CN109153998B - 能够从木糖生产聚(乳酸-共-乙醇酸)或其共聚物的重组微生物以及使用其制备聚(乳酸-共-乙醇酸)或其共聚物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有从木糖生产聚(乳酸‑共‑乙醇酸)及其共聚物的能力的重组微生物，并且更具体地涉及一种具有在不必从外部来源供应乙醇酸前体的情况下生产聚(乳酸‑共‑乙醇酸)及其共聚物的能力的重组微生物，并且涉及一种使用其生产聚(乳酸‑共‑乙醇酸)共聚物的方法。

Description

能够从木糖生产聚(乳酸-共-乙醇酸)或其共聚物的重组微生 物以及使用其制备聚(乳酸-共-乙醇酸)或其共聚物的方法
技术领域
本发明涉及一种具有通过使用木糖作为单一碳源或同时使用木糖和葡萄糖作为碳源生产聚(乳酸-共-乙醇酸)及其共聚物的能力的重组微生物，并且更具体地涉及一种具有在不必从外部来源供应乳酸和乙醇酸前体的情况下生产聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物的能力的重组微生物，并且涉及使用其生产聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物的方法。
背景技术
乳酸和乙醇酸的无规共聚物聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)是代表性的可生物降解的聚合物，其可作为通用目的的聚合物或医用聚合物被高度应用。目前，PLGA可通过乳酸与乙醇酸的直接聚合反应而产生，但该反应主要生产仅具有低分子量(1,000-5,000道尔顿)的PLGA。通过丙交酯与乙交酯的开环聚合，可以合成具有100,000道尔顿或更高的高分子量的PLGA。丙交酯和乙交酯分别是乳酸和乙醇酸的环状二酯，并且分别通过乳酸低聚物和乙醇酸低聚物的热分解产生。开环聚合需要使用催化剂如2-乙基己酸锡(II)、锡(II)醇盐、异丙醇铝等。存在一种由低分子量聚合物生产较高分子量聚合物的方法，该低分子量聚合物通过使用链偶联剂通过直接聚合获得。然而，由于使用链偶联剂，生产高分子量PLGA的方法的缺点在于添加有机溶剂或链偶联剂使得过程复杂并且在于这种有机溶剂或链偶联剂不容易去除。目前用于生产高分子量PLGA的商业方法使用如下方法：该方法包括将乳酸和乙醇酸分别转化成丙交酯和乙交酯，并且然后通过丙交酯与乙交酯的开环聚合合成PLGA。
同时，聚羟基链烷酸酯(PHA)是当微生物在经历环境营养素(如磷、氮、镁、氧等)不足时在细胞中积聚过量碳源作为能量或碳源储存物质时生产的聚酯。由于PHA是完全可生物降解的，并且可能具有与由石油生产的常规合成聚合物类似的物理性质，因此作为石油基合成塑料的环境友好替代品而备受关注。
已知PHA可由多种生物体生产，这些生物体包括富养罗尔斯通菌(Ralstoniaeutropha)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、重组大肠杆菌(E.coli)等，并且可以含有约150或更多种不同的单体。这样的PHA被大致分为具有短链长单体(3-5个碳原子)的SCL-PHA(短链长PHA)和具有较长链长单体的MCL-PHA(中等链长PHA)。PHA合酶是合成PHA的关键酶，通过用作底物的单体的种类和酶的亚基被大致分为四类(Qi等人,FEMS Microbiol.Lett.,157:155,1997；Qi等人,FEMS Microbiol.Lett.,167:89,1998；Langenbach等人,FEMS Microbiol.Lett.,150:303,1997；WO 01/55436；US 6,143,952；WO98/54329；WO 99/61624)。
乙醇酸是具有两个碳原子的最简单的羟基羧酸，并且尚未报道天然含有乙醇酸的PHA。然而，乙醇酸与聚乳酸一起作为代表性的合成生物聚合物非常有用，并因此已经进行各种尝试以将其插入PHA单体中。
在先前的专利(US 8,883,463B2)中，本发明人通过工程化乙醛酸分流途径(glyoxylate shunt pathway)构建了如下大肠杆菌菌株，该大肠杆菌菌株在不必添加外部前体的情况下通过使用葡萄糖作为碳源来生产乙醇酸，并且发现PLGA通过培养用编码丙酸梭菌(Clostridium propionicum)衍生的丙酰辅酶A转移酶(Pct)(其是将乳酸和乙醇酸分别转化为乳酰辅酶A和乙醇酰辅酶A的酶)的基因以及编码可使用乳酰辅酶A和乙醇酰辅酶A作为底物的聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶(PhaC1)的基因转化的大肠杆菌菌株由葡萄糖生产。
因此，本发明人进行了广泛的努力以开发一种重组大肠杆菌菌株，该大肠杆菌菌株能够在不必添加来自外部来源的乙醇酸的情况下通过使用木糖作为主要碳源以更高的效率生产具有高乙醇酸含量的PLGA。结果，发明人构建了表达丙酸梭菌衍生的丙酰辅酶A转移酶、假单胞菌属物种6-19衍生的PHA合酶、木糖脱氢酶和木糖酸内酯酶(xylonolactonase)的重组微生物，并且发现该重组微生物通过使用木糖作为单一碳源或同时使用木糖和葡萄糖作为碳源生产聚(乳酸-共-乙醇酸)及其共聚物，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的目标是提供一种重组微生物，该重组微生物可在没有外部添加乙醇酸的情况下生产高浓度的聚(乳酸-共-乙醇酸)和各种聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物。
