CN109266746A - 一种用于扩增linc02253基因的引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于扩增LINC02253基因的引物对及其应用，主要是对结肠镜样本或者手术标本进行实时荧光定量PCR检测LINC02253/GAPDH值，若比值≥0.00018为阳性，<0.00018为阴性。此法为一种辅助诊断工具，阳性患者若病理学检测阴性也需定期复查。首先PCR检测方法方便简单适合各级医院推广使用。而取活检样本进行检测有助于确定病灶，定位肿瘤。因此LINC02253基因在结直肠癌诊断中具有较高的准确性、特异性和实用性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于扩增LINC02253基因的引物对及其应用。
背景技术
结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤，当今最常见的疾病之一，其发生率仅次于胃癌和食道癌，每年全球有约 120 万名患者被确诊为结直肠癌，而有超过 60 万名患者直接或间接死于结直肠癌。虽然遗传因素是结直肠癌的危险因素之一，但大部分结直肠癌都是散发的，并在几年内以腺瘤-肿瘤的形式发生。在生存期方面，I 期患者的 5 年生存率可达 90% 以上，而IV期患者只有略大于10%的生存率。内镜或血液筛查已被证实能有效降低结直肠癌发病率和死亡率。结直肠癌的疾病分期是最重要的预后因素。比如，2001年到2007年间，美国不同分期的结直肠癌患者的5年生存率分别为 90.1%（I 期），69.2%（II 期和III 期）和 11.7%（IV 期），可见对结直肠癌进行早期诊断对于结直肠癌的治疗和预后具有重要意义。
目前临床上运用在结直肠癌中的分子标记物，如微卫星不稳定、免疫系统细胞浸润和KRAS 和其他作为预后指标的基因突变，主要是与预后和治疗相关的，而在早期诊断上还有欠缺，在其他肿瘤中近年来国内外研究发现，在癌症发生时，外周血液中循环DNA及RNA含量增加，并含有由癌症细胞凋亡或死亡所释放的特殊DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）及RNA，其中有肿瘤突变DNA（circulating mutant ctDNA）或异常甲基化片段，如K-ras、P53和FHIT突变DNA，P16、APC、DAPK基因甲基化片段等，可作为分子诊断的标记物，用PCR扩增的方法进行定性或突变DNA定量测定，可用于肺癌和其他癌症的早期发现、疗效监测和预后判断。这种外周血检测方便快捷，对病人无伤害，病人依从性高，但存在定位差,特异性差的缺陷，所以我们希望能够提出更加高定位性高特异性的方法帮助进行结直肠癌的早期诊断。
而对于高定位性高特异性的早期诊断方法目前应用还是停留在荧光定量PCR检测活检组织EB病毒感染，辅助诊断鼻咽癌和组织病理学结合PCR检测尖锐湿疣等等。对于结直肠癌却没有相关早期诊断方法，我们就想提出可以辅助组织病理早期诊断结直肠癌的方法。lncRNA是一类长度大于200个核苷酸，是不具备蛋白质编码功能的RNA分子，以RNA的形式调控蛋白编码基因在表观修饰水平调控、转录水平调控和转录后水平调控等多个层面的表达水平。最近研究表明许多lncRNA与肿瘤的发生发展及转移有紧密联系，且能提供更准确地诊断及治疗依据，比如前列腺癌中的lncRNA-PCA3可能成为前列腺癌的早期诊断的可靠标记物。
授权公告号CN102565267B公开了筛查结直肠癌的试剂盒，该发明提供的筛查结直肠癌的试剂盒，包括用于检测磷脂含量的装置和由磷脂含量建立的比对卡；所述磷脂为SPC、14:0LPC、16:0LPC、18:2LPC、18:1LPC、18:0LPC、20:4LPC、20:0LPC、22:6LPC 和22:0LPC。该发明开发有效的结直肠癌早期诊断分子标记，建立了分子检测模型，根据此模型可以检测灵敏度和特异度可达88％和80％，利用这些脂类分子对结直肠癌和正常对照的区分效果优于近些年来很多研究结直肠癌早期诊断的标志物。然而该试剂盒检测需用到的液质联用仪价格昂贵，导致其检测成本增高，并不利于普及。
授权公告号CN104087670B公开了一种STC2基因在作为结直肠癌肝转移分子标记中的应用。该发明提供了一种鉴定或辅助鉴定待测结肠癌患者是否发生肝转移的试剂盒，包括用于检测STC2基因表达量的试剂和记载如下判断标准的载体：若所述待测结肠癌患者癌组织中 STC2 基因表达量高于确诊为非肝转移结肠癌患者癌组织中 STC2 基因表达量，且二者存在显著差异，则待测结肠癌患者发生或候选发生肝转移 ；该发明的实验证明STC2在结直肠癌肝转移组病人原发灶中的表达明显高于非肝转移组，后期的体外功能学实验结果提示 STC2 可能通过促进肿瘤迁移侵袭能力进而参与结直肠癌肝转移的过程，这一发现为进一步寻找结直肠癌肝转移分子标志物提供了线索。但是该试剂盒并没有给出具体详细的诊断标准，同时STC2基因在直肠癌肝转移诊断中的准确性和特异性并不明确。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于扩增LINC02253基因的引物对及其应用。
