CN109265679B - 一种聚(谷氨酸-胆碱磷酸)及其作为疫苗免疫佐剂的应用 - Google Patents

一种聚(谷氨酸-胆碱磷酸)及其作为疫苗免疫佐剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种聚(谷氨酸‑胆碱磷酸)及其作为疫苗免疫佐剂的应用，属于生物医用材料领域。该聚(谷氨酸‑胆碱磷酸)通过采用化学共价键将胆碱磷酸基团修饰到聚谷氨酸的侧链上，得到一种生物医用高分子聚(谷氨酸‑胆碱磷酸)，具有良好的水溶性、细胞膜黏附性、可生物降解性和生物安全性。本发明首次采用聚(谷氨酸‑胆碱磷酸)作为疫苗免疫佐剂，能够更有效地促进抗原特异性体液免疫和细胞免疫应答，包括显著升高的抗原特异性IgG抗体效价和细胞因子分泌。因此，聚(谷氨酸‑胆碱磷酸)作为疫苗免疫佐剂在免疫治疗领域具有重要的应用价值。

Description

一种聚(谷氨酸-胆碱磷酸)及其作为疫苗免疫佐剂的应用
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，涉及一种聚(谷氨酸-胆碱磷酸)及其作为疫苗免疫佐剂的应用。
背景技术
接种疫苗被认为是预防传染病的最有效方法，这对保护人类健康具有重要意义。近几十年来，疫苗在临床和临床前免疫治疗方面取得了重大进展和突破。但是，仍有很多的疾病希望能够通过接种疫苗来预防或治疗。
大多数传统疫苗(主要包括灭活抗原和活减毒抗原)存在安全性风险，限制了它们的有效应用。随着生物技术的发展，研究人员设计和制备了一些新型疫苗，如重组疫苗、DNA疫苗和亚单位疫苗。这些新型疫苗比传统疫苗更安全，副作用更小，但免疫原性差。为了解决这个问题，将某些材料作为免疫佐剂或疫苗递送系统与疫苗同时使用，可用于增强抗原特异性免疫应答。
目前，最常见的佐剂包括铝佐剂和弗氏佐剂(后者仅限于动物使用)。然而，铝佐剂和弗氏佐剂存在一些缺点，包括安全问题、抗原效率低下、及不能诱导有效的细胞免疫应答。因此，有必要开发更安全更有效的疫苗佐剂或载体来诱导足够强的抗原特异性体液和细胞免疫。生物体的免疫应答包括两种类型：体液免疫和细胞免疫。细胞免疫对预防和/或治疗某些疾病如癌症和病毒感染尤其重要。
聚(L-谷氨酸)是一种常用的生物医用高分子，具有良好的水溶性、可生物降解性和生物安全性。
胆碱磷酸是一种人工设计并合成的功能基团，其构型与磷酸胆碱基团(真核细胞膜成分二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)的端基)相反(如图1b所示)。胆碱磷酸基团可通过静电吸引与广泛分布在细胞膜上的磷脂酰胆碱基团相互作用。研究发现，用胆碱磷酸基团修饰的聚合物可通过细胞膜上磷脂酰胆碱和胆碱磷酸基团之间的相互作用而强烈吸附到细胞膜上，随后被有核细胞迅速摄入胞内。总之，磷脂酰胆碱基团和胆碱磷酸基团之间的静电引力可用来增强胆碱磷酸修饰的聚合物对细胞膜的吸附和细胞内摄入。这使得胆碱磷酸基团在药物递送方面具有特殊的优势。亟待寻找一种可以用作疫苗免疫佐剂的胆碱磷酸基团修饰的聚合物。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种聚(谷氨酸-胆碱磷酸)的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的聚(谷氨酸-胆碱磷酸)。
本发明的再一目的在于提供上述聚(谷氨酸-胆碱磷酸)的应用。
