CN109200062A - 蚕蛾头部多肽混合物在制备治疗糖尿病口服药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蚕蛾头部多肽类物质在制备治疗糖尿病口服药物中的应用。从昆虫家蚕蚕蛾头部提取分离多肽类物质，该多肽混合物的分子量在1KD‑10KD范围。动物实验证明通过口服给予该多肽混合物能够有效降低链脲佐菌素诱导的糖尿病模型C57/BL小鼠的血糖。
Description
技术领域
本发明涉及对糖尿病具有治疗作用的中药有效部位,属于中医中药领域。
背景技术
近年来，糖尿病的发病率呈逐年上升的趋势，已对人类健康构成严重危胁。目前临床治疗糖尿病最有效的药物当属胰岛素，但其长期注射给药对患者带来诸多不便与痛苦。口服胰岛素的好处不止可以缓解病情，还可以使患者在患病早期就能开始接受治疗，减轻一些并发症如失明和因愈合受损导致的截肢。因此，口服胰岛素制剂的研发，已成为药物研究领域倍受瞩目的热点。但由于多肽经口服给药，通过胃肠道均已破坏，不能有效发挥生物学功能。当前国内外胰岛素口服制剂主要通过改变剂型，使胰岛素在口腔粘膜内释放或在肠道内释放吸收。虽然经过多年研究，但临床应用实验均以失败而告终。而这方面的研发投入一直没有间断过。
在中医学中家蚕一直被认为具有抗糖尿病作用。当前家蚕抗糖尿病药开发与研究重点在家蚕的幼虫及蚕蛹，而成蛾后开发较少。蚕蛾头部含有丰富的多肽类物质，这些物质在调控蚕蛾机体发育与代谢中发挥重要作用。这些肽类物质对人类疾病是否具有治疗作用特别是在抗糖尿病方面，未见研究报道与专利发明。本发明通过从家蚕雄蚕蛾头部分离多肽类物质通过口服给药具有降低糖尿病小鼠血糖的作用，开发一种新型口服抗糖尿病的肽类药物。
发明内容
本发明提供的是一种动物提取物的新的医药用途,即家蚕雄蚕蛾头部分离多肽类物质在制备治疗糖尿病药物中的应用。所述多肽类物质特征为蛋白分子量为1KD-10KD,水溶性，耐酸、耐热。本发明所述的药物可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等口服剂型,也可以是注射剂等非口服剂型。另外本发明所述的蚕蛾头部多肽类物质可以与其他药物包括化学药、中药以及天然药物组成复方药物用于糖尿病的治疗。与现有抗糖尿病物质相比，本发明的最大创新是从蚕蛾头部分离出能够通过口服给药的抗糖尿病的多肽类物质。
本发明采取技术方案如下：
（1）获取活的雄蚕蛾（未交尾），剪取头部并称重。
（2）蚕蛾头部多肽混合物初次提取，主要通过盐析、丙酮沉淀、苦味酸沉淀等过程，具体见实施方案。
（3）多肽混合物二次分离
应用蛋白纯化离心柱截取混合物种中不同蛋白组分，分为1KD以下，1-10KD，以及10KD以上蛋白成分。
（4）制备小鼠糖尿病模型，口服给予不同组分蛋白药物，观察降糖效果。
实施方案：
以下通过具体实施例来进一步说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实例1
一、实验实施具体流程
（一）蚕蛾头部多肽混合物初次提取
1.获取活雄蚕蛾（未交尾）10000头，剪取头部，称重。按50g加入200ml丙酮，应用组织匀浆器进行组织匀浆，过滤去除丙酮，取沉淀。沉淀中加入乙醇，混匀，过滤去除乙醇，取沉淀。沉淀低温干燥。
2.沉淀溶于2%氯化钠，-80℃冻存。24小时后，37℃水浴解冻，离心，取上清4℃保存，沉淀重新加入2%氯化钠，-80℃冻存。在重复上述步骤二次，获取三次上清混合，滤纸过滤，去掉沉渣。
3.上清置于沸水浴中，作用4分钟后，迅速冷却后，离心，弃沉淀，取上清。