一种用于扩增LINC02253基因的引物对，如序列1所示。
一种用于检测LINC02253基因表达量的试剂，包括扩增LINC02253基因的引物对。
一种用于检测LINC02253基因表达量的表达谱芯片，包含含有扩增LINC02253基因的引物对的序列的探针。
LINC02253基因在诊断或辅助诊断结肠癌患者早期或者癌细胞转移的鉴定产品中的应用。
所述LINC02253/GAPDH=2^-(CtLINC02253-CtGAPDH)，若是结果≥0.00018设为阳性，<0.00018设为阴性。
有益效果：与现有技术相比，本发明提供了一种用于扩增LINC02253基因的引物对及其应用。本发明通过结肠镜样本或手术样本进行实时荧光定量PCR后检测LINC02253/GAPDH值，若比值≥0.00018为阳性，<0.00018为阴性。用LINC02253基因制备在鉴定或辅助鉴定结肠癌患者早期或者癌细胞转移的产品，可快速、准确地反应患者的病情，具有良好的应用前景，且适合用于病理学检测阴性患者的复查。另外，本发明设计的引物对扩增LINC02253效率高，用此引物对制成的试剂，保证结果准确的情况下，节约了时间。
附图说明
图1为变性琼脂糖凝胶电泳显示6对样本RNA的18S和28S电泳条带；
图2为差异lncRNA火山图；
图3为差异lncRNA聚类分析热图；
图4为qRT-PCR检测LINC02253基因在90对结直肠癌组织及对应的正常组织中的表达；
图5为LINC02253基因在结直肠癌不同临床分期中的表达情况；
图6为LINC02253基因在TCGA数据库中643例结直肠癌组织和51例正常结肠粘膜中的表达量；
图7为LINC02253基因在TCGA数据库中643例结直肠癌不同临床分期中的表达量；
图8为LINC02253基因在正常结肠上皮细胞以及结直肠癌细胞系中的表达；
图9为特异性的LINC02253基因siRNA的敲低效率；
图10为LINC02253基因敲低后对结直肠癌细胞系增殖能力的影响；
图11为LINC02253基因敲低后对克隆形成的影响，其中，（A）为阴性对照的克隆，（B）为敲低LINC02253基因靶点1后的细胞克隆，（C）为敲低LINC02253基因靶点2后的细胞克隆，（D）为敲低LINC02253基因靶点3后的细胞克隆；
图12为不同处理下克隆数的统计图。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明的进行详细描述和说明。其内容是对本发明的解释而非限定本发明的保护范围。
实施例1
标本收集获得南京医科大学医学伦理委员会的批准。
组织标本来源：标本来自2015年02月—2016年2月期间就诊于南京医科大学第一附属医院普外科结直肠癌患者90例，病例选取条件为：( 1 )术后均经病检确诊；( 2 )术前未进行过放疗、化疗或其他抗肿瘤治疗。
收集的信息包括患者住院号、姓名、性别、年龄、出生地、联系地址、联系电话、肿瘤家族史、肠镜结果、重要的影像学检查资料、手术记录、术后病理诊断结果。初次记录资料不完整者，后期借助医院电子病历系统和病案室存档资料补充完善。其中可公开的相关信息包括年龄，性别，肿瘤大小，TMN分期等整理归纳后见表格1。选择其中临床分期I/II期3例，临床分期III/IV期3例进行lncRNA芯片检测，样本信息见表2。
表1 90例样本病人信息表
表2 用于芯片检测的结直肠癌病例情况
术中标本离体后，迅速留取结直肠癌癌组织以及距离癌组织边缘5cm处切取正常结肠黏膜上皮作为正常对照。放入事先准备好的冻存管中，做好标记，迅速内置入液氮中，以避免RNA降解。
1.提取RNA
采用TAKARA公司的试剂盒 RNAiso Plus #9109并且根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的total RNA抽提。获得的RNA通过Nanodrop ND-1000（Thermo Scientific,IL, USA）在260nm和280nm测定吸光度来确定样品RNA的浓度和纯度（表3）。其中，A260/A280接近2.0为较纯的RNA。将抽提所得total RNA经Agilent Bioanalyzer2100( Agilenttechnologies ,Santa Clara ,CA ,US )电泳质检(图1 )，质检标准为RIN ≥ 7 .0且28S/18S＞0 .7者为合格。