本发明的另一个目标是提供一种使用重组微生物生产聚(乳酸-共-乙醇酸)的方法，该重组微生物可在没有外部添加乙醇酸的情况下生产高浓度的聚(乳酸-共-乙醇酸)和各种聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物。
为实现上述目标，本发明提供了一种具有生产聚(乳酸-共-乙醇酸)的能力的重组微生物，其中将聚羟基链烷酸酯合酶编码基因、丙酰辅酶A转移酶编码基因、木糖脱氢酶编码基因和木糖酸内酯酶编码基因引入具有由丙酮酸生产乳酸的能力的微生物中，并且涉及使用其生产聚(乳酸-共-乙醇酸)的方法。
本发明还提供了一种具有生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-3-羟基丁酸)的能力的重组微生物，其中将聚羟基链烷酸酯合酶编码基因、丙酰辅酶A转移酶编码基因、木糖脱氢酶编码基因、木糖酸内酯酶编码基因、β-酮硫解酶编码基因和乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因引入微生物中，并且涉及使用其生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-3-羟基丁酸)的方法。
本发明还提供了一种具有生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-4-羟基丁酸)的能力的重组微生物，其中将聚羟基链烷酸酯合酶编码基因、丙酰辅酶A转移酶编码基因、木糖脱氢酶编码基因、和木糖酸内酯酶编码基因、辅酶A依赖性琥珀酸半醛脱氢酶编码基因、和4-羟基丁酸脱氢酶编码基因引入微生物中，并且涉及使用其生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-4-羟基丁酸)的方法。
附图说明
图1A显示了本发明中生产的PLGA的化学式，并且图1B显示了通过本发明中进行的代谢工程化提供的PLGA生产途径。
图2A显示了pTacxylBC质粒，图2B显示了pTacxylBC_phaAB质粒，并且图2C显示了pTacxylBC_s4D质粒。
图3显示了通过本发明中进行的代谢工程化使用木糖作为单一碳源的聚(乳酸-共-乙醇酸)生产途径。
图4和5显示了在本发明中构建的重组大肠杆菌菌株的乳酸和乙醇酸生产能力。
图6显示了由本发明中构建的重组大肠杆菌菌株X17ld-p生产的PLGA的1H NMR和13C NMR分析的结果。
图7显示了通过本发明中进行的代谢工程化提供的聚(乳酸-共-乙醇酸-共-3-羟基丁酸)生产途径。
图8显示了通过本发明中进行的代谢工程化提供的聚(乳酸-共-乙醇酸-共-4-羟基丁酸)生产途径。
具体实施方式
发明人试图开发一种能够在不必从外部来源添加乙醇酸的情况下通过使用木糖而不是葡萄糖作为主要碳源以较高的效率生产具有高含量的乙醇酸级分的PLGA的重组大肠杆菌菌株，以及能够生产各种包含乳酸和乙醇酸的聚合物的大肠杆菌菌株，并且已发现当将丙酸梭菌衍生的丙酰辅酶A转移酶、假单胞菌属物种6-19衍生的PHA合酶、木糖脱氢酶和木糖酸内酯酶引入时，当使葡萄糖PTS酶IIBC组分编码基因(ptsG)、醛-醇脱氢酶编码基因(adhE)、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因(pflB)、富马酸还原酶编码基因(frdB)、丙酮酸氧化酶编码基因(poxB)、乳酸脱氢酶编码基因(dld)、苹果酸合酶编码基因(aceB)、乙醇酸氧化酶编码基因(glcDEFG)和另一种苹果酸合酶编码基因(glcB)缺失时，并且当乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)的染色体启动子被trc启动子替换时，可以高浓度生产具有高含量乙醇酸级分的PLGA和聚(乳酸-共-乙醇酸-共-2-羟基丁酸)。
此外，已发现在没有供应外部前体的情况下当将β-酮硫解酶编码基因(phaA)和乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因(phaB)另外引入所开发的重组大肠杆菌菌株时，该重组菌株生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-3-羟基丁酸)，并且当另外引入辅酶A依赖性琥珀酸半醛脱氢酶编码基因(sucD)和4-羟基丁酸脱氢酶编码基因(4hbD)时，该重组菌株生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-4-羟基丁酸)。此外，已发现聚(乳酸-共-乙醇酸-共-2-羟基异戊酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸-共-5-羟基戊酸)和聚(乳酸-共-乙醇酸-共-6-羟基己酸)可通过供应外部前体的方法生产。
因此，在一个方面，本发明涉及一种具有生产聚(乳酸-共-乙醇酸)的能力的重组微生物，其中将聚羟基链烷酸酯合酶编码基因、丙酰辅酶A转移酶编码基因以及木糖脱氢酶-和木糖酸内酯酶-编码基因引入具有由丙酮酸生产乳酰辅酶A的能力的微生物中，并且涉及使用其生产聚(乳酸-共-乙醇酸)的方法。
在本发明中，聚羟基链烷酸酯合酶可以是假单胞菌属物种6-19衍生的PHA合酶或PHA合酶的突变酶，其具有选自以下氨基酸序列的氨基酸序列：
氨基酸序列，其包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的至少一个选自以下的突变：E130D、S325T、S477G、S477F、S477Y、S477G和Q481K；氨基酸序列(PhaC1202)，其包含在SEQID NO:1的氨基酸序列中的E130D和Q481K的突变；氨基酸序列(PