDA含量、H2O2、O2 .-含量，增加渗透调节物质脯氨酸和可溶性糖的含量，提高生物酶活性。因此植物抗冻剂也可缓解番茄和黄瓜的低温损伤。该植物抗冻剂具有广谱性，可推广使用。
上面以举例方式对本发明进行了说明，但本发明不限于上述具体实施例，凡基于本发明所做的任何改动或变型均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1. 一种含槲皮素和棉子糖的植物抗冻剂，其特征在于：其主要有效成分是槲皮素和棉子糖，抗冻剂采用槲皮素母液和棉子糖制备，抗冻剂中槲皮素母液体积百分比为0.1%-0.5%，棉子糖的质量百分比为0.6%-6%；所述槲皮素母液的制备方法为：将0.0338 g植物活性物质槲皮素粉末于10 ml无水乙醇中溶解，制备成槲皮素母液；所述植物抗冻剂还包括甘油、吐温20。
2.根据权利要求1所述的一种含槲皮素和棉子糖的植物抗冻剂，其特征在于：组成成分为：槲皮素母液体积百分比0.1%、棉子糖质量百分比0.6%、甘油体积百分比0.02%、吐温20体积百分比0.02%，余量为水。
3.根据权利要求2所述的一种含槲皮素和棉子糖的植物抗冻剂，其特征在于：所述含槲皮素和棉子糖的植物抗冻剂的使用时期和方法如下：
两叶一心期幼苗，使用时间在上午10点前或下午4点后，在低温来临前1天使用，使用时气温不低于0℃，叶面喷施1次，喷施至所述植物抗冻剂在叶片正反两面均药液欲滴为止，或按照每公顷750kg的剂量喷施；
五叶一心期幼苗，使用时间在上午10点前或下午4点后，在低温来临前，每隔一天叶面喷施1次，共喷施4次；喷施至所述植物抗冻剂在叶片正反两面均药液欲滴为止，或按照每公顷750kg的剂量喷施。
4.根据权利要求2所述的一种含槲皮素和棉子糖的植物抗冻剂，其特征在于：最适应用植物包括烟草、番茄和黄瓜。
5. 一种含槲皮素和棉子糖的植物抗冻剂的制备方法，其特征在于：以总体积1 L为计，包括如下步骤：
S1：将0.0338 g植物活性物质槲皮素粉末于10 ml无水乙醇中溶解，制备成槲皮素母液，备用；
S2：按照配比所需量取1 ml槲皮素母液、6 g棉子糖、0.2 ml甘油、0.2 ml吐温20，备用；
S3：将S2中备料添加至水中，充分搅拌混匀；
S4：配制完成后，转移至储藏瓶中，避光保存。
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