表3 RNA质控结果
2.芯片实验
实验样品RNA采用Agilent表达谱芯片配套试剂盒，Low Input Quick Amp WTLabeling Kit (Cat.# 5190-2943, Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)和标准操作流程对样品total RNA进行放大和标记，并用RNeasy mini kit (Cat.# 74106,QIAGEN, GmBH, Germany) 纯化标记后的cRNA。按照Agilent表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒，Gene Expression Hybridization Kit (Cat.# 5188-5242,Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)，在滚动杂交炉Hybridization Oven(Cat.# G2545A, Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)中65℃，10rpm，滚动杂交17小时，杂交cRNA上样量1.65μg，并在洗缸staining dishes (Cat.# 121, ThermoShandon, Waltham, MA, US)中洗片，洗片所用的试剂为 Gene Expression Wash BufferKit (Cat.# 5188-5327, Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)。完成杂交的芯片采用Agilent Microarray Scanner (Cat.# G2565CA, Agilent technologies, SantaClara, CA, US)进行扫描，软件设置Dye channel: Green, Scan resolution=3μm, PMT100%, 20bit。用Feature Extraction software 10.7 (Agilent technologies, SantaClara, CA, US) 读取数据，最后采用R软件中limma包进行归一化处理，所用的算法为Quantile，归一化后的信号值由原始信号值经log2计算所得。采用Fold-change (表达差异倍数)以及统计学T检验（Student's t-test）方法对差异表达基因迚行筛选，挑选条件如下： 1) Fold Change (linear) =< 0.5 或者Fold Change (linear) >= 2。 2) T-testp-value < 0.05 或者 <0.01。最终筛选出差异lncRNA共计1705个，其中在肿瘤中上调的有896个，下调的有809个。将满足上述两个条件的探针数目及分布情况绘制了差异基因火山图(图2 )。在火山图里，每一个点代表芯片上的一个探针点，纵坐标为-log(P-value)值，即由t-检验计算所得的P-value值的以10为底的对数值的相反数。横坐标为log2(FoldChange)，即两组样本间的差异倍数的以2为底的对数值，正负号代表了基因表达的上调或者下调。对样本和基因分别进行分级聚类之后，通过聚类热图（heatmap）直观地展现基因在不同样本中的表达情况（图3）。其中横坐标为6对样本，纵坐标代表了差异lncRNA基因。从芯片的差异倍数结果发现，lncRNA LINC02253在所有6例肿瘤样本中的表达都高于对应的正常组织，差异倍数约为60.88。
3. 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证LINC02253基因在上述六对样本中的表达量，结果见表4，与芯片结果一致，LINC02253基因在肿瘤样本中的表达量约是对应正常组织的75.06。所用的引物序列见下：
表4 LINC02253基因qRT-PCR和芯片验证结果
实施例2
我们在获得的96例临床样本中进一步验证LINC02253基因的表达量标本收集获得南京医科大学医学伦理委员会的批准。
组织标本来源：标本来自2015年02月—2016年2月期间就诊于南京医科大学第一附属医院普外科结直肠癌患者90例，病例选取条件为：( 1 )术后均经病检确诊；( 2 )术前未进行过放疗、化疗或其他抗肿瘤治疗。收集的信息包括患者住院号、姓名、性别、年龄、出生地、联系地址、联系电话、肿瘤家族史、肠镜结果、重要的影像学检查资料、手术记录、术后病理诊断结果。初次记录资料不完整者，后期借助医院电子病历系统和病案室存档资料补充完善。其中可公开的相关信息包括年龄，性别，肿瘤大小，TMN分期等整理归纳后见表格1。