本发明为了得到一种具有细胞膜黏附性的生物医用高分子，通过采用化学共价键将胆碱磷酸基团修饰到聚谷氨酸的侧链上，得到一种新型的生物医用高分子聚(谷氨酸-胆碱磷酸)，具有良好的水溶性、细胞膜黏附性、可生物降解性和生物安全性。
为了克服现有的免疫佐剂诱导细胞免疫能力弱和毒副作用较大的缺陷，本发明将上述制备的聚(谷氨酸-胆碱磷酸)用作疫苗免疫佐剂，用于提高机体的特异性体液和细胞免疫应答。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种聚(谷氨酸-胆碱磷酸)的制备方法，包括如下步骤：
(1)Co(PMe3)4的合成
在氩气下将无水氯化钴和镁粉混合，在真空下加热活化，得到活化后的混合粉末；然后将四氢呋喃和三甲基膦溶液在-50℃到-100℃温度范围(优选-78℃)慢慢加入到活化后的混合粉末中，时间不低于1小时，然后再保持0.5～2小时；将反应物缓慢升温至室温并保持12～48小时；通过真空除去四氢呋喃收集黑褐色粉末，然后用无水正己烷洗涤，在干燥的氩气下收集Co(PMe3)4；
(2)γ-氯丙烷-L-谷氨酸(C-L-Glu)的合成
将L-谷氨酸和3-氯丙醇混合，将该混合物加热至60～100℃，然后在2小时内滴加浓硫酸，并在60～100℃下继续搅拌0.5～3小时；真空蒸馏除去过量的3-氯丙醇；将反应混合物冷却至室温，然后将三乙胺滴入至该反应混合物中，时间不低于1小时；将粗产物过滤，滤液用乙醚沉淀，并用乙醚洗涤；沉淀物置于30～60℃真空下过夜，获得γ-氯丙烷-L-谷氨酸C-L-Glu(白色粉末)；
(3)γ-氯丙烷-L-谷氨酸基N-羧酸酐(C-L-Glu NCA)的合成
将干燥的THF和三光气加入到真空干燥后的C-L-Glu中，混合物在30～60℃氩气保护下再搅拌1～5小时；真空除去溶剂收集得到黄色液体；纯化粗产物，得到γ-氯丙烷-L-谷氨酸基N-羧酸酐C-L-Glu NCA，呈无色油状；
(4)聚(γ-氯丙基-L-谷氨酸)(pCGlu)的合成
pCGlu在无水无氧条件下合成，具体为：将C-L-Glu NCA和无水DMF的混合物在25～50℃下放置2～6小时，然后加入Co(PMe3)4后继续在25～50℃保持24～96小时；将反应物置于空气中，聚合停止；将反应混合物在0～8℃下沉淀到甲醇中，过滤后真空干燥；得到聚(γ-氯丙基-L-谷氨酸)pCGlu的白色固体聚合物；数均分子量Mn,GPC＝8.4KDa，PDI＝1.06；
(5)聚(γ-叠氮基丙基-L-谷氨酸)(pAGlu)的合成
将DMF，pCGlu和叠氮化钠的混合物在30～80℃搅拌12～60小时；将反应混合物粗滤，然后过中性氧化铝柱除去盐；在30～80℃下旋转蒸发除去DMF后得到浅黄色聚合物膜；将膜溶解于二氯甲烷后在甲醇中沉淀，然后过滤；真空干燥后得到聚(γ-叠氮基丙基-L-谷氨酸)pAGlu白色粉末；
(6)通过“点击”化学法合成聚(谷氨酸-胆碱磷酸)(pCPGlu)
在无氧条件中，将溴化铜、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺、pAGlu和磷酸胆碱的混合物在20～60℃下搅拌12～60小时，然后将混合物置于空气中来停止点击反应；最后，透析，最终获得聚(谷氨酸-胆碱磷酸)(pCPGlu)。
优选的，步骤(1)中，
无水氯化钴、镁粉、三甲基膦的摩尔比为4.2：12.9：18.1；
