CN108977540A - 一种结合监测RhoA信号通路和microRNAs的胃癌诊断试剂盒及其应用 - Google Patents

一种结合监测RhoA信号通路和microRNAs的胃癌诊断试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种结合监测RhoA信号通路和microRNAs的胃癌诊断试剂盒，包括：RhoA检测引物，荧光探针RhoAP；miR‑17检测引物，荧光探针miR‑17P；以人源β‑actin为靶基因的内参照质控序列。该试剂盒用于胃癌检测具有较高的灵敏度及特异性，避免了免疫学检测方法的假阳性，为临床个体化治疗提供了简便快捷的检测手段。

Description

一种结合监测RhoA信号通路和microRNAs的胃癌诊断试剂盒 及其应用
技术领域
本发明涉及疾病的基因检测技术领域，具体涉及一种结合监测RhoA信号通路和microRNAs的胃癌诊断试剂盒及其应用。
背景技术
胃癌(gastric carcinoma)是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位，胃癌发病有明显的地域性差别，在我国的西北与东部沿海地区胃癌发病率比南方地区明显为高。好发年龄在50岁以上，男女发病率之比为2：1。由于饮食结构的改变、工作压力增大以及幽门螺杆菌的感染等原因，使得胃癌呈现年轻化倾向。胃癌可发生于胃的任何部位，其中半数以上发生于胃窦部，胃大弯、胃小弯及前后壁均可受累。绝大多数胃癌属于腺癌，早期无明显症状，或出现上腹不适、嗳气等非特异性症状，常与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症状相似，易被忽略，因此，目前我国胃癌的早期诊断率仍较低。胃癌的预后与胃癌的病理分期、部位、组织类型、生物学行为以及治疗措施有关。
Rho蛋白是一种具有GTP酶活性的小分子G蛋白(small G protein，GTPase)，主要包括Rho、Rae、Cdc42三个亚家族，至少包括23个成员，它在调节肌动蛋白(细胞骨架)的活动、细胞分裂增殖、细胞变形中起关键作用，从而参与细胞迁移、调控肿瘤转移。已经证实Rho家族成员在乳腺癌、胰腺癌、大肠癌、头颈部恶性肿瘤中有过度表达，并且与肿瘤的侵袭、转移密切相关。Rho家族蛋白几乎参与了肿瘤发生发展的每个环节，其中包括调节细胞骨架和细胞周期，改变细胞黏附和运动，改变细胞转化、参与肿瘤细胞侵袭转移、肿瘤细胞传代等，RhoA在胃癌和非典型增生组织中的表达显著高于正常的胃粘膜组织。
microRNAs是近年来新发现的一类非编码小分子RNA，长度为22—28个核苷酸，广泛存在于真核生物中。microRNA通过与靶mRNA 3’UTR完全或不完全的互补结合，导致靶mRNA降解或翻译抑制，从而调控靶基因的表达，影响细胞增殖、分化和凋亡。除此之外，一些microRNAs与肿瘤关系密切,与正常组织相比，肿瘤组织中有大量表达下调的microRNAs，其中包括miR-106a、miR-17、miR-20a、miR-21、miR-93等。它们通过调节RhoA及TGFB等信号通路来影响肿瘤相关基因的表达，来发挥抑癌或促癌的作用。
发明内容
本发明通过我们已经摸索的RhoA信号通路的关键分子，结合相关microRNAs，自主设计RhoA以及miR-17的特异性探针和引物序列，进一步提供了一种胃癌诊断试剂盒，达到可用于健康人群早期筛查、胃癌患者术前诊断术以及术后康复检测的目的。
本发明第一方面提供了一种结合监测RhoA信号通路和microRNAs的胃癌诊断试剂盒，试剂包括：RhoA检测引物：RhoAF、RhoAR，荧光探针RhoAP；miR-17检测引物：miR-17F、miR-17R，荧光探针miR-17P；以人源β-actin为靶基因的内参照质控序列；
所述RhoAF序列如SEQ ID NO：1所示，
RhoAR序列如SEQ ID NO：2所示，
RhoAP序列如SEQ ID NO：3所示，
miR-17F序列如SEQ ID NO：4所示，
miR-17R序列如SEQ ID NO：5所示，
miR-17P序列如SEQ ID NO：6所示。
优选的，所述以人源β-actin为靶基因的内参照质控序列包括：β-actinF、β-actinR、荧光探针β-actinP；
所述β-actinF序列如SEQ ID NO：7所示，
β-actinR序列如SEQ ID NO：8所示，
β-actinP序列如SEQ ID NO：9所示。
更加优选的，所述RhoA检测引物、荧光探针RhoAP、miR-17检测引物、荧光探针miR-17P、以人源β-actin为靶基因的内参照质控序列的浓度均为10μmol/L。
优选的，所述试剂盒中试剂还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括：dNTP、5xBuffer、去离子水。
更加优选的，所述试剂盒中试剂还包括：Taq DNA聚合酶、UDG酶。
优选的，所述荧光探针RhoAP的5’端连接有FAM荧光发光基团，3’端连接有TAMRA荧光淬灭基团；所述荧光探针miR-17P的5’端连接有FAM荧光发光基团，3’端连接有TAMRA荧光淬灭基团。
优选的，所述荧光探针β-actinP的5’端连接有VIC荧光发光基团，3’端连接有TAMRA荧光淬灭基团。
本发明第二方面提供了上述结合监测RhoA信号通路和microRNAs的胃癌诊断试剂盒在评估胃癌患病风险、治疗效果和复发监控中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明是以MKL-1协同SMAD5基因表达上调与胃癌发生成密切正相关为核心，检测其关系密切正相关的RhoA分子，以及负相关的miR-17，利用特异性探针及/或特异性引物进行荧光PCR(探针法)，检测胃组织样本，具有较高的灵敏度及特异性，避免了免疫学检测方法的假阳性，为临床个体化治疗提供了简便快捷的检测手段，扩大了适用范围，满足了不同的临床需求。本试剂盒检测准确率达93.18％，整个检测过程缩减至仅需2-3个小时，检测效率明显提高，具备良好的应用前景。
本试剂盒同时加入了内参照质控，全程监控核酸提取和荧光PCR检测过程，最大限度的避免了因污染引起的假阳性及因取材部位不合适或PCR反应出现问题引起的假阴性的发生。
附图说明
图1为实施例中RhoA表达量检测结果示意图；