1、组织总RNA提取
总RNA提取采用Trizol法，取样本约30μg,加入1ml Trizol进行匀浆，每次15s,一共两次。加入200μl氯仿，剧烈振摇，使上下两相充分混合，室温静置5min后，离心12000xg*15min4℃离心。小心吸取上层水相400μl于新的RNase freeEP管中，加入等体积异丙醇（400μl）,颠倒混匀，室温放置10min后，12000xg*15min 4℃离心，离心后可见管内白色RNA斑块。弃尽上清，使用75%乙醇（DEPC水稀释）洗涤斑块一次，7800xg*5min 4℃。弃尽上清，室温放置晾干（10-15min）,使得酒精挥发干净。之后加入50μl DEPC水溶解，测定浓度备用。
2、RNA逆转成cDNA
逆转录使用诺唯赞（vazyme）公司的逆转录试剂盒（去基因组DNA），每个样本取1μgRNA进行
逆转录，体系如下：
上述混合物混匀，42℃ 2min；
混匀后，进行逆转录PCR，条件如下：
（1）50℃,15min
（2）85℃,5s
得到的cDNA产物可用于Real-time PCR。
3、实时荧光定量 PCR
将上一步的cDNA作为模板进行实时荧光定量 PCR,使用诺唯赞（vazyme）公司的SYBRGreen Mix,体系为10μl体系：
上述混合物混匀后，进行实时荧光定量 PCR，反应条件如下：
（1）95℃，5min
（2）95℃，10s—60℃，30s;40个循环
本次使用引物序列如下同前：
4、数据分析
LINC02253/GAPDH=2^-(CtLINC02253-CtGAPDH)
统计学组间差异用双尾Student’s t检验，计算P值。临床分期统计用卡方检验。图4显示，相比较于正常组织，结直肠癌病人的肿瘤组织的LINC02253基因的表达量明显增高。图5显示LINC02253基因的表达量在不同临床分期中的分布没有明显差异。
实施例3 在TCGA数据库中LINC02253表达量
TCGA(The Cancer Genome Atlas)是由美国政府发起，试图通过应用基因组分析技术，特别是采用大规模的基因组测序，将人类全部癌症的基因组变异图谱绘制出来，并进行系统分析，旨在找到所有致癌和抑癌基因的微小变异，了解癌细胞的发生、发展机制，在此基础上取得新的诊断和治疗方法，最后可以勾画出整个新型“预防癌症的策略”。由美国国家癌症和肿瘤研究所（NCI）和国家人类基因组研究所（NHGRI）联合进行，预计耗资1亿美元。
利用Bioconductor/TCGAbiolinks 函数包从TCGA数据库（http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）下载并预处理结直肠癌数据集（COAD READ）的mRNA表达RNASEqV2数据，（643例肿瘤样本，51例正常组织样本）同时下载临床参数和临床资料。统计学组间差异用双尾Student’s t检验，计算P值。临床分期统计用卡方检验。在TCGA数据库中LINC02253在结直肠癌肿瘤组织中表达量也明显高于正常组织，约为正常组织的142.7094倍，且有统计学意义，如图6显示。图7结果显示LINC02253的表达在肿瘤临床分期中分布均匀，并没有明显变化。
实施例4 结直肠癌细胞系中LINC02253表达量
检测结直肠癌细胞系（SW480\LOVO\HT-29\DLD\CACO2）和正常结肠细胞（FHC）LINC02253表达量，具体方法如下：
1、细胞培养：SW480\LOVO\DLD\ FHC细胞培养在含有10%胎牛血清（Gibico），1%三抗（Gibico）的RPMI(HYCLON)培养液中；HT-29细胞培养在含有10%胎牛血清（Gibico），1%三抗（Gibico）的DMEM(HYCLON)培养液中; CACO2细胞培养在含有1%非必需氨基酸（HYCLON），10%胎牛血清（Gibico），1%三抗（Gibico）的RPMI(HYCLON)培养液中。
2、细胞总RNA提取
总RNA提取采用Trizol法，收集约1×106 个细胞，加入1mlTrizol。加入200μl氯仿，剧烈振摇，使上下两相充分混合，室温静置5min后，离心12000xg*15min 4℃离心。小心吸取上层水相400μl于新的RNase freeEP管中，加入等体积异丙醇（400μl）,颠倒混匀，室温放置10min后，12000xg*15min 4℃离心，离心后可见管内白色RNA斑块。弃尽上清，使用75%乙醇（DEPC水稀释）洗涤斑块一次，7800xg*5min 4℃。弃尽上清，室温放置晾干（10-15min）,使得酒精挥发干净。之后加入50μl DEPC水溶解，测定浓度备用。