无水氯化钴、四氢呋喃、三甲基膦溶液的比值为4.2mmo1：10mL：18.1mL；
所述的加热活化的时间为0.5～2小时，更优选为0.5小时；
所述的再保持的时间为0.5小时；
所述的缓慢升温至室温并保持的时间为24小时。
优选的，步骤(2)中，
所述的将该混合物加热至60℃；
所述的继续搅拌的条件为在60℃下继续搅拌2小时；
所述的真空蒸馏的温度为30～60℃，更优选为40℃；
所述的真空下过夜的温度为40℃。
优选的，步骤(3)中，
混合物在50℃氩气保护下再搅拌2小时；
所述的真空干燥的条件为在30～80℃下真空干燥1～5小时；更优选为在50℃下真空干燥2小时。
所述的纯化粗产物的条件为用硅胶柱色谱法纯化粗产物，流动相为乙酸乙酯/己烷，己烷比例：100％到60％；
优选的，步骤(4)中，
所述的C-L-Glu NCA与Co(PMe3)4的摩尔比为40：1；
所述的放置的条件为在25℃下放置4小时；
所述的保持的时间为25℃保持72小时；
所述的沉淀的温度为4℃；
所述的真空干燥的条件为置于30～60℃中真空干燥6～24小时，更优选为置于50℃中真空干燥12小时。
优选的，步骤(5)中，
所述的搅拌的条件为在60℃搅拌48小时；
所述的旋转蒸发的温度为60℃。
所述的真空干燥的温度为30～80℃；更优选为60℃。
优选的，步骤(6)中，
所述的搅拌的条件为在25℃下搅拌48小时；
所述的透析选用截留分子量2000的透析膜进行透析。
一种聚(谷氨酸-胆碱磷酸)，通过上述制备方法制备得到。
所述的聚(谷氨酸-胆碱磷酸)在中性pH环境中带正电荷。因此，该聚阳离子能够通过静电吸引包裹抗原蛋白，并通过质子海绵效应从内涵体/溶酶体逃脱以促进交叉呈递和细胞免疫。
所述的聚(谷氨酸-胆碱磷酸)作为疫苗免疫佐剂的应用。
所述的疫苗中，聚(谷氨酸-胆碱磷酸)与抗原的质量比为0.5～1：1；优选为1：1；聚(谷氨酸-胆碱磷酸)静电吸附模型抗原蛋白卵清蛋白形成带正电荷的纳米粒子，并通过皮下注射进行接种，进一步检测免疫应答的效果。
相对于现有的疫苗免疫佐剂，本发明具有如下的优点及效果：
(1)聚(谷氨酸-胆碱磷酸)是一种新型的生物医用高分子，具有良好的水溶性、细胞膜黏附性、可生物降解性和生物安全性。
(2)本发明首次采用聚(谷氨酸-胆碱磷酸)作为疫苗免疫佐剂，能够更有效地促进抗原特异性体液免疫和细胞免疫应答，包括显著升高的抗原特异性IgG抗体效价和细胞因子分泌。因此，聚(谷氨酸-胆碱磷酸)作为疫苗免疫佐剂在免疫治疗领域具有重要的应用价值。
附图说明
图1是聚(谷氨酸-磷酸胆碱)(pCPGlu)的合成路线图(a)以及pCPGlu/卵清蛋白(OVA)纳米粒子与细胞膜之间的静电吸引作用(b)。
图2是γ-氯丙烷-L-谷氨酸(C-L-Glu)在混合溶剂(DMSO-d6/D2O,9:1,v/v)中的1HNMR图谱。
图3是γ-氯丙烷-L-谷氨酸基N-羧酸酐(C-L-Glu NCA)在CDCl3中的1H NMR图谱。
图4是聚(γ-氯丙基-L-谷氨酸)(pCGlu)在混合溶剂(CDCl3/TFA-d,85:15,v/v)中的1H NMR图谱。
图5是聚(γ-叠氮基丙基-L-谷氨酸)(pAGlu)在混合溶剂(CDCl3/TFA-d,85:15,v/v)中的1H NMR图谱。
图6是聚(谷氨酸-胆碱磷酸)(pCPGlu)在D2O中的1H NMR和31P NMR图谱。
图7是免疫鼠的血清中的抗原特异性抗体IgG及其亚型IgG1和IgG2a的水平。