4.上清加入硫酸铵，使其饱和度为80%，4℃搅拌12小时后，离心，取沉淀，弃上清。
5.沉淀加入75%丙酮，离心，取沉淀，弃上清。
6.沉淀加入90%苦味酸，离心，取沉淀，弃上清。
7.沉淀加入75%丙酮，离心，取沉淀，弃上清。
8.沉淀干燥后，称重，用0.1M PBS溶解。为多肽混合物初提物。
（二）多肽混合物二次分离纯化。
1.初提物应用蛋白定量试剂盒进行定量，应用聚丙烯凝胶电泳观察蛋白产物大小。
2.根据定量调整初提物的含量为1mg/ml，先用截留分子量为10KD蛋白纯化离心管进行蛋白浓缩，分别收集浓缩管内与管外蛋白，再用截留分子量为1KD蛋白纯化离心管进行蛋白浓缩分别收集浓缩管内与管外蛋白。分别获取分子量10KD以上，1KD-10KD以及1KD以下多肽物质。
3.分离纯化的蛋白应用蛋白定量试剂盒进行定量，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳观察蛋白产物大小。
（三）制备小鼠糖尿病模型，口服给予不同组分蛋白药物，观察降糖效果。
1.C57/BL雄鼠（20g左右) 12只，其中9只应用链脲佐菌素小剂量多次注射制备小鼠糖尿病模型。
2.糖尿病小鼠分成三组：10KD以上给药组（单剂量）、1KD-10KD给药组（单剂量），未给药组。通过灌胃给药。
3.连续给药21天，期间每7天测定血糖变化。
二、实施效果：
（一）蚕蛾头部多肽混合物初次提取物
1.提取多肽混合物获得量
取5000头雄蚕蛾头部，称重1572克，经过上述步骤提取获取多肽混合物初次提取物干燥产物为3.24克。应用PBS缓冲液溶解后，应用蛋白紫外定量，测定总含量为1.96g。
（二）多肽混合物二次分离纯化
1.分离纯化后各组分含量
上述多肽混合物应用不同截留分子量蛋白离心管分离纯化后应用紫外定量分别为10KD以上1.023g，1KD-10KD为0.231g，1KD以下为0.082g。
2.分离纯化后电泳结果.
应用聚丙烯酰胺凝胶电泳分别检测初提物、纯化后10KD以上与1KD-10KD蛋白。附图1显示提取不同蛋白组分电泳结果，从左到右分别为初提物、10KD以上产物、1KD-10KD产物、人胰岛素与蛋白Marker。各产物蛋白组分各异，表明分离成功。
（三）多肽类混合物对糖尿病小鼠降糖效果
链脲佐菌素多次注射诱导的糖尿病小鼠模型，给予多肽类混合物后第一周血糖明显下降，在第三周血糖已下降到正常值。其中1KD-10KD在第二周达到正常血糖水平，其降糖效果优于10KD以上多肽类混合物。
表1.糖尿病小鼠模型给予口服多肽类混合物后测定血糖结果
注：给药1组为给予10KD以上提取物；给药2组为给予1KD-10KD提取物。
*：与模型组相比P＜0.05；#：与给药2组相比P＜0.05，%：与第一次给药相比P＜0.05。
附图说明
图1是蚕蛾头部提取的初提物、纯化后10KD以上与1KD-10KD蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
Claims (4)
1.蚕蛾头部多肽混合物在制备治疗糖尿病口服药物中的应用。
2.权利要求1所述的蚕蛾头部多肽混合物其特征是来源于家蚕雄蚕蛾头部分离提取的，分子量在1KD-10KD范围的多肽化合物，是水溶性的。
3.权利要求1所述的蚕蛾头部多肽混合物其特征是具有口服给药达到抗糖尿病功效。
4.蚕蛾头部多肽混合物可与其他化学药、中药以及天然药物组成口服的抗糖尿病复方药物。
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