CN109234273B - 用于极限糊精酶基因克隆的引物、试剂盒及克隆方法 - Google Patents

用于极限糊精酶基因克隆的引物、试剂盒及克隆方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种用于极限糊精酶基因克隆的引物、试剂盒及克隆方法，属于基因克隆技术领域，能够解决目前麦芽RNA提取较为困难，步骤繁琐复杂，而导致RNA纯度与质量不高，无法得到全长极限糊精酶基因的问题。该技术方案包括根据极限糊精酶基因序列设计五段基因序列，针对其中四段基因序列LD‑2、LD‑3、LD‑4、LD‑5设计上下游特异性引物，利用上下游引物克隆极限糊精酶基因，包括：极限糊精酶基因片段合成、重叠延伸PCR、全长基因的获得。本发明原理简单，操作简便，有效解决了大麦长片段目的基因难以扩增的难题；且该方法对麦芽RNA的纯度和产量要求较低；极限糊精酶的基因克隆及其N端序列优化为异源表达以及酶学性质研究奠定基础。

Description

用于极限糊精酶基因克隆的引物、试剂盒及克隆方法
技术领域
本发明属于基因克隆技术领域，特别涉及用于极限糊精酶基因克隆的引物、试剂盒及克隆方法。
背景技术
获取真核生物的目的基因，必须通过提取RNA，利用逆转录PC(RT-PCR)扩增目的基因产物，基因片段较小的目的基因容易应用RT-PCR获得，而长片段基因的获得难度很大，要求提取的RNA必须含有全长的目的基因片段且反转录出的cDNA完整，另外要求PCR酶既能扩增长片段又能有足够高的保真性，因此从真核生物中获得长片段目的基因成为一个难点。
麦芽胚乳中含有大量的淀粉和多酚等物质，造成提取的RNA易降解、易被污染，同时，总RNA与淀粉等物质共沉淀造成低质量和产量等问题。因此在利用RT-PCR扩增麦芽长片段目的基因时，容易造成非特异性扩增，导致无法获得长片段目的基因。
大麦淀粉是由α-淀粉酶、β-淀粉酶、极限糊精酶(Limit dextrinase，LD)和α-葡萄糖苷酶协同作用下水解。大麦中70％的淀粉为支链淀粉，因此极限糊精酶是淀粉水解的限速酶。由于极限糊精酶表达量低且大部分以和蛋白类抑制因子结合的无活性形式存在，导致其含量较低，从而影响麦芽中淀粉水解速率，降低糖化效率。为提高糖化过程中极限糊精酶的活力，获取其全长基因是进行基因研究的首要一步。极限糊精酶基因在2800bp左右，国外文献报道(Svensson et al，2011)的极限糊精酶序列是通过建立基因文库、杂交筛选获得极限糊精酶的cDNA，并以此为模板通过RT-PCR一步扩增获得极限糊精酶序列，步骤繁琐复杂。
发明内容
本发明针对针对目前麦芽RNA提取较为困难，步骤繁琐复杂，而导致RNA纯度与质量不高，无法得到全长极限糊精酶基因的问题，本发明通过分段扩增、融合拼接，建立一套从麦芽中克隆极限糊精酶基因的方法。
为了达到上述目的，本发明提出一种用于极限糊精酶基因克隆的引物，根据极限糊精酶基因序列设计五段基因序列，针对其中四段基因序列LD-2、LD-3、LD-4、LD-5设计上下游特异性引物，具体包括：
Figure BDA0001830735780000021
作为优选，所述五段基因序列还包括LD-1基因序列，针对LD-1基因序列的N端进行偏爱性设计，得到SEQ ID NO.1引物序列。
本发明还提出一种包含上述技术方案所述的用于极限糊精酶基因克隆的引物的试剂盒。
本发明还提出一种利用上述技术方案所述的引物克隆极限糊精酶基因的方法，包括以下步骤：
极限糊精酶基因片段合成：通过PCR扩增获得LD-2、LD-3、LD-4、LD-5的DNA片段；
重叠延伸PCR：包括一次重叠延伸PCR和二次重叠延伸PCR，具体为：
所述一次重叠延伸PCR中，将所述LD-2和LD-3的DNA片段以及LD-4和LD-5的DNA片段分别等量混合进行重叠延伸PCR扩增，得到LD-2&3和LD-4&5的DNA产物片段；
所述二次重叠延伸PCR中，将LD-2&3和LD-4&5的DNA产物片段等量混合进行重叠延伸PCR扩增，获得LD-2&3&4&5的DNA产物片段；
全长基因的获得：利用所述SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.9为引物，以LD-2&3&4&5的DNA产物片段为模板扩增得到全长基因。
作为优选，所述极限糊精酶基因片段合成过程中PCR扩增反应体系为:
10×Pfx Amplification Buffer 5μL，10mM dNTP mixture 1.5μL,50mM MgSO4 1μL，primers mix 1.5μL，Template DNA 5μL，DNA Polymerase 0.4μL，补足双蒸水使总体积为50μL。
作为优选，所述极限糊精酶基因片段合成过程中PCR扩增程序为:
95℃预变性10min；94℃for 15s，68℃for 1min per kb，循环30次，最后4℃保温。
作为优选，所述重叠延伸PCR反应体系为：
Amplification Buffer 5μL，10mM dNTP mixture 1.5μL,50mM MgSO4 1μL，Template DNA 5μL，DNA Polymerase 0.4μL，补足双蒸水使总体积为50μL。