图8是免疫鼠的脾细胞体外分泌的细胞因子TNF-α(a)和IFN-γ(b)的水平。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。
实施例1
一种聚(谷氨酸-磷酸胆碱)的合成路线如图1a所示。包括如下步骤：
1、Co(PMe3)4的合成
在氩气下将无水氯化钴(1.0g，4.2mmo1)和镁粉(0.31g，12.9mmo1)加入到100mL格氏烧瓶中。混合粉末在真空下用加热枪活化0.5小时，然后将四氢呋喃(10mL)和三甲基膦溶液(18.1mL，18.1mmo1)在-78℃慢慢加入到格氏烧瓶中，时间不低于1小时，反应混合物在-78℃再保持0.5小时。将反应物缓慢升温至室温并保持24小时。通过真空除去四氢呋喃收集黑褐色粉末，然后用无水正己烷洗涤3次。在干燥的氩气下收集Co(PMe3)4。
2、γ-氯丙烷-L-谷氨酸(C-L-Glu)的合成
将L-谷氨酸(7.36g，50mmol)和3-氯丙醇(80mL)加入带搅拌棒的250mL烧瓶中。将该混合物加热至60℃，然后在2小时内滴加浓硫酸(3.2mL)，并在60℃下继续搅拌2小时。40℃真空蒸馏除去过量的3-氯丙醇。将反应混合物冷却至室温，然后将三乙胺(19.5mL)滴入至该反应混合物中，时间不低于1小时。将粗产物过滤。滤液用乙醚沉淀，并用乙醚(200mL)洗涤。沉淀物置于40℃真空下过夜，获得C-L-Glu(白色粉末)。收率为84％。
结果如图2所示，1H NMR(δ:ppm,400MHz,DMSO-d6/D2O,9:1,v/v):4.10(t,2H,-CH2OOC-),3.58(t,2H,-CH2Cl),3.43(t,1H,α-H),2.42(m,2H,-CH2CH2COO-),1.98(m,2H,-CH2CH2COO-),2.04-1.95(m,2H,ClCH2CH2CH2O-)。
3、γ-氯丙烷-L-谷氨酸基N-羧酸酐(C-L-Glu NCA)的合成
将C-L-Glu(11.1g，30mmol)置于干燥的250mL两颈圆底烧瓶中，并在50℃下真空干燥2小时。将干燥的THF(80mL)和三光气(4.0g，13.4mmol)加入烧瓶中，混合物在50℃氩气保护下再搅拌2小时。真空除去溶剂收集得到黄色液体。用硅胶柱色谱法纯化粗产物，流动相为乙酸乙酯/己烷(己烷比例：100％到60％)。C-L-Glu NCA呈无色油状，产率为85％。
结果如图3所示，1H NMR(δ:ppm,400MHz,CDCl3):6.76(s,1H,-NH),4.43(t,1H,α-H),4.28(t,2H,-CH2OOC-),3.60(t,2H,-CH2Cl),2.56(t,2H,-CH2CH2COO-),2.28-2.11(m,4H,-CH2CH2COO-and ClCH2CH2CH2O-)。
4、聚(γ-氯丙基-L-谷氨酸)(pCGlu)的合成
pCGlu在无水无氧手套箱中合成，具体为：将C-L-Glu NCA(1.0g，4.0mmol)和无水DMF(10mL)加入带有搅拌棒的干燥小瓶(20mL)中。混合物在25℃下放置4小时，然后加入Co(PMe3)4(0.0363g，0.1mmol)后继续在25℃保持72小时。将反应物置于空气中，聚合停止。将反应混合物在4℃下沉淀到甲醇中，过滤后置于50℃中真空干燥12小时。得到pCGlu的白色固体聚合物，收率为89％。数均分子量Mn,GPC＝8.4KDa，PDI＝1.06。
