CN109172567A - 马索亚内酯在制备预防和/或治疗自身免疫疾病药物或保健品方面的应用 - Google Patents

马索亚内酯在制备预防和/或治疗自身免疫疾病药物或保健品方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药及保健品领域，具体涉及马索亚内酯在制备预防和/或治疗自身免疫疾病药物或者保健品方面的应用，马索亚内酯可通过抑制或减弱T淋巴细胞介导的免疫应答和/或体液免疫应答，抑制或减弱自身免疫引起的免疫应答，预防和/或治疗自身免疫疾病。马索亚内酯可用于制备预防和/或治疗自身免疫疾病的药物，低毒、高效、价廉，为自身免疫疾病提供新的治疗药物。

Description

马索亚内酯在制备预防和/或治疗自身免疫疾病药物或保健 品方面的应用
技术领域
本发明属于医药及保健品领域，具体涉及马索亚内酯在制备预防和/或治疗自身免疫疾病药物或保健品方面的应用。
背景技术
马索亚内酯(Massoialactone，C-10ML)中文名称为5,6-二氢-6-戊基-2H-吡喃-2-酮(结构见式Ⅰ)，具有抗菌、抗感染、免疫调节作用。
免疫系统作为机体抵御外界侵害的天然屏障，可以识别并消灭病毒、细菌等病原体，防止严重的感染和疾病。若免疫系统功能紊乱，视自身的损伤组织或细胞为外来“入侵者”，产生的抗体或免疫细胞攻击自身的正常组织或细胞，继而诱发炎症和强烈的免疫应答，造成一系列自身免疫性疾病(Autoimmune diseases)。
自身免疫疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。常见的自身免疫疾病有类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)、系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)、多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)、银屑病(Psoriasis)等。这类疾病的病理发生机制复杂，涉及多种免疫和炎症细胞，严重危害人群的身体健康和生活质量，给我国经济也造成巨大的负担。由于自身免疫疾病的发病机制尚不明确，至今对于该类疾病的治疗问题尚未解决，现代医学对其尚无有效疗法。
目前，自身免疫疾病的临床治疗药物包含非甾体抗炎药(NSAIDs)、糖皮质激素、生物制剂等。这些药物不仅价格较为昂贵，而且多具有程度不同的毒副作用，如骨髓抑制、肝肾损伤、肠胃道不适等而难以长期使用。因此，研究和开发高效、低毒、价廉的自身免疫疾病治疗药物或保健品，尤其是类风湿性关节炎治疗药物或保健品具有重要的科学意义和应用价值。
发明内容
本发明旨在提供马索亚内酯在制备预防和/或治疗自身免疫疾病药物或保健品方面的应用，马索亚内酯可通过抑制或减弱T淋巴细胞介导的免疫应答和/或体液免疫应答，抑制或减弱自身免疫引起的免疫应答，预防和/或治疗自身免疫疾病，尤其用于T淋巴细胞介导的自身免疫疾病。
马索亚内酯可通过抑制抗原递呈、和/或抑制淋巴细胞增殖和/或活化、和/或抑制淋巴因子表达，抑制或减弱T淋巴细胞介导的免疫应答。马索亚内酯还可通过抑制淋巴因子表达，降低抗原递呈细胞活性，进而抑制抗原递呈。马索亚内酯还可通过抑制抗原递呈细胞活性、和/或抑制淋巴因子表达、和/或抑制信号传导及转录激活因子表达，抑制淋巴细胞增殖和/或活化。马索亚内酯还可通过抑制淋巴细胞增殖和/或活化、和/或抑制抗原递呈细胞活性，抑制淋巴因子表达。
马索亚内酯还可通过抑制抗原递呈、和/或免疫球蛋白释放，抑制或减弱体液免疫应答。
马索亚内酯通过对T淋巴细胞介导的细胞免疫应答和/或体液免疫应答的抑制或减弱，抑制或减弱自身免疫引起的免疫反应，可用于制备预防和/或治疗自身免疫疾病的药物或保健品，尤其适用于制备预防和/或治疗T淋巴细胞介导的自身免疫疾病药物或保健品，如预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物或保健品。
本发明提供马索亚内酯在制备预防和/或治疗自身免疫疾病药物或保健品方面的应用。具体的，所述马索亚内酯作为抑制或减弱T淋巴细胞介导的细胞免疫应答活性成分、和/或抑制或减弱体液免疫应答活性成分。
马索亚内酯通过抑制抗原递呈、和/或抑制淋巴细胞增殖和/或活化、和/或抑制淋巴因子表达，抑制或减弱T淋巴细胞介导的免疫应答。
马索亚内酯通过抑制淋巴因子表达，降低抗原递呈细胞活性，进而抑制抗原递呈。所述淋巴因子为IL-1α和IL-1β，所述抗原递呈细胞为单核-巨噬细胞。