作为优选，所述重叠延伸PCR扩增程序为：
95℃预变性10min；94℃15s，50℃1min，68℃2min，循环5次后，添加融合引物混合物共1.5μL后，94℃15s，68℃2min，反应30个循环，4℃保温。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1、本发明原理简单，操作简便；通过本发明的方法进行分片段扩增，然后融合连接的方式可有效解决大麦长片段目的基因难以扩增的难题。
2、该方法对麦芽RNA的纯度和产量要求较低，为RNA纯度和产量较低的情况下扩增长片段基因提供可能；可有效解决其N端密码子偏好性问题，有利于异源表达。
3、极限糊精酶是大麦降解限速酶，其基因的克隆及其N端序列优化为异源表达以及酶学性质研究奠定基础。
附图说明
附图1为本发明极限糊精酶扩增路线图；
附图2为极限糊精酶分段序列PCR扩增凝胶电泳图；
附图3为LD2&3及LD4&5PCR扩增凝胶电泳图；
附图4为LD2&3&4&5PCR产物凝胶电泳图；
附图5 SEQ ID NO1序列比对图；
附图6极限糊精酶序列比对图；
附图7为内参基因扩增电泳图；
附图8为极限糊精酶基因扩增电泳图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：麦芽中极限糊精酶的克隆
1)麦芽RNA提取及反转录
将滤纸放在培养皿中，并用蒸馏水湿润滤纸制备发芽床。取澳麦Baudin大麦种子100粒均匀的放在滤纸内，18℃下发芽五天。去发芽后的麦芽在液氮中迅速研磨成粉末，然后按照TIANGEN公司RNAprep pure Plant Kit试剂盒的使用说明提取麦芽RNA，并-80℃保存。以提取的RAN为模板，按照TaKaRa公司PrimeScript RT-PCR Kit试剂盒的使用说明进行反转录，获取麦芽cDNA，并以此cDNA为极限糊精酶扩增的模板。
2)极限糊精酶分段扩增
首先分4段扩增，引物组合分别为：SEQ ID NO.2/SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4/SEQID NO.5、SEQ ID NO.6/SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9，分别进行平行PCR，获得DNA片段LD-2、LD-3、LD-4、LD-5；反应体系：采用50μL PCR反应体系：10×PfxAmplification Bufferion Buffer 5μL，10mM dNTP mixture 1.5μL，50mM MgSO4 1μL，primers mix 1.5μL，Template DNA 5μL，
Figure BDA0001830735780000041
Pfx DNA Polymerase 0.4μL，补足双蒸水使总体积为50μL；扩增程序：95℃预变性10min；94℃for 15s，68℃for 1min per kb，循环30次，最后4℃保温；分别得到长度分别为600bp左右的四个PCR产物(如图2所示)，分别命名为LD2，LD3，LD4，LD5。
3)重叠延伸PCR反应
一次重叠延伸PCR：利用OMEGA中Gel Extraction Kit试剂盒说明书纯化回收各个片段。然后片段LD-2和LD-3进行重叠延伸PCR扩增，片段LD-4和LD-5进行重叠延伸PCR扩增。反应程序：10×Pfx Amplification Bufferion Buffer 5μL，10mM dNTP mixture 1.5μL，50mM MgSO4 1μL，Template DNA(两个片段等比例混合)5μL，
Figure BDA0001830735780000052
PfxDNAPolymerase 0.4μL，补足双蒸水使总体积为50μL。95℃预变性10min；94℃15s，50℃1min，68℃2min，循环5次后，LD2&3的融合使用引物SEQ ID NO.2/SEQ ID NO.5，LD4&5的融合使用引物SEQ ID NO.6/SEQ ID NO.9引物，添加引物混合物1.5μL后，94℃，15s，68℃2min，反应30个循环，4℃保温；得到1200bp左右的两个片段(命名LD2&3及LD4&5)，如图3所示。测序LD2&3及LD4&5发现，LD2&3片段长1160bp，序列比对后发现其与Hordeum vμlgarelimit dextrinase mRNA(GenBank：AF252635.1，333bp-1492bp)相似性高达99％，表明LD2&3为极限糊精酶基因部分序列。LD4&5片段长1256bp，序列比对后发现其与Hordeum vμlgarelimit dextrinase mRNA(GenBank：AF252635.1，1463bp-2718bp)相似性高达100％，表明LD4&5为极限糊精酶基因部分序列。
二次重叠延伸PCR：利用OMEGA中Gel Extraction Kit试剂盒说明书纯化回收第一次重叠延伸PCR的产物(LD2&3，LD4&5)，然后进行二次重叠延伸PCR程序，反应步骤及程序如上：10×Pfx Amplification Bufferion Buffer 5μL，10mM dNTP mixture 1.5μL，50mMMgSO4 1μL，Template DNA(两个片段等比例混合)5μL，