结果如图4所示，1H NMR(δ:ppm,400Mhz,CDCl3/TFA-d,85:15,v/v):4.65(s,1H,α-H),4.30(m,2H,-CH2OOC-),3.58(t,2H,-CH2Cl),2.55(s,2H,-CH2CH2COO-),2.20-2.01(m,4H,-CH2CH2COO-and ClCH2CH2CH2O-)。
5、聚(γ-叠氮基丙基-L-谷氨酸)(pAGlu)的合成
将DMF(5mL)，pCGlu(0.5g)和叠氮化钠(1.5g，23mmol)的混合物在60℃搅拌48小时。将反应混合物粗滤，然后过中性氧化铝柱除去盐。在60℃下旋转蒸发除去DMF后得到浅黄色聚合物膜。将膜溶解于二氯甲烷后在甲醇中沉淀，然后过滤。60℃真空干燥后得到白色pAGlu粉末，收率为75％。数均分子量Mn,GPC＝8.6KDa，PDI＝1.07。
结果如图5所示，1H NMR(δ:ppm,400MHz,CDCl3/TFA-d,85:15,v/v):4.61(s,2H,N3CH2CH2CH2-),4.23(br s,1H,CHNH),3.42(s,2H,N3CH2CH2CH2-),2.53(br s,2H,-COCH2CH2-),2.15(br s,2H,-COCH2CH2-),1.99(s,2H,N3CH2CH2CH2-)。
6、通过“点击”化学法合成聚(谷氨酸-胆碱磷酸)(pCPGlu)
在无氧手套箱中，将溴化铜(CuBr，5mg，0.035mmol)、吡啶(bPy，15mg，0.096mmol)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF，10mL)、pAGlu(Mn＝8.6KDa，PDI＝1.07,100mg)和磷酸胆碱(300mg，1.35mmol)加入到20mL小瓶中，将混合物在25℃下搅拌48小时，然后将混合物置于空气中来停止点击反应。最后，用截留分子量2000的透析膜进行透析，最终获得聚(谷氨酸-胆碱磷酸)(pCPGlu)。
结果如图6所示，1H NMR(δ:ppm,400MHz,D2O):8.44,(s,1H,dCHN3-),4.70(s,2H,-N-CH2CN3),4.61(s,2H,N3CH2CH2CH2-),4.44(br s,1H,CHNH)4.11(s,2H,N3CH2CH2CH2-),3.93(m,2H,-OCH2CH2N-),3.76(m,2H,-OCH2CH2N-),3.61-3.58(d,2H,-OCH3),3.17(6H,-N(CH3)2),2.49(br s,2H,-COCH2CH2-),2.30,(br s,2H,N3CH2CH2CH2-),2.13-2.00(br,2H,-COCH2CH2-).31P NMR(D2O)δ1.95。
实施例2
上述聚(谷氨酸-磷酸胆碱)作为疫苗免疫佐剂的应用：
一、制备疫苗制剂
选取pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)作为溶剂，将卵清蛋白OVA和聚(谷氨酸-磷酸胆碱)pCPGlu分别溶于该PBS溶剂中，配成相应的溶液。将等体积的OVA溶液(2mg/mL)与pCPGlu溶液(1或2mg/mL)混合制备两种不同重量比(分别为0.5:1和1:1)的pCPGlu/OVA纳米粒子悬浮液。
pCPGlu/卵清蛋白(OVA)纳米粒子与细胞膜之间的静电吸引作用，如图1b所示。