马索亚内酯通过抑制抗原递呈细胞活性、和/或抑制淋巴因子表达、和/或抑制信号传导及转录激活因子表达，抑制淋巴细胞增殖和/或活化。所述抗原递呈细胞为单核-巨噬细胞，所述淋巴因子包括IL-2、和/或IFN-γ、和/或IL-6、和/或IL-12a、和/或IL-12b，所述信号传导及转录激活因子为Stat1、和/或Stat4、和/或p-Stat1。
马索亚内酯通过抑制淋巴细胞增殖和/或活化、和/或抑制抗原递呈细胞活性，抑制淋巴因子表达。所述抗原递呈细胞为单核-巨噬细胞。所述淋巴因子包括IL-1α、和/或IL-1β、和/或IL-2、和/或IFN-γ、和/或IL-6、和/或IL-12a、和/或IL-12b。
马索亚内酯通过抑制抗原递呈、和/或免疫球蛋白释放，抑制或减弱体液免疫应答。所述免疫球蛋白为IgG。
马索亚内酯通过抑制淋巴因子表达，降低抗原递呈细胞活性，进而抑制抗原递呈。所述淋巴因子为IL-1α和IL-1β，所述抗原递呈细胞为单核-巨噬细胞。
所述自身免疫疾病为T淋巴细胞介导的自身免疫疾病，如类风湿性关节炎。
当索马亚内酯用于制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物或保健品时，还可作为抑制或逆转炎细胞浸润活性成分、和/或抑制或逆转破骨细胞生成活性成分、和/或抑制或逆转滑膜增生活性成分。
一种预防和/或治疗自身免疫疾病的药物或保健品，含有活性成分索马亚内酯或者其药学可接受的盐。所述索马亚内酯或者其药学可接受的盐的重量百分比为0.01％～99.99％。该药物尤其适用于预防和/或治疗类风湿性关节炎。
所述药物还包括辅助活性成分和/或药学上可接受的辅料，所述辅助活性成分包括辅助抑制淋巴因子表达活性成分、辅助抑制淋巴细胞增殖和/或活化活性成分、辅助抑制抗原递呈活性成分、或辅助抑制信号传导及转录激活因子活性成分。
所述药物或保健品还包括一种或者多种医药学或保健品领域可接受的辅料，有载体、崩解剂、赋形剂、调味剂、润滑剂、粘合剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂或表面活性剂等。
所述药物，可根据需要制备成具有预防和/或治疗作用的医药学上可接受的任意剂型。医药学上可接受的剂型有液体制剂、固体制剂、半固体制剂或者气体制剂等。液体制剂包括但不限于口服液、注射液、混悬液、冲剂等；固体制剂包括但不限于丸剂、散剂、丹剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、粉剂等；半固体制剂包括但不限于软膏剂、糊剂等，气体制剂包括但不限于气雾剂、喷雾等。
所述保健品，根据需要制备成具有调节和/或预防作用的保健品上适用的任意类型，可以是保健食品中的硬糖、软糖、茶、饮品(酒、醋)、汤品、药膳等，也可以是保健药品中的液体制剂、固体制剂、半固体制剂或者气体制剂等。固体制剂包括但不限于丸剂、散剂、丹剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、粉剂等；液体制剂包括但不限于口服液、注射液、混悬液、冲剂等；气体制剂包括但不限于气雾剂、喷雾等。
本发明的有益效果为：经研究证实，马索亚内酯可通过抑制抗原递呈、和/或抑制淋巴细胞增殖和/或活化、和/或抑制淋巴因子表达，抑制或减弱T淋巴细胞介导的免疫应答，还可通过抑制抗原递呈、和/或免疫球蛋白释放，抑制或减弱体液免疫应答，基于马索亚内酯抑制或减弱T淋巴细胞介导的免疫应答和/或体液免疫应答，抑制或减弱自身免疫引起的免疫反应，预防和/或治疗自身免疫疾病，尤其用于T淋巴细胞介导的自身免疫疾病(类风湿性关节炎)。马索亚内酯可用于制备预防和/或治疗自身免疫疾病(类风湿性关节炎)药物，且低毒、高效、价廉，为自身免疫疾病(类风湿性关节炎)提供新的治疗药物。
附图说明
图1为实施例1马索亚内酯(C-10ML)对于不同刺激剂(ConA、Anti-CD3e&Anti-CD28)诱导淋巴细胞增殖的抑制率图。
图2为实施例1马索亚内酯(C-10ML)对于ConA诱导淋巴细胞增殖培养上清液中IL-2细胞因子的影响。图2A为不同浓度马索亚内酯培养条件下，IL-2细胞因子浓度随时间的变化；图2B为培养24小时时，不同浓度马索亚内酯培养条件下，IL-2细胞因子的浓度变化。
图3为实施例1马索亚内酯(C-10ML)对于ConA诱导淋巴细胞增殖培养上清液中IFN-γ细胞因子的影响。图3A为不同浓度马索亚内酯培养条件下，IFN-γ细胞因子浓度随时间的变化；图3B为培养48小时时，不同浓度马索亚内酯培养条件下，IFN-γ细胞因子的浓度变化。