3、RNA逆转成cDNA
逆转录使用诺唯赞（vazyme）公司的逆转录试剂盒（去基因组DNA），每个样本取1μgRNA进行
逆转录，体系如下：
上述混合物混匀，42℃ 2min；
混匀后，进行逆转录PCR，条件如下：
（1）50℃,15min
（2）85℃,5s
得到的cDNA产物可用于Real-time PCR。
4、实时荧光定量 PCR
将上一步的cDNA作为模板进行荧光实时定量 PCR,使用诺唯赞（vazyme）公司的SYBRGreen Mix,体系为10μl体系：
上述混合物混匀后，进行实时荧光定量 PCR，反应条件如下：
（1）95℃，5min
（2）95℃，10s—60℃，30s；40个循环
本次使用引物序列同前：
从图8中可以看出，在细胞系中，结直肠癌细胞系（SW480\LOVO\HT-29\DLD\CACO2）的LINC02253表达量明显高于正常结肠细胞（FHC）。
实施例5 检测LINC02253对结直肠癌细胞增殖和克隆形成的影响以确定LINC0225基因的功能
A在结直肠癌细胞系DLD中用针对3个不同靶点的siRNA将LINC0225敲低，检测敲低效率，实验方案:
1、LINC02253 的干扰
向试剂公司（锐博生物）购买LINC02253的siRNA(小片段干扰RNA)。在六孔板中提前24小时每孔种上2×105个DLD细胞，每孔用脂质体（lipo 2000）10μl+siRNA(20μm)10μl的转染复合物进行片段的转染，48h后收获细胞。
干扰片段序列如下：
2、细胞总RNA提取：
总RNA提取采用Trizol法，收集约1*106 个细胞，加入1mlTrizol。加入200μl氯仿，剧烈振摇，使上下两相充分混合，室温静置5min后，离心12000xg*15min 4℃离心。小心吸取上层水相400μl于新的RNase freeEP管中，加入等体积异丙醇（400μl）,颠倒混匀，室温放置10min后，12000xg*15min 4℃离心，离心后可见管内白色RNA斑块。弃尽上清，使用75%乙醇（DEPC水稀释）洗涤斑块一次，7800xg*5min 4℃。弃尽上清，室温放置晾干（10-15min）,使得酒精挥发干净。之后加入50μl DEPC水溶解，测定浓度备用。
3、RNA逆转成cDNA
逆转录使用诺唯赞（vazyme）公司的逆转录试剂盒（去基因组DNA），每个样本取1μgRNA进行逆转录，体系如下：
将上述混合物混合均匀后，42℃下反应2分钟，
混匀后，进行逆转录PCR，条件如下：
（1）50℃,15min
（2）85℃,5s
4、实时荧光定量 PCR
将上一步的cDNA作为模板进行实时荧光定量PCR,使用诺唯赞（vazyme）公司的SYBRGreen Mix,体系为10μl体系:
上述混合物混匀后，进行实时荧光定量 PCR，反应条件如下:
（1）95℃，5min
（2）95℃，10s—60℃，30s;40个循环
本次使用引物序列如下:
结果如图9所示，从图中可以看出3个siRNA均能敲低LINC02253基因，敲低后的表达量约为正常的50-60%
B、细胞增殖（CCK8）和克隆形成
我们对LINC02253敲低的DLD细胞进行细胞增殖和克隆形成实验，方法如下：
1、CCK8法检测细胞增殖：以每孔2×103个细胞接种于96孔培养板中，种后6h算0h,其它按照 4个时间点(24、48、72及96 h)进行检测。检测时每孔加100μl含10％CCK8培养基，37℃、5％C02培养箱孵育2H后，用酶标仪测波长为450 nm下的OD值。以细胞生存率为纵坐标，检测时间为横坐标绘制生存图。
2、克隆形成实验：细胞转染48h后，去培养液，PBS洗涤细胞，用胰酶消化液消化并收集细胞。 将细胞1000rpm／min离心5min。弃去上清，用培养基重悬细胞并计数，取2×103个细胞种植于6孔板中培养。培养10天后，待肉眼可见克隆集落时，弃上清，用甲醛固定1H和结晶紫染色30 min。
图10和图11显示，LINC02253基因敲低后能显著降低结直肠癌细胞系DLD的增殖能力，以及克隆形成能力。提示LINC02253基因能促进结直肠癌细胞的增殖，促进肿瘤的发生发展。
因此，芯片，TCGA，临床结果均表明在结直肠癌组织或者细胞中LINC02253表达高于正常组织或正常细胞。敲低结直肠癌细胞系的LINC02253表达可以减缓结直肠癌细胞的增殖，降低结直肠癌细胞的克隆形成能力。因此我们提出可以通过结肠镜活检取组织或者手术标本做实时荧光定量PCR检测LINC02253的表达量，辅助组织病理学，进行结直肠癌的早期诊断。从而增加结直肠癌病人的生存率。
实施例6 用LINC02253/GAPDH比值诊断结直肠癌的价值
根据对90例样本的检测90例正常结肠组织的LINC02253/GAPDH值，计算其95%的可信区间来划分参考值范围。上限=调整均数+1.64S=0.00018
因此将LINC02253/GAPDH比值≥0.00018设为阳性，<0.00018设为阴性。根据这个标准，列出了我们的分析结果，如下表，发现LINC02253作为结直肠癌分子标记正确诊断率可以达到81%。
1、建立检验假设，确定检验水准
H0：B=C，即用LINC02253/GAPDH比值分类标本的结果与标本自身分类相同
H1：B≠C，即用LINC02253/GAPDH比值分类标本的结果与标本自身分类不同
α=0.05
2、计算χ2值和自由度 b+c=50>40
χ2=(b-c)2/(b+c)=2.95
自由度=1
查表p=0.117,按照α=0.05水准，拒绝H1，接受H0,差异无统计意义，可以认为LINC02253/GAPDH比值分类标本的结果与标本自身分类相同。
因此我们将LINC02253/GAPDH比值≥0.00018设为阳性，<0.00018设为阴性具有较高的准确性和特异性。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 一种用于扩增LINC02253基因的引物对及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
ccgggaaact gtggcgtgat gg 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
aggtggagga gtgggtgtcg ctgtt 25
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
gtcaggacag aacagaacag ag 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
gagaacgaca gggacatt 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
ggacaacaag tgtctatta 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
gctgtcagga cgacaccaa 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
cgaagttaca gtattggtt 19
Claims (5)
1.一种用于扩增LINC02253基因的引物对，其特征在于如序列1所示。
2.一种用于检测LINC02253基因表达量的试剂，其特征在于，包括扩增LINC02253基因的引物对。
3.一种用于检测LINC02253基因表达量的表达谱芯片，其特征在于，包含含有扩增LINC02253基因的引物对序列的探针。
4.LINC02253基因在诊断或辅助诊断结肠癌患者早期或者癌细胞转移的鉴定产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述LINC02253/GAPDH=2^-(CtLINC02253-CtGAPDH)，若是结果≥0.00018设为阳性，<0.00018设为阴性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Patent Citations (3)
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ESTER SAUS ET AL.: "Long Non-Coding RNAs As Potential Novel Prognostic Biomarkers in Colorectal Cancer", 《FRONTIERS IN GENETICS》 * |
| JENNIFER PÉREZ-BOZA ET AL.: "Exploring the RNA landscape of endothelial exosomes", 《RNA》 * |
| LINN FAGERBERG ET AL.: "Analysis of the Human Tissue-specific Expression by Genome-wide Integration of Transcriptomics and Antibody-based Proteomics", 《MOLECULAR & CELLULAR PROTEOMICS》 * |
Also Published As
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