CN109234299A - 一种高效表达制备乳二糖磷酸化酶的方法 - Google Patents

一种高效表达制备乳二糖磷酸化酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效表达制备乳二糖磷酸化酶的方法，是将乳二糖磷酸化酶LNBP基因与枯草芽孢杆菌用载体构建重组表达载体。然后将重组表达载体转化至枯草芽孢杆菌中构建重组工程菌。将重组工程菌在液体培养基中诱导培养，菌液离心，取上清液。本发明的方法乳二糖磷酸化酶产量高，蛋白较纯净，回收纯化容易，生产操作简单，为LNBP的工业化大规模生产提供了便利，提高了产量，省时省力，节约成本。尤其是对该酶在食品工业中的应用提供了安全保障，具有重大意义。

Description

一种高效表达制备乳二糖磷酸化酶的方法
技术领域
本发明涉及一种能高效表达乳二糖磷酸化酶的重组工程菌以及用改进高效表达制备乳二糖磷酸化酶的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
LNBP(EC2.4.1.211,lacto-N-biose phosphorylase,LNBP)是一种可逆的磷酸化酶，可以催化LNB和GNB(galacto-N-biose)产生N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和β-D-半乳糖1-磷酸(Gal 1-P)。证实双歧杆菌中具有编码代谢LNB的基因簇，其中LNB通过特定的ABC型转运蛋白转运至细胞质，通过LNBP并最终在糖酵解和氨基糖代谢途径中被代谢。双歧杆菌是婴幼儿肠道中重要的优势菌，也是人体肠道内最主要的有益菌之一，对维持婴幼儿健康发育有着极其重要的作用。乳二糖(lacto-N-biose，LNB)是母乳中寡糖的重要组成部分，也是双歧杆菌维持生命活动的重要底物，对促进双歧杆菌在婴幼儿肠道中的定植与增殖具有重要的作用。双歧杆菌可以通过乳二糖磷酸化酶来代谢LNB获得生命活性所需要的能量。此外，枯草芽孢杆菌被认为是动物肠道内的益生菌，安全性高，可应用于食品、药品等工业中，具有非致病性；外源DNA获取方便，不仅质粒可作为异源基因的克隆载体，噬菌体也可以应用于此，具有较强的遗传特性；蛋白的分泌系统较为完善，分泌的外源蛋白可跨过细胞膜直接释放到细胞外，具有较强的蛋白分泌能力，从而简化蛋白的回收和纯化过程，适用于工业化生产；在较为简单的培养基中培养，就能达到很高的菌密度，适用于工业化生产。然而现有技术中，乳二糖磷酸化酶在野生菌中提取时的产率很低，分离精制困难，不适合大批量的制备。有通过大肠杆菌表达乳二糖磷酸化酶的，但在大肠杆菌中是胞内表达，易形成包涵体，同时，酶蛋白的获取需要对细胞进行破碎处理，杂蛋白含量高，分离精制困难，操作繁琐耗时，蛋白表达量也不高。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的之一是采用基因工程技术构建一种高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体及重组工程菌。
本发明的目的之二是提供一种产量高，蛋白较纯净，回收纯化容易，生产操作简单的利用重组工程菌生产乳二糖磷酸化酶的方法。
本发明采用的技术方案是：一种高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体，所述的重组表达载体是将乳二糖磷酸化酶(LNBP)基因与表达载体连接，构建的重组表达载体；所述的表达载体是枯草芽孢杆菌用载体或大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体。
进一步的，上述的高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体，所述的表达载体是pHT系列载体、穿梭载体pMA5或穿梭载体pWB980等。但不限于这些载体，所有枯草芽孢杆菌用载体或大肠杆菌-枯草芽孢杆菌用穿梭载体均可使用。
更进一步的，上述的高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体，所述的pHT系列载体是pHT43、pHT304或pHT01载体。
进一步的，上述的高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体，所述的表达载体中含有或不含有蛋白纯化标签。