图4为实施例1马索亚内酯(C-10ML)对于Anti-CD3e&Anti-CD28诱导淋巴细胞增殖培养上清液中IL-2细胞因子的影响。图4A为不同浓度马索亚内酯培养条件下，IL-2细胞因子浓度随时间的变化；图4B为培养24小时时，不同浓度马索亚内酯培养条件下，IL-2细胞因子的浓度变化。
图5为实施例1马索亚内酯(C-10ML)对于Anti-CD3e&Anti-CD28诱导淋巴细胞增殖培养上清液中IFN-γ细胞因子的影响。图5A为不同浓度马索亚内酯培养条件下，IFN-γ细胞因子浓度随时间的变化；图5B为培养24小时时，不同浓度马索亚内酯培养条件下，IFN-γ细胞因子的浓度变化。
图6为实施例1马索亚内酯(C-10ML)对于不同刺激剂(ConA、Anti-CD3e&Anti-CD28)诱导淋巴细胞增殖细胞蛋白(Stat1、Stat4、p-Stat1)表达的影响。
图7为实施例3的CIA模型组与C-10ML给药组关节炎指数评分图。
图8为实施例3正常组、CIA模型组与C-10ML给药组小鼠踝关节病理HE染色图。
图9为实施例3正常组、CIA模型组与C-10ML给药组小鼠踝关节骨吸收评级。
图10为实施例3正常组、CIA模型组与C-10ML给药组小鼠踝关节炎症水平评级。
具体实施方式
下面结合具体实施方式和附图对本发明作详细说明。
实施例1
1.实验目的
通过体外对正常小鼠淋巴细胞诱导增殖，考察C-10ML对于淋巴细胞增殖的影响。
2.实验方法和结果
2.1小鼠淋巴细胞单细胞悬液的获取
实验动物为Balb/c小鼠，6周龄，雄性，由上海中医药大学实验动物中心提供。脱颈椎处死小鼠，浸泡酒精后，转移至安全柜内，无菌操作取出脾脏于PBS中。用载玻片磨玻璃部分研磨脾脏，经尼龙膜过滤至离心管中，4℃、1300rpm离心5分钟后，弃去上清。用红细胞裂解液对红细胞进行裂解，PBS终止裂解，4℃、1300rpm离心5分钟后，弃去上清，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液混悬细胞，过尼龙膜取出红细胞膜，对细胞混悬液进行细胞计数。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞浓度调整为4×106个/mL的细胞悬液，备用。
2.2 CCK8法检测C-10ML对于不同刺激剂体外诱导淋巴细胞增殖的影响
2.2.1 C-10ML对于ConA诱导淋巴细胞增殖的影响
用含血清1640培养液将1mg/mL ConA原液稀释至4μg/mL。96孔培养板每孔加入100μL 2.1步骤获取的细胞悬液，各孔加入50μL ConA(刀豆蛋白A)溶液(ConA终浓度1μg/mL)，阳性对照孔(仅给予ConA刺激，不给于药物，即50μL ConA+50μL培养液组，作为100％增殖率的基准)加入50μL培养液，其余各孔依次加入50μLC-10ML溶液使其终浓度为20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM。细胞于含5％CO2的37℃培养箱中分别培养48h。在培养结束前12小时，加入10μL/孔的CCK8继续培养至48小时，直接用酶标仪在450nm与630nm下读取数据，马索亚内酯对ConA诱导淋巴细胞增殖的抑制率曲线如图1所示。
ConA诱导后淋巴细胞具有显著的增殖活性。给予不同浓度的C-10ML后，淋巴细胞增殖活性出现不同程度的抑制，且C-10ML对淋巴细胞增殖的抑制作用呈现浓度依赖关系。
2.2.2 C-10ML对于Anti-CD3e与Anti-CD28诱导淋巴细胞增殖的影响
用PBS将Anti-CD3e稀释至10μg/mL，96孔培养板每孔加入50μL，放入5％CO2的37℃培养箱中包被抗体，2小时后取出，用PBS洗去多余抗体。用含血清1640培养液将1mg/mLAnti-CD28原液稀释至8μg/mL。96孔培养板每孔加入100μL 2.1备用的实验细胞悬液，每孔加入50μL Anti-CD28溶液(Anti-CD28终浓度2μg/mL)，阳性对照孔(仅给予Anti-CD28刺激，不给于药物，即50μL Anti-CD28+50μL培养液组，作为100％增殖率的基准)加入50μL培养液，其余各孔依次加入C-10ML溶液50μL使其终浓度为20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM。细胞于含5％CO2的37℃培养箱中分别培养48h。在培养结束前12小时，加入10μL/孔的CCK8继续培养至48小时，直接用酶标仪在450nm与630nm下读取数据，马索亚内酯对Anti-CD3e与Anti-CD28诱导淋巴细胞增殖的抑制率曲线如图1所示。