图2为实施例中miR-17表达量检测结果示意图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明提供的一种结合监测RhoA信号通路和microRNAs的胃癌诊断试剂盒及其应用予以进一步说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
本实施例提供了一种结合监测RhoA信号通路和microRNAs的胃癌诊断试剂盒，构成本试剂盒的核心即检RhoA以及miR-17特异性引物和荧光探针。
具体的，本试剂盒中试剂包括：RhoA检测引物：RhoAF、RhoAR，荧光探针RhoAP；miR-17检测引物：miR-17F、miR-17R，荧光探针miR-17P；以人源β-actin为靶基因的内参照质控序列：β-actinF、β-actinR、荧光探针β-actinP。
RhoA检测引物：
上游引物序列(RhoA F)：5’-GTAGAGTTGGCTTTATGGG-3’
下游引物序列(RhoA R)：5’-CACTCCGTCTTGGTCTT-3’
荧光探针序列(RhoA P)：
5’-FAM-TCTGCCCCAACGTGCCCATCAT-TAMRA-3’
miR-17检测引物：
上游引物序列(miR-17F)：5’-GTCAGAATAATGT-3’
下游引物序列(miR-17R)：5’-CCATAATGCTAC-3’
荧光探针序列(miR-17P)：
5’-FAM-AAGTGCTTACAGTGCAGGTAGTGATAT-TAMRA-3’
本实施例中以人源β-actin为靶基因的内参照质控引物和特异性检测探针序列如下：
上游引物序列(β-actin F)：5’-GGGACCTGACCGACTACCTC-3’
下游引物序列(β-actinR)：5’–GGGCGATGATCTTGATCTTC-3’
荧光探针序列(β-actinP)：
5’-VIC-CCTCACCCTGAAGTACCCCATCGAGC-TAMRA-3’
本试剂盒中上述特异性引物及探针的浓度均为10μmol/L，本试剂盒还包括用于配制PCR反应液及进行荧光PCR的其他试剂，包括：dNTP、5xBuffer、Taq DNA Polymerase、Uracil-DNA Glycosylase、去离子水。
将上述结合监测RhoA信号通路和microRNAs的胃癌诊断试剂盒按如下方法来进行胃癌检测。
(1)配制PCR反应液：分别配制用于RhoA检测的PCR反应液1，及用于检测miR-17的PCR反应液2，PCR反应液1组分配比如表1所示，PCR反应液2组分配比如表2所示。
表1PCR反应液1组分配比
表2PCR反应液2组分配比
(2)提取待测样本核酸作为模板进行荧光PCR扩增反应，所述荧光PCR扩增体系如表3所示，荧光PCR扩增反应程序如表4所示。
表3荧光PCR扩增体系
表4荧光PCR扩增反应程序
表3中模板DNA为从待测样本中提取所得，具体的，所述待测样本为胃组织样本，对样本进行RNA提取以及反转录得到模板DNA，该核酸提取方法采用常规提取方法即可，也可选择采用市场上购买的核酸提取试剂盒来进行模板DNA的提取。
PCR反应中dNTP溶液的摩尔浓度可为100mmol/L。所述dNTP溶液及5xBuffer、TaqDNA酶、UDG酶均为能够于市场购买得到的原料，本实施例对其来源没有特殊限制。
取样本的模板DNA进行两次荧光PCR反应，一次选用PCR反应液1按表3配制反应体系并按表4进行PCR反应，另一次选用PCR反应液2按表3配制反应体系并按表4进行PCR反应。
(3)结果判定
当RhoA高表达且miR-17低表达是判定为早期胃癌确诊。
本实施例自主设计RhoA以及miR-17的特异性探针和引物序列，通过组合可同时检测RhoA以及miR-17的表达量。同时设置内参照质控全程监控核酸提取和荧光PCR检测全过程，最大限度的避免了检测假阳性的发生。
选择一例已确诊患者的组织样本按上述步骤进行胃癌测试，测试结果如附图1和附图2所示。从图1、图2中可以看出，该患者样本检测结果中RhoA表达量显著高于正常值，且miR-17表达量显著低于正常值，判定为胃癌确诊，与患者实际情况一致。
进一步的，将该试剂盒用于大量样本的胃癌检测中，将已确诊患者与健康人混编为测试组组织样本，其中胃癌44例、正常16例，共60例。对每例样本均采用上述试剂盒及测试方法进行胃癌检测，最终成功检测出胃癌41例，与确诊病例吻合，准确率达93.18％，且每例检测过程均在2-3个小时内完成，效率相比于传统检测方法有明显提升。
本试剂盒从胃癌发生密切相关的诸多因子中，同时选取了正相关的RhoA分子，以及负相关的miR-17作为胃癌诊断的检测因子，使整个检测过程缩减至仅需2-3个小时，相比传统检测方法不仅效率大大提高，而且敏感度及特异性都有了极大的改进。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳瑞科生物科技有限公司
<120> 一种结合监测RhoA信号通路和microRNAs的胃癌诊断试剂盒及其应用
<141> 2018-07-18
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gtagagttgg ctttatggg 19
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cactccgtct tggtctt 17
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tctgccccaa cgtgcccatc at 22
<210> 4
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gtcagaataa tgt 13
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ccataatgct ac 12
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
aagtgcttac agtgcaggta gtgatat 27
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gggacctgac cgactacctc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gggcgatgat cttgatcttc 20
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
cctcaccctg aagtacccca tcgagc 26