二、小鼠免疫接种
通过皮下注射的方式，给6～8周的雌性Balb/c小鼠(5只小鼠/组，共3组)接种100μL的OVA(记为OVA alone)，pCPGlu/OVA或OVA/弗氏佐剂制剂(记为FA/OVA)(各含100μgOVA)。总共接种三次，每次间隔时间为一周。第3次注射7天后，收集免疫小鼠的脾脏和血清用于随后的免疫学分析。
三、免疫应答指标的测定
1、IgG抗体效价的测定
通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中IgG及其亚型(IgG1和IgG2a)的水平。结果如图7所示，与阴性对照相比，pCPGlu/OVA制剂诱导了显著更高的抗体水平。
2、脾细胞体外分泌细胞因子的水平
将接种在12孔板上的脾细胞(2.5×106个细胞/毫升)用OVA抗原(25μg/mL)激活60小时。然后，离心分离上清液，用ELISA试剂盒测定脾细胞分泌的TNF-α和IFN-γ细胞因子水平。
结果如图8所示，与阴性对照相比，pCPGlu/OVA制剂诱导了显著更高的TNF-α和IFN-γ分泌水平。
综上所述，本发明制得了新型的聚(谷氨酸-磷酸胆碱)，与卵清蛋白通过静电复合成纳米粒子疫苗制剂，并对小鼠进行皮下注射。结果表明，采用聚(谷氨酸-胆碱磷酸)作为疫苗免疫佐剂，能够更有效地促进抗原特异性体液免疫和细胞免疫应答，包括显著升高的抗原特异性IgG抗体效价和细胞因子分泌。因此，聚(谷氨酸-磷酸胆碱)作为疫苗免疫佐剂在免疫治疗领域具有重要的应用价值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种聚（谷氨酸-胆碱磷酸）的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）Co(PMe3)4的合成
在氩气下将无水氯化钴和镁粉混合，在真空下加热活化，得到活化后的混合粉末；然后将四氢呋喃和三甲基膦溶液在-50℃到-100℃温度范围慢慢加入到活化后的混合粉末中，时间不低于1小时，然后再保持0.5～2小时；将反应物缓慢升温至室温并保持12～48小时；通过真空除去四氢呋喃收集黑褐色粉末，然后用无水正己烷洗涤，在干燥的氩气下收集Co(PMe3)4；
（2）γ-氯丙烷-L-谷氨酸的合成
将L-谷氨酸和3-氯丙醇混合，将该混合物加热至60～100℃，然后在2小时内滴加浓硫酸，并在60～100℃下继续搅拌0.5～3小时；真空蒸馏除去过量的3-氯丙醇；将反应混合物冷却至室温，然后将三乙胺滴入至该反应混合物中，时间不低于1小时；将粗产物过滤，滤液用乙醚沉淀，并用乙醚洗涤；沉淀物置于30～60℃真空下过夜，获得γ-氯丙烷-L-谷氨酸；
（3）γ-氯丙烷-L-谷氨酸基-N-羧酸酐的合成
将干燥的THF和三光气加入到真空干燥后的γ-氯丙烷-L-谷氨酸中，混合物在30～60℃氩气保护下再搅拌1～5小时；真空除去溶剂收集得到黄色液体；纯化粗产物，得到γ-氯丙烷-L-谷氨酸基-N-羧酸酐；
（4）聚（γ-氯丙基-L-谷氨酸）的合成
聚（γ-氯丙基-L-谷氨酸）在无水无氧条件下合成，具体为：将γ-氯丙烷-L-谷氨酸基-N-羧酸酐和无水DMF的混合物在25～50℃下放置2～6小时，然后加入Co(PMe3)4后继续在25～50℃保持24～96小时；将反应物置于空气中，聚合停止；将反应混合物在0～8℃下沉淀到甲醇中，过滤后真空干燥；得到聚（γ-氯丙基-L-谷氨酸）；