更进一步的，上述的高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体，所述的蛋白纯化标签是组氨酸(His-tag)标签。
一种高效表达乳二糖磷酸化酶的重组工程菌，是将上述的高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体转化至宿主菌中构建的重组工程菌；所述的宿主菌是枯草芽孢杆菌。
进一步的，上述的一种高效表达乳二糖磷酸化酶的重组工程菌，所述的转化为电转化。
一种高效表达制备乳二糖磷酸化酶的方法，方法如下：将上述的高效表达乳二糖磷酸化酶的重组工程菌以1-10％的接种量接种于液体培养基中，于60-200rpm培养至OD600＝0.3-1.0时，加入IPTG至终浓度为0.1-1.5mM，然后在20℃-45℃、80-220rpm条件下诱导培养6-18小时，菌液离心，取上清液，回收蛋白。
进一步的，所述的液体培养基是含有抗生素的LB液体培养基。
本发明的有益效果是：
1、本发明，采用的表达菌株是枯草芽孢杆菌，该菌株被认证为GRAS(GenerallyRecognized as Safe)，在食品工业中可安全应用。它具有很高的应用价值，其培养简单快速，具有较强的分泌蛋白质的能力、非致病性及良好的发酵基础和生产技术。LNBP在该表达系统中是细胞外分泌蛋白，且蛋白较纯净，回收纯化容易，生产操作简单且省时。
2、本发明采用基因工程技术，将乳二糖磷酸化酶(LNBP)基因与表达载体连接，构建重组表达质粒。然后，将其转化至枯草芽孢杆菌的宿主菌中，构建了一种高效表达LNBP的重组工程菌。该工程菌在液体培养基中培养后，将菌液离心，上清液即为含LNBP的酶液。其产量和生产效率明显高于同种基因在野生菌种中的表达水平，且操作简易，成本低。
3、本发明的方法乳二糖磷酸化酶产量高，蛋白较纯净，回收纯化容易，生产操作简单，为LNBP的工业化大规模生产提供了便利，提高了产量，省时省力，节约成本。尤其是对该酶在食品工业中的应用提供了安全保障，具有重大意义。
附图说明
图1是实施例1重组表达载体pHT43-LNBP的构建示意图。
图2是实施例1双酶切验证图。
图3是构建的重组表达载体pHT43-LNBP的SDS-PAGE电泳图；M:Marker；1、2:粗酶液。
图4是构建的重组表达载体pHT43-LNBP纯化后的SDS-PAGE电泳图；M:Marker；1:酶液。
具体实施方式
酶活的测定方法：用Gal 1-P的生成量来定量LNBP的活性。酶反应的底物为LNB，反应体系为0.5IU/ml GalT，2.5IU/ml PGM，2IU/ml G6PDH，20μMGlc 1，6-bP，2mM NAD+和2mMUDP-Glc在含有10mM MgCl2的50mM MOPS缓冲液(pH7.4)中，37℃反应30分钟，加热停止反应，在340nm测定吸光度，计算Gal 1-P的浓度。每分钟从LNB释放1μmol Gal 1-P的量定义为一个酶活单位(U)。比活力为每毫克酶蛋白所具有的酶活力(U/mg)。
酶活定义：一个单位的酶活力(U)定义为上述条件下产生1umol Gal1-P的酶的量。
实施例1
(一)重组表达载体pHT43-LNBP的构建
乳二糖磷酸化酶(LNBP)基因(序列如SEQ ID NO:1所示)来源于Bifidobacteriumlongum JCM 1217，经PCR扩增、纯化后与克隆载体pMD19连接，构建重组质粒pMD19-LNBP。
将重组质粒pMD19-LNBP和表达载体pHT43，分别以XbaI和BamHI为酶切位点进行双酶切，并于16℃连接过夜，获得重组表达载体pHT43-LNBP。
将重组表达载体pHT43-LNBP转化枯草芽孢杆菌WB800N，涂布含有氯霉素(5ug/mL)抗性的LB平板，37℃培养过夜，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证。如图2所示，酶切后有两条片段，大小分别为8000bp左右(表达载体PHT43)和2335bp(乳二糖磷酸化酶)即连接成功。
(二)重组工程菌
将构建的重组表达载体pHT43-LNBP采用电击转化的方法，取枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞与重组表达载体pHT43-LNBP质粒混合，加入电击杯中冰浴(1-10min)后进行电击，电击条件：22KV/cm，获得含有重组表达载体pHT43-LNBP的重组工程菌。