Figure BDA0001830735780000051
Pfx DNA Polymerase0.4μL，补足双蒸水使总体积为50μL。95℃预变性10min；94℃for 15s，50℃1min，68℃4min，循环5次后，添加SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.9混合物共1.5μL后，94℃15s，68℃4min，反应30个循环，4℃保温；琼脂糖凝胶电泳结果(如图4所示)显示在2500bp左右有PCR条带，大小与目的条带一致(命名为LD2&3&4&5)。
PCR产物序列测定及分析：利用OMEGA中Gel Extraction Kit试剂盒说明书纯化回收二次重叠延伸PCR程序的产物(2500bp)，并以此为模板，利用引物SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.9扩增末端带A的LD2&3&4&5产物，反应体系为：10×AccuPrimeTMPCR Buffer I 5μL，Sense primer(10μM)1μL，Anti-sense primer(10μM)1μL，Template DNA 1μL，AccuPrimeTMTaq High Fidelity 0.2μL，补足双蒸水使总体积为50μL。反应程序为：94℃for15s，50℃1min，68℃4min，循环30次，68℃10min，4℃保温。回收产物后转化pMD18-T载体，测序表明LD2&3&4&5长度为2386bp，Blast比对结果发现其与Hordeum vμlgare limitdextrinase mRNA(GenBank:AF252635.1；333-2718bp)相似性高达99％，表明为LD2&3&4&5为极限糊精酶序列。
4)全长基因的获得
密码子偏爱性在原核基因表达中已经被证实是一个很重要的影响因素，尤其是N端序列，因此根据原核表达系统的密码子的偏爱性设计N端序列，利用SEQ ID NO.1和SEQID NO.9为引物，以LD-2&3&4&5为模板扩增得到全长基因；所述SEQ ID NO.1来源于目的基因序列，与目的基因序列相比，119个氨基酸密码子中，70个氨基酸密码子突变成大肠杆菌的偏爱密码子(如图5所示)。
N端序列对基因表达非常重要，因此依据GenBank序列(AF252635.1)设计N端357bp序列LD1(SEQ ID NO.1)并以该序列和SEQ ID NO.9为引物，以含有LD2&3&4&5片段的pMD18-T载体为模板，扩增极限糊精酶全长序列，将获得的PCR产物(命名为LDhsm)测序。结果极限糊精酶基因(LDhsm)长度为2718bp，编码905个氨基酸。Blastn比对发现其与Hordeum vμlgare limit dextrinase mRNA(GenBank:AF252635.1；34-2718bp)相似性高达97％，氨基酸序列与AF252635.1基因的氨基酸仅有六个氨基酸的差别(如图6所示)。
对比例1：常规方法克隆极限糊精酶基因
根据GenBank公布的极限糊精酶序列(GenBank:AF022725.1)设计极限糊精酶正向和反向引物如下：
SEQ ID NO.10：atacaaaatg ccaatgccga tgcgaacga 29
SEQ ID NO.11：tcaacaccga ggttcgacaa agactgaca 29
提取发芽五天的麦芽RNA，并反转录获得麦芽cDNA，为了验证麦芽cDNA的正确性，利用内参基因Actin进行验证，结果四个麦芽cDNA均能扩增出350bp左右的内参基因(如图7所示)，表明麦芽cDNA正确。
以cDNA为模板，利用SEQ ID NO.10/SEQ ID NO.11引物扩增极限糊精酶序列，结果在1300bp左右发现一条带(如图8所示)，将PCR产物进行测序，序列比对发现其不是极限糊精酶序列，是非特异性扩增产物，表明利用常规方法无法进一步扩增得到极限糊精酶序列。
Figure BDA0001830735780000081
Figure BDA0001830735780000091
Figure BDA0001830735780000101
序列表
<110> 青岛啤酒股份有限公司
<120> 用于极限糊精酶基因克隆的引物、试剂盒及克隆方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcggttg gcgaaacggg cgcaagtgtg agtgcagcgg aagcggaagc ggaagcgacc 60
caggcgttca tgccggatgc tcgtgcctat tgggtgacca gcgatctgat tgcctggaat 120
gtgggtgaac tggaagccca gtctgtttgc ctgtatgcga gccgtgcggc ggcgatgagt 180