Anti-CD3e与Anti-CD28诱导后淋巴细胞具有显著的增殖活性。给予不同浓度的C-10ML后，淋巴细胞增殖活性出现不同程度的抑制，且C-10ML对淋巴细胞增殖的抑制作用呈现浓度依赖关系。
C-10ML对于ConA诱导的淋巴细胞增殖的抑制效率高于Anti-CD3e与Anti-CD28诱导增殖，且具有统计学差异。说明C-10ML对于体外诱导淋巴细胞增殖具有抑制作用。
2.3 ELISA方法检测C-10ML对于不同刺激剂体外诱导淋巴细胞培养上清中炎症因子IL-2与IFN-γ含量的影响
诱导方式同2.2，平行设置未给予刺激剂(ConA和Anti-CD3e&Anti-CD28)和C-10ML药物的空白对照组(Negative Control，NC)，给予ConA刺激剂而未给予C-10ML药物的ConA模型对照组(Control)，给予ConA刺激剂和C-10ML药物的ConA模型给药组，给予Anti-CD3e&Anti-CD28刺激剂而未给予C-10ML药物的Anti-CD3e&Anti-CD28模型对照组(Control)，给予Anti-CD3e&Anti-CD28刺激剂和C-10ML药物的Anti-CD3e&Anti-CD28模型给药组，其中，ConA模型给药组和Anti-CD3e&Anti-CD28模型给药组又根据分别为2.8μM、1.4μM与0.7μM的药物C-10ML终浓度再各自平行设置3个组别。分别于24、48、72、96小时收集培养上清，按试剂盒步骤测定上清中炎症因子IL-2与IFN-γ的含量。
不同浓度C-10ML对ConA诱导淋巴细胞增殖过程中IL-2的影响如图2所示。如图2A和图2B，ConA体外诱导淋巴细胞增殖，在24小时时，IL-2达到分泌高峰，高浓度C-10ML(2.8μM)具有显著抑制IL-2分泌的作用。
不同浓度C-10ML对ConA诱导淋巴细胞增殖过程中IFN-γ的影响如图3所示，如图3A和图3B，ConA体外诱导淋巴细胞增殖，在48小时时，IFN-γ达到分泌峰值，各浓度C-10ML均对IFN-γ产生显著的抑制作用，并有浓度依赖关系。
不同浓度C-10ML对Anti-CD3e与Anti-CD28诱导淋巴细胞增殖过程中IL-2的影响如图4所示，如图4A，Anti-CD3e与Anti-CD28体外诱导淋巴细胞增殖，在48小时时，IL-2达到分泌高峰，高浓度C-10ML(2.8μM)具有一定的抑制IL-2分泌作用，但无统计学差异。在培养24小时时，IL-2浓度随马索亚内酯浓度的变化如图4B。
不同浓度C-10ML对Anti-CD3e与Anti-CD28诱导淋巴细胞增殖过程中IFN-γ的影响如图5所示，如图5A和图5B，Anti-CD3e与Anti-CD28体外诱导淋巴细胞增殖，在48小时时，IFN-γ达到分泌峰值，但24小时时，各浓度C-10ML均对IFN-γ产生显著的抑制作用，并有浓度依赖关系。
综上，C-10ML对于体外诱导淋巴细胞增殖所产生的细胞因子IL-2和IFN-γ有抑制作用，进而抑制T细胞活化。
2.4 Western-Blotting方法检测C-10ML对于不同刺激剂体外诱导淋巴细胞中Stat1与Stat4蛋白表达量
诱导方式同步骤2.2，平行设置未给予刺激剂(ConA和Anti-CD3e&Anti-CD28)和C-10ML药物的空白对照组，给予ConA刺激剂而未给予C-10ML药物的ConA模型对照组，给予Anti-CD3e&Anti-CD28刺激剂而未给予C-10ML药物的Anti-CD3e&Anti-CD28模型对照组，给予ConA刺激剂并给予C-10ML药物的ConA模型给药组，给予Anti-CD3e&Anti-CD28刺激剂和C-10ML药物的Anti-CD3e&Anti-CD28模型给药组，其中药物C-10ML终浓度均为5μM。在培养24小时后收集细胞，每份样品中加入100μL混合工作液(含有蛋白酶、磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液)充分超声震荡，离心机13000rpm/min离心10分钟，取上清液，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，调整样本蛋白量，以5：1(蛋白样本：上样缓冲液)比例加入上样缓冲液，充分混匀，99℃蛋白变性，分装备用。将样本进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色。结果如图6所示。