（5）聚（γ-叠氮基丙基-L-谷氨酸）的合成
将DMF，聚（γ-氯丙基-L-谷氨酸）和叠氮化钠的混合物在30～80℃搅拌12～60小时；将反应混合物粗滤，然后过中性氧化铝柱除去盐；在30～80℃下旋转蒸发除去DMF后得到浅黄色聚合物膜；将膜溶解于二氯甲烷后在甲醇中沉淀，然后过滤；真空干燥后得到聚（γ-叠氮基丙基-L-谷氨酸）；
（6）通过“点击”化学法合成聚（谷氨酸-胆碱磷酸）
在无氧条件中，将溴化铜、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺、聚（γ-叠氮基丙基-L-谷氨酸）和磷酸胆碱的混合物在20～60℃下搅拌12～60小时，然后将混合物置于空气中来停止点击反应；最后，透析，最终获得聚（谷氨酸-胆碱磷酸）；
所述的透析选用截留分子量2000的透析膜进行透析。
2.根据权利要求1所述的聚（谷氨酸-胆碱磷酸）的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中，
无水氯化钴、镁粉、三甲基膦的摩尔比为4.2：12.9：18.1；
无水氯化钴、四氢呋喃、三甲基膦溶液的比值为4.2 mmo1：10mL：18.1mL；
所述的加热活化的时间为0.5～2小时；
所述的再保持的时间为0.5小时；
所述的缓慢升温至室温并保持的时间为24小时。
3.根据权利要求1所述的聚（谷氨酸-胆碱磷酸）的制备方法，其特征在于：
步骤（2）中，
所述的将该混合物加热至60℃；
所述的继续搅拌的条件为在60℃下继续搅拌2小时；
所述的真空蒸馏的温度为30～60℃；
所述的真空下过夜的温度为40℃。
4.根据权利要求1所述的聚（谷氨酸-胆碱磷酸）的制备方法，其特征在于：
步骤（3）中，
混合物在50℃氩气保护下再搅拌2小时；
所述的真空干燥的条件为在30～80℃下真空干燥1～5小时；
所述的纯化粗产物的条件为用硅胶柱色谱法纯化粗产物，流动相为乙酸乙酯/己烷，己烷比例：100%到60%。
5.根据权利要求1所述的聚（谷氨酸-胆碱磷酸）的制备方法，其特征在于：
步骤（4）中，
所述的γ-氯丙烷-L-谷氨酸基-N-羧酸酐与Co(PMe3)4的摩尔比为40：1；
所述的放置的条件为在25℃下放置4小时；
所述的保持的时间为25℃保持72小时；
所述的沉淀的温度为4℃；
所述的真空干燥的条件为置于30～60℃中真空干燥6～24小时。
6.根据权利要求1所述的聚（谷氨酸-胆碱磷酸）的制备方法，其特征在于：
步骤（5）中，
所述的搅拌的条件为在60℃搅拌48小时；
所述的旋转蒸发的温度为60℃；
所述的真空干燥的温度为30～80℃；
步骤（6）中，
所述的搅拌的条件为在25℃下搅拌48小时。
7.一种聚（谷氨酸-胆碱磷酸），其特征在于通过权利要求1～6任一项所述的制备方法制备得到。
8.权利要求7所述的聚（谷氨酸-胆碱磷酸）在制备疫苗免疫佐剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的聚（谷氨酸-胆碱磷酸）在制备疫苗免疫佐剂中的应用，其特征在于：
所述的疫苗中，通过皮下注射进行接种，聚（谷氨酸-胆碱磷酸）与抗原的质量比为0.5～1：1。
10.根据权利要求9所述的聚（谷氨酸-胆碱磷酸）在制备疫苗免疫佐剂中的应用，其特征在于：所述的抗原为卵清蛋白。
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