取含有重组表达载体pHT43-LNBP的重组工程菌，加入1ml电击恢复液，37℃100rpm孵育3h，涂布于氯霉素固体基础培养基LB平板上，12-24h可见阳性菌落。
(三)LNBP的制备与条件优化
方法：将含有重组表达载体pHT43-LNBP的重组工程菌以1％的接种量接种于含有氯霉素的LB液体培养基中，于180rpm培养至初始菌密度OD600＝0.8时，加入IPTG至终浓度为0.1-1.5mM，在20℃-45℃、120rpm条件下诱导培养6-18小时，菌液离心，上清液即为含LNBP的酶液。如表1和表2条件进行正交优化试验。
表1
水平 A(诱导时间h) B(诱导温度℃) C(IPTG浓度mM)
1 6 35 0.6
2 9 37 0.8
3 12 40 1.0
表2
由此可见，最佳的工艺条件为加入IPTG至终浓度为1mM，诱导温度为37℃、诱导培养时间为9小时。
(四)对比例
方法同(一)-(三)，不同点在于，将步骤(二)中的宿主菌枯草芽孢杆菌WB800N变更为大肠杆菌，步骤(三)，在最佳工艺条件：IPTG至终浓度为1mM，诱导温度为37℃、诱导培养时间为9小时发酵产酶。结果如表3。
表3
总蛋白 大肠 枯草
LNBP 13mg 28mg
由表3可见，采用大肠杆菌为宿主菌，LNBP的产量只有13mg，而采用枯草芽孢杆菌，LNBP的产量高达28mg。可见采用本发明的方法可以高表达乳二糖磷酸化酶。
实施例2
(一)重组表达载体pHT43-LNBP的构建
将实施例1制备的重组质粒pMD19-LNBP和表达载体pHT43，分别以XbaI和BamHI为酶切位点进行双酶切，并于16℃连接过夜，获得重组表达载体pHT43-LNBP。
将重组表达载体pHT43-LNBP转化枯草芽孢杆菌WB800，涂布含有氯霉素(5ug/mL)抗性的LB平板，37℃培养过夜，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证。如图2所示，大小分别为8000bp左右(表达载体PHT43)和2335bp(乳二糖磷酸化酶)，表示连接成功。
(二)重组工程菌
将构建的重组表达载体pHT43-LNBP采用电击转化的方法，取60ul枯草芽孢杆菌WB800电转化感受态细胞与1ul(50ng/ul)重组表达载体pHT43-LNBP质粒混合，加入电击杯中冰浴5min后进行电击，电击条件：22KV/cm，获得含有重组表达载体pHT43-LNBP的重组工程菌。
取含有重组表达载体pHT43-LNBP的重组工程菌，加入1ml电击恢复液，37℃100rpm孵育3h，涂布于氯霉素固体基础培养基LB平板上，12-24h可见阳性菌落。
(三)LNBP的制备
方法：将含有重组表达载体pHT43-LNBP的重组工程菌以5％的接种量接种于含有氯霉素的LB液体培养基中，于180rpm培养至初始菌密度OD600＝0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM，在37℃、120rpm条件下诱导培养9小时，菌液离心，上清液即为含LNBP的酶液。酶活性为13U/mL。
取酶液进行PCR验证。粗酶液的SDS-PAGE电泳图如图3所示，经纯化后结果如图4所示，均出现86kDa的LNBP目的条带。
实施例3
(一)重组表达载体pMA5-LNBP的构建
将实施例1制备的重组质粒pMD19-LNBP和穿梭载体pMA5，分别以XbaI和BamHI为酶切位点进行双酶切，并于16℃连接过夜，获得重组表达载体pMA5-LNBP。
将重组表达载体pMA5-LNBP转化枯草芽孢杆菌168，涂布含有氨苄青霉素(100ug/mL)抗性的LB平板，37℃培养过夜，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证，经验证构建成功。
(二)重组工程菌
将构建的重组表达载体pMA5-LNBP采用电击转化的方法，枯草芽孢杆菌168电转化感受态细胞与重组表达载体pMA5-LNBP质粒混合，加入电击杯中冰浴5min后进行电击，电击条件：22KV/cm，获得含有重组表达载体pMA5-LNBP的重组工程菌。
取含有重组表达载体pMA5-LNBP的重组工程菌，加入1ml电击恢复液，37℃100rpm孵育3h，涂布于氨苄青霉素固体基础培养基LB平板上，12-24h可见阳性菌落。
(三)LNBP的制备