由ConA模型对照组和ConA模型给药组可知，给予ConA刺激后，淋巴细胞中Stat1表达显著升高，磷酸化Stat1(p-Stat1)和Stat4表达有所升高，ConA体外诱导淋巴细胞增殖；同时给予C-10ML药物24小时后，淋巴细胞中Stat1、p-Stat1与Stat4表达均明显下降，C-10ML对Stat1、磷酸化Stat1与Stat4蛋白表达均有明显的抑制作用，说明C-10ML可抑制淋巴细胞活化。
由Anti-CD3e&Anti-CD28模型对照组和Anti-CD3e&Anti-CD28模型给药组可知，给予Anti-CD3e&Anti-CD28刺激后，Stat1和Stat4表达均有所下降，p-Stat1表达升高，说明Anti-CD3e&Anti-CD28可体外诱导淋巴细胞增殖；同时给予C-10ML药物24小时后，淋巴细胞中Stat1和p-Stat1均由明显抑制作用，Stat4蛋白表达明显差异，C-10ML仍可抑制淋巴细胞活化。
STAT被称为“信号转导子和转录激活子”，STAT在信号转导和转录激活上发挥了关键性的作用。以上结果说明C-10ML对于体外诱导淋巴细胞增殖中，细胞所含Stat1与Stat4蛋白表达量具有抑制作用，进而抑制T细胞信号转导和转录激活，抑制T细胞的活化。
实施例2
1.实验目的
通过经典OVA致敏小鼠模型能较客观的考察C10-M对于免疫系统功能的影响。
2.实验方法
2.1 OVA致敏小鼠模型
实验动物：本发明所用实验动物为Balb/c小鼠，6周龄，雄性，由上海中医药大学实验动物中心提供。
实验材料：实验用卵清蛋白(OVA323-339)购自Sigma公司，实验当天，将OVA粉末溶于磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline，PBS)中，配置成4mg/mL，用完全弗氏佐剂(CFA，购自BD公司)等体积与其充分乳化混匀。马索亚内酯(C-10massoialactone，C-10ML)由实验室从发酵虫草菌丝粉中分离获得。实验分组：本实验采用的OVA模型是经典的小鼠体内致敏模型。Balb/c小鼠30只，SPF级，分为正常组(Negative Control，NC，n＝10)，模型组(Control，n＝10)，C-10ML给药组(C-10ML，n＝10)。
实验方法：从实验第1天开始，C-10ML给药组灌胃给予40mg/kg 0.3％CMC-Na配置的混悬马索亚内酯溶液，正常组和模型组予以等体积的0.3％CMC-Na溶液，每日1次，共干预21天(至实验终点)。于实验第7天和第14天，分别于每只小鼠背部分为3处进行皮内注射75μL(150μg OVA，每个部位25μL)。实验终点处死所有小鼠，留取血清和脾脏，检测脾脏细胞体外增殖，血清中抗CII特异性抗体总IgG，以及炎症因子IFN-γ的含量变化。
2.2 CCK8法检测脾细胞经OVA诱导特异性细胞增殖反应
在“2.1 OVA致敏小鼠模型”实验终点处死小鼠，无菌取其脾脏，将脾脏用玻璃片磨碎，过膜，于4℃、1200rpm离心5分钟，弃去上清。脾脏细胞沉淀加入红细胞裂解液，每个脾脏约1ml，混匀，静置1分钟，加入PBS，离心。再加入PBS，过膜，离心。将所剩细胞洗涤1-2次后，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞浓度调成4×106个/mL的细胞悬液，备用。
用含血清1640培养液将4mg/mL OVA原液稀释至100μg/mL。96孔培养板每孔加入100μL 2.2备用的细胞悬液(正常组所使用的细胞悬液为2.1正常组小鼠的脾脏，OVA模型组使用的细胞悬液为2.1OVA模型组小鼠的脾脏，C-10ML给药组所使用的细胞悬液为2.1C-10ML给药组小鼠的脾脏)，加入100μL OVA溶液。细胞于含5％CO2的37℃培养箱中分别培养48h。在培养结束前12小时，加入10μL/孔的CCK8继续培养至48小时，直接用酶标仪在450nm与630nm下读取数据，结果见表1。
表1体外淋巴细胞增殖变化
注：N为实验中副孔个数；###，表示与正常对照组比较P<0.001，**，表示与模型组比较P<0.01。
与正常组相比，模型组小鼠淋巴细胞混悬液在体外受OVA诱导后淋巴细胞明显增殖；与模型组相比，C-10ML给药组小鼠淋巴细胞混悬液在体外受诱导后增殖效果受到显著抑制，增殖率明显下降，说明马索亚内酯对于小鼠免疫激活后淋巴细胞增殖有抑制作用。
2.3 ELISA方法检测血清中抗OVA特异性抗体总IgG的含量