Claims (8)

1.一种结合监测RhoA信号通路和microRNAs的胃癌诊断试剂盒，其特征在于：试剂包括：RhoA检测引物：RhoAF、RhoAR，荧光探针RhoAP；miR-17检测引物：miR-17F、miR-17R，荧光探针miR-17P；以人源β-actin为靶基因的内参照质控序列；
所述RhoAF序列如SEQ ID NO：1所示，RhoAR序列如SEQ ID NO：2所示，RhoAP序列如SEQID NO：3所示，miR-17F序列如SEQ ID NO：4所示，miR-17R序列如SEQ ID NO：5所示，miR-17P序列如SEQ ID NO：6所示。
2.如权利要求1所述的结合监测RhoA信号通路和microRNAs的胃癌诊断试剂盒，其特征在于：所述以人源β-actin为靶基因的内参照质控序列包括：β-actinF、β-actinR、荧光探针β-actinP；所述β-actinF序列如SEQ ID NO：7所示，β-actinR序列如SEQ ID NO：8所示，β-actinP序列如SEQ ID NO：9所示。
3.如权利要求2所述的结合监测RhoA信号通路和microRNAs的胃癌诊断试剂盒，其特征在于：所述RhoA检测引物、荧光探针RhoAP、miR-17检测引物、荧光探针miR-17P、以人源β-actin为靶基因的内参照质控序列的浓度均为10μmol/L。
4.如权利要求1所述的结合监测RhoA信号通路和microRNAs的胃癌诊断试剂盒，其特征在于：试剂还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括：dNTP、5xBuffer、去离子水。
5.如权利要求4所述的结合监测RhoA信号通路和microRNAs的胃癌诊断试剂盒，其特征在于：试剂还包括：Taq DNA聚合酶、UDG酶。
6.如权利要求1所述的结合监测RhoA信号通路和microRNAs的胃癌诊断试剂盒，其特征在于：所述荧光探针RhoAP的5’端连接有FAM荧光发光基团，3’端连接有TAMRA荧光淬灭基团；所述荧光探针miR-17P的5’端连接有FAM荧光发光基团，3’端连接有TAMRA荧光淬灭基团。
7.如权利要求2所述的结合监测RhoA信号通路和microRNAs的胃癌诊断试剂盒，其特征在于：所述荧光探针β-actinP的5’端连接有VIC荧光发光基团，3’端连接有TAMRA荧光淬灭基团。
8.权利要求1所述结合监测RhoA信号通路和microRNAs的胃癌诊断试剂盒在评估胃癌患病风险、治疗效果和复发监控中的应用。
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