方法：将含有重组表达载体pMA5-LNBP的重组工程菌以3％的接种量接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，于180rpm培养至初始菌密度OD600＝0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM，在37℃、120rpm条件下诱导培养9小时，菌液离心，上清液即为含LNBP的酶液。酶活性为10U/mL。
实施例4
(一)重组表达载体pHT43-LNBP的构建
将实施例1制备的重组质粒pMD19-LNBP和表达载体pHT43，分别以XbaI和BamHI为酶切位点进行双酶切，并于16℃连接过夜，获得重组表达载体pHT43-LNBP。
将重组表达载体pHT43-LNBP转化枯草芽孢杆菌WB600N，涂布含有氯霉素(5ug/mL)抗性的LB平板，37℃培养过夜，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证，经验证连接成功。
(二)重组工程菌
将构建的重组表达载体pHT43-LNBP采用电击转化的方法，取60ul枯草芽孢杆菌WB600N电转化感受态细胞与1ul(50ng/ul)重组表达载体pHT43-LNBP质粒混合，加入电击杯中冰浴5min后进行电击，电击条件：22KV/cm，获得含有重组表达载体pHT43-LNBP的重组工程菌。
取含有重组表达载体pHT43-LNBP的重组工程菌，加入1ml电击恢复液，37℃100rpm孵育3h，涂布于氯霉素固体基础培养基LB平板上，12-24h可见阳性菌落。
(三)LNBP的制备
方法：将含有重组表达载体pHT43-LNBP的重组工程菌以10％的接种量接种于含有氯霉素的LB液体培养基中，于180rpm培养至初始菌密度OD600＝0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM，在37℃、120rpm条件下诱导培养9小时，菌液离心，上清液即为含LNBP的酶液。酶活性为11U/mL。
实施例5
(一)重组表达载体pWB980-LNBP的构建
将实施例1制备的重组质粒pMD19-LNBP和穿梭载体pWB980，分别以XbaI和BamHI为酶切位点进行双酶切，并于16℃连接过夜，获得重组表达载体pWB980-LNBP。
将重组表达载体pWB980-LNBP转化枯草芽孢杆菌WB600，涂布含有卡那霉素(50ug/mL)抗性的LB平板，37℃培养过夜，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证，经验证连接成功。
(二)重组工程菌
将构建的重组表达载体pWB980-LNBP采用电击转化的方法，枯草芽孢杆菌WB600电转化感受态细胞与重组表达载体pWB980-LNBP质粒混合，加入电击杯中冰浴5min后进行电击，电击条件：22KV/cm,获得含有重组表达载体pWB980-LNBP的重组工程菌。
取含有重组表达载体pWB980-LNBP的重组工程菌，加入1ml电击恢复液，37℃100rpm孵育3h，涂布于卡那霉素固体基础培养基LB平板上，12-24h可见阳性菌落。
(三)LNBP的制备
方法：将含有重组表达载体pWB980-LNBP的重组工程菌以1％的接种量接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，于180rpm培养至初始菌密度OD600＝0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM，在37℃、120rpm条件下诱导培养9小时，菌液离心，上清液即为含LNBP的酶液。酶活性为11U/mL。
序列表
<110> 沈阳农业大学
<120> 一种高效表达制备乳二糖磷酸化酶的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2335
<212> DNA
<213> 乳二糖磷酸化酶基因(EC2.4.1.211,lacto-N-biose phosphorylase,LNBPAB181926)
<400> 1
tgtcctcaaa ggagagacta tgactagcac cggccgcttc accttgccta gcgaggagaa 60
ttttgcggag aagaccaagg agcttgccga actgtgggga gcagacgcca ttcgtaactc 120