在“2.1 OVA致敏小鼠模型”实验终点(第21天)，眼底静脉采血，室温静置2h，待全血自然凝结。3000rpm、18℃离心25min，分离血清后-80℃冻存备用。将血清以1：5000的比例稀释，按以下步骤测定血清中抗OVA特异性抗体总IgG的含量：
(1)包被胶原：以OVA(50μg/mL)加入96孔板中,于4℃抗原包被孵育过夜。密封酶标板，防止蒸发，而后用洗液洗3次。
(2)封闭：每孔加入200μL封闭液。密封平板，在室温下放置1小时，而后用洗液洗3次。
(3)加标准品和样品：每孔加入50μL标准品或血清样品(封闭液稀释)，密封平板，在室温放置2小时。而后用洗液洗3次。
(4)加抗体：每孔加入50μL加入稀释的HRP-羊抗鼠IgG孵育1小时。密封酶标板，在室温放置1小时。而后用洗液洗3次。
(5)加底物TMB显色：在使用时，将反应底物TMB用0.1M柠檬酸-0.2M NaH2PO4缓冲液(pH5.4)稀释成0.1mg/ml，加入0.075％H2O2，每孔加入100μL，在室温放置30分钟。加入50μL终止液(1M HCL)终止现色反应。于450nm、校正630nm处，测定OD值。根据标准曲线换算出血清中抗体含量，结果见表2。
表2血清中抗OVA特异性抗体总IgG变化
注：##，表示与正常对照组比较P<0.01，***，表示与模型组比较P<0.001。
与正常组相比，模型组小鼠受到胶原致敏攻击，其血清中抗OVA特异性抗体总IgG显著上升；与模型组相比，C-10ML给药组小鼠血清中的抗OVA特异性抗体总IgG水平降低，有统计学差异，说明C-10ML能够抑制OVA小鼠的体液免疫应答。
2.4 ELISA方法检测血清中炎症因子IFN-γ的含量
在“2.1 OVA致敏小鼠模型”在实验终点(第21天)，眼底静脉采血，室温静置2h，待全血自然凝结后，进行3000rpm/18℃离心25min，分离血清后-80℃冻存备用。将血清以1：5的比例稀释，按试剂盒步骤测定血清炎症因子IFN-γ的含量，结果见表3。
表3血清中细胞因子IFN-γ变化
注：***，表示与模型组比较P<0.001。
与模型组相比，C-10ML给药组小鼠血清中炎症因子IFN显著降低，有统计学差异，说明C-10ML能够抑制OVA小鼠血清中辅助性T细胞1型细胞因子因子IFN-γ的产生。
实施例3
1.实验目的
考察C-10ML对类风湿关节炎的治疗作用.
2.实验方法
2.1牛II型胶原诱导的小鼠关节炎(CIA)动物模型
实验动物：本发明所用实验动物为DBA/1小鼠，6周龄，雄性，由上海中医药大学实验动物中心提供。
实验材料：实验用牛Ⅱ型胶原(ColⅡ)由四川大学化学工程学院提供，牛II型胶原溶于0.1M醋酸溶液，配置成10mg/ml，于4℃过夜溶解。实验当天用完全弗氏佐剂(CFA，购自BD公司)等体积与胶原充分乳化混匀。马索亚内酯(C-10massoialactone，C-10ML)为本实验室自行制备。本实验所采用的CIA模型是经典的小鼠体内类风湿关节炎模型。DBA/1小鼠40只，SPF级，其中正常组(Negative Control，NC，n＝5)，其余所有小鼠进行造模。
实验方法：实验开始第1周与第4周分别进行一次致敏，每次注射0.05mL乳化剂(含250μg胶原)于DBA/1小鼠尾基部进行致敏。第5周，在关节炎症状发作(临床关节炎指数评分≥2)的患关节炎的小鼠随机分为两组，分别是模型组(Control，n＝12)和马索亚内酯给药组(C-10ML，n＝12)。C-10ML给药组灌胃给予40mg/kg 0.3％CMC-Na配置的混悬马索亚内酯溶液，正常组和模型组予以等体积的0.3％CMC-Na溶液，每日1次，共干预3周。自予以干预日开始，每天使用0～4的临床关节炎评分系统评价每个足趾的关节炎分数：
0分，没有关节炎；
1分，一个或两个指骨间(IP)关节肿胀或发红；
2分，三个或四个指骨间(IP)关节患有关节炎的或者有一个较大的关节患有关节炎；
3分，超过有四个关节发红或肿胀，较重红肿并延伸至踝关节；
4分，趾、足、踝均严重红肿，消退后关节强直，整个爪子患有严重的关节炎；
每只动物评分在0分-16分之间。第8周末结束处死所有小鼠，留取血清、脾脏及小鼠后肢，检测血清中抗ColⅡ特异性抗体总IgG，脾脏细胞体外增殖，后肢组织HE染色病理评价。
CIA模型组与C-10ML给药组关节炎指数评分结果如图7所示，第二次胶原诱导后，造模小鼠开始出现足趾关节红肿，7天左右多数小鼠达到发病标准(CIA关节炎评分>2)，给药5天左右双侧足爪关节包括踝关节出现明显肿胀，给药组小鼠肿胀程度较模型组有减轻的趋势，给药10天后，给药组关节炎指数明显低于模型组并具有统计学差异(p<0.05)。说明马索亚内酯减轻关节炎导致的足爪关节红肿。