ctgtccccgt caaacggcgg tattcagggt tacgattcca aagtcgaact gcaaccggaa 240
tcagcgggcc tgccggaaac cgtgacgcaa aagtttccgt tcatcagctc ttatcgtgct 300
tttcgcgtcc cgagttccgt tgatgtcgcg agccttgtga aatgccaact ggtcgtc 357
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccttgtgaaa tgccaactgg tcgtcg 26
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccactgtgcc atcgtgggcg ctaaaa 26
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttttagcgcc cacgatggca cagtggacag 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tatggcccat aagatcaaat ctgaacccgt 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgggttcag atttgatctt atgggccata 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cttagtatct cgtcaccagc gtggaagaag 30
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cttcttccac gctggtgacg agatacta 28
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcatccatct gccagtagca ccaagc 26

Claims (6)

1.用于极限糊精酶基因克隆的试剂盒，其特征在于，包括根据极限糊精酶基因序列设计的五段基因序列，具体为：
LD-1基因序列，针对LD-1基因序列的N端进行偏爱性设计，得到SEQ ID NO.1引物序列；
针对四段基因序列LD-2、LD-3、LD-4、LD-5设计的上下游特异性引物为：
Figure FDA0002520099590000011
2.利用权利要求1所述的试剂盒克隆极限糊精酶基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
极限糊精酶基因片段合成：通过PCR扩增获得LD-2、LD-3、LD-4、LD-5的DNA片段；
重叠延伸PCR：包括一次重叠延伸PCR和二次重叠延伸PCR，具体为：
所述一次重叠延伸PCR中，将所述LD-2和LD-3的DNA片段以及LD-4和LD-5的DNA片段分别等量混合进行重叠延伸PCR扩增，得到LD-2&3和LD-4&5的DNA产物片段；
所述二次重叠延伸PCR中，将LD-2&3和LD-4&5的DNA产物片段等量混合进行重叠延伸PCR扩增，获得LD-2&3&4&5的DNA产物片段；
全长基因的获得：利用所述SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.9为引物，以LD-2&3&4&5的DNA产物片段为模板扩增得到全长基因。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述极限糊精酶基因片段合成过程中PCR扩增反应体系为:
10×Pfx Amplification Buffer 5μL，10mM dNTP mixture 1.5μL,50mM MgSO4 1μL，primers mix 1.5μL，Template DNA 5μL，DNA Polymerase 0.4μL，补足双蒸水使总体积为50μL。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述极限糊精酶基因片段合成过程中PCR扩增程序为:
95℃预变性10min；94℃for 15s，68℃for 1min per kb，循环30次，最后4℃保温。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重叠延伸PCR反应体系为：
Amplification Buffer 5μL，10mM dNTP mixture 1.5μL,50mM MgSO4 1μL，TemplateDNA 5μL，DNA Polymerase 0.4μL，补足双蒸水使总体积为50μL。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重叠延伸PCR扩增程序为：
95℃预变性10min；94℃15s，50℃1min，68℃2min，循环5次后，添加融合引物混合物共1.5μL后，94℃15s，68℃2min，反应30个循环，4℃保温。
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