cgatggcacg catctggatg aggctgtgct tgccttgggc aagaagattt acaatgcgta 180
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tggcggcggc gcgttcgtgg gcgtgggcga gccgagctcg gcaccgcgct tccaaacggg 1680
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ggtggacaag tatttcccgc cggtggtgcc ggaccacttc atcaccgccg atgtgccggt 1800
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cggcggcggc cagtccatca agccgttggg cggcatcgat ttcggcgaac ccgtgctcaa 1920
cacgtatccg gtcaatgaaa acgtgaccct gctgcgcgcg gacggcggcc aggtacagct 1980
cgcgaccaac gattatggca agggccgcgg cgtgtacatc tccggcctgc cctattcggc 2040
ggccaacgcc cgactgctgg aacgcgtgct gttctacgct tcccacaacg aagacaagta 2100
tgcggcctgg agctcgtcca atccggaatg cgaagtggca cacttccccg agcaagggct 2160
gtattgcgta atcaacaaca ccgatcagcc gcagaagacc acggtgactt tggccgacgg 2220
caccaccgag gacttcgacc tgcctgacag cggtatcgcc tggcgtgaag cctgatccca 2280
cgttttggag aacggaccca tcatgaccga aagcaatgaa gttttattcg gcata 2335

Claims (9)

1.一种高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体是将乳二糖磷酸化酶基因与表达载体连接，构建的重组表达载体；所述的表达载体是枯草芽孢杆菌用载体或大肠杆菌-枯草芽孢杆菌用穿梭载体。
2.根据权利要求1所述的高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体是pHT系列载体、穿梭载体pMA5或穿梭载体pWB980。
3.根据权利要求1所述的高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体，其特征在于，所述的pHT系列载体是pHT43、pHT304或pHT01载体。
4.根据权利要求1所述的高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体是含有或不含有蛋白纯化标签。
5.根据权利要求4所述的高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体，其特征在于，所述的蛋白纯化标签是组氨酸(His-tag)标签。
6.一种高效表达乳二糖磷酸化酶的重组工程菌，其特征在于，是将权利要求1-5任一项所述的高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体转化至宿主菌中构建的重组工程菌；所述的宿主菌是枯草芽孢杆菌。
7.根据权利要求6所述的高效表达乳二糖磷酸化酶的重组工程菌，其特征在于，所述的转化为电转化。
8.一种高效表达乳二糖磷酸化酶的方法，其特征在于，方法如下：将权利要求6或7所述的高效表达乳二糖磷酸化酶的重组工程菌以1-10％的接种量接种于液体培养基中，于60-200rpm培养至OD600＝0.3-1.0时，加入IPTG至终浓度为0.1-1.5mM，然后在20-45℃、80-220rpm条件下诱导培养6-18小时，菌液离心，取上清液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的液体培养基是含有抗生素的液体培养基。
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