2.2 CCK8法检测脾细胞经ColⅡ诱导的特异性细胞增殖反应
在“2.1牛II型胶原诱导的小鼠关节炎(CIA)动物模型”实验终点处死小鼠，无菌取其脾脏，将脾脏用玻璃片磨碎，过膜，于4℃、1200rpm离心5分钟，弃去上清。脾脏细胞沉淀加入红细胞裂解液，每个脾脏约1ml，混匀，静置1分钟，加入PBS，离心。再加入PBS，过膜，离心。将所剩细胞洗涤1-2次后，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞浓度调成4×106个/mL的细胞悬液，备用。
于96孔板中每孔加入100μL的细胞悬液，而后每孔中加入终浓度200μg/mL的ColⅡ100μL。另以加入100μL 1640培养液的孔为阴性对照(作为增殖的本底)。在培养结束前12小时，加入10μL/孔的CCK8继续培养至48小时，直接用酶标仪在450nm以及630nm下读取数据，结果见表4。
表4体外淋巴细胞增殖变化
注：N为实验中副孔个数；###，表示与正常对照组比较P<0.001，***，表示与模型组比较P<0.001。
与正常组相比，模型组小鼠淋巴细胞混悬液在体外受胶原诱导后淋巴细胞明显增殖；与模型组相比，C-10ML给药组小鼠淋巴细胞混悬液在体外受诱导后增殖效果受到显著抑制，增殖率明显下降，说明马索亚内酯对于小鼠免疫激活后淋巴细胞增殖有抑制作用。
2.3 ELISA方法检测血清中抗ColⅡ特异性抗体总IgG的含量
在“2.1牛II型胶原诱导的小鼠关节炎(CIA)动物模型”实验终点(第21天)，眼底静脉采血，室温静置2h，待全血自然凝结。3000rpm、18℃离心25min，分离血清后-80℃冻存备用。将血清以1：5000的比例稀释，用PBS将ColⅡ配置成50μg/ml，密封酶标板，防止蒸发。与37℃包被1小时。后续步骤同实施例2中2.3步骤，结果见表5。
表5血清中抗CII特异性抗体总IgG变化
注：###，表示与正常组相比较P<0.001；*，表示与模型组相比较P<0.05。
与正常组相比，模型组小鼠受到胶原致敏攻击，其血清中抗ColⅡ特异性抗体总IgG显著上升；与模型组相比，C-10ML给药组小鼠血清中的抗ColⅡ特异性抗体总IgG水平降低，有统计学差异；说明C-10ML能够抑制CIA小鼠的体液免疫应答。
2.4踝关节形态学评价及病理损伤评分
在“2.1牛II型胶原诱导的小鼠关节炎(CIA)动物模型”实验终点处死小鼠，取后足踝关节置于10％福尔马林中固定，经甲酸脱钙后制备石蜡切片，取后足炎性踝关节进行HE染色(图8)，观察组织病理变化，并进行病理评分。踝关节病理分别从炎症和骨吸收评分，结果见图9和图10。
正常组关节腔完整，具有完整光滑的软骨及软骨下组织。CIA模型组出现大片关节软骨及软骨下骨组织变性坏死，炎细胞和破骨细胞出现，滑膜增生，滑膜细胞下间质充血水肿炎细胞浸润，周围软组织大量炎细胞浸润(+++)；予以C-10ML干预后，小鼠病变关节组织病理改变显著减轻，关节软骨周围仅出现轻度滑膜增生，炎症细胞浸润也有明显改善。说明C-10ML可明显抑制CIA小鼠关节炎发病的严重程度，显著减轻病变关节组织的病理变化。
2.5 PCR方法检测C-10ML对于脾细胞中抗原递呈相关转录因子的影响
(1)总RNA提取：用2.2中细胞悬液，于6孔板中每孔加入2mL的细胞悬液，而后每孔中加入终浓度200μg/ml的ColⅡ2mL，培养24H。6孔板，收集细胞悬液，离心4℃，1200rpm，5分钟后，弃上清，再用1mL PBS清洗一遍，分别收集于1.5mL EP管中，离心4℃，1200rpm，5分钟后，弃上清，加500μL Trizol吹打，每管加100μL氯仿，充分震荡至充分乳化，静置分层，4℃、12000rpm离心15min。分别取上层(水层)于1.5mL EP管中，加入等体积异丙醇，充分震荡，-20℃过夜。取出后室温平衡，4℃、12000rpm离心15min，弃上清，每管加入500μL 75％乙醇(预冷)，震荡使RNA斑块悬起，4℃、7600rpm离心5min。吸尽上清，冰浴5min，每管加入30μLRNase-free水，溶解RNA。取1.5μL用微量分光光度仪测RNA浓度。
(2)逆转录反应：以试剂盒(PrimerScript RT Master Mix,购置于TaKaRa公司)所提供方式配置反应液，进行逆转录(逆转录条件：37℃×15min 85℃×5sec 4℃)
(3)实时定量PCR反应：以试剂盒(SYBR Premix ExTaq，购置于TaKaRa公司)所提供方式配置反应液，通过特异性引物序列，进行PCR扩增程序(程序：95℃×30s，cycle 1；95℃×5s 60℃×30s，cycle 40)
具体序列如下：
IL-1α正向引物：5'-CGA AGA CTA CAG TTC TGC CAT T-3'
IL-1α反向引物：5'-GAC GTT TCA GAG GTT CTC AGA G-3'
IL-1β正向引物：5'-GCAACT GTT CCT GAA CTC AAC T-3'
IL-1β反向引物：5'-ATC TTT TGG GGT CCG TCA ACT-3'
IL-6正向引物：5'-TAG TCC TTC CTA CCC CAA TTT CC-3'
IL-6反向引物：5'-TTG GTC CTT AGC CAC TCC TTC-3'
IL-12a正向引物：5'-CTG TGC CTT GGT AGC ATC TAT G-3'
IL-12a反向引物：5'-GCA GAG TCT CGC CAT TAT GAT TC-3'
IL-12b正向引物：5'-TGG TTT GCC ATC GTT TTG CTG-3'
IL-12b反向引物：5'-ACA GGT GAG GTT CAC TGT TTC T-3'
2.6统计学方法
所有结果均以MEAN±SD表示，用单因素方差分析检验进行统计学分析，结果见表6。
表6脾细胞中抗原递呈相关转录因子的变化
注：#，表示与正常组相比较P<0.05；##，表示与正常组相比较P<0.01；###，表示与正常组相比较P<0.001；***，表示与模型组相比较P<0.001。
给予C-10ML可显著降低IL-1β、IL-6及IL-12b的表达量，降低IL-12a的表达，对于IL-1α有降低的趋势。其中，IL-1(IL-1α、IL-1β)可促进单核－巨噬细胞等抗原递呈细胞(APC)的抗原递呈能力。IL-1表达下降使APC的抗原递呈能力下降，并且降低APC分泌T细胞活化分化所需的IL-6、IL-12(IL-12a、IL-12b)细胞因子，故C-10ML通过抑制APC抗原递呈能力从而抑制免疫作用。

Claims (10)

1.马索亚内酯在制备预防和/或治疗自身免疫疾病药物或保健品方面的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述马索亚内酯作为抑制或减弱T淋巴细胞介导的细胞免疫应答活性成分、和/或抑制或减弱体液免疫应答活性成分。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述马索亚内酯通过抑制抗原递呈、和/或抑制淋巴细胞增殖和/或活化、和/或抑制淋巴因子表达，抑制或减弱T淋巴细胞介导的免疫应答。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述马索亚内酯通过抑制淋巴因子表达，降低抗原递呈细胞活性，进而抑制抗原递呈；
通过抑制抗原递呈细胞活性、和/或抑制淋巴因子表达、和/或抑制信号传导及转录激活因子表达，抑制淋巴细胞增殖和/或活化；
通过抑制淋巴细胞增殖和/或活化、和/或抑制抗原递呈细胞活性，抑制淋巴因子表达。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述马索亚内酯通过抑制抗原递呈、和/或免疫球蛋白释放，抑制或减弱体液免疫应答。
6.根据权利要求1所述应用，其特在于，所述自身免疫疾病为类风湿性关节炎。
7.根据权利要求1或6所述的应用，其特征在于，所述马索亚内酯作为抑制或逆转炎细胞浸润活性成分、和/或抑制或逆转破骨细胞生成活性成分、和/或抑制或逆转滑膜增生活性成分。
8.一种用于预防和/或治疗自身免疫疾病的药物或保健品，其特征在于，其活性成分含有马索亚内酯。
9.根据权利要求8所述的药物或保健品，其特征在于，所述自身免疫疾病为类风湿性关节炎。
10.根据权利要求8所述的药物或保健品，其特征在于，还包括以下成分中的至少一种：辅助抑制淋巴因子表达活性成分、辅助抑制淋巴细胞增殖和/或活化活性成分、辅助抑制抗原递呈活性成分、辅助抑制信号传导及转录激活因子活性成分、药学上可接受的辅料。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN107349200A (zh) * 2017-07-25 2017-11-17 上海中医药大学附属曙光医院 一种马索亚内酯及5‑羟基‑2‑癸烯酸的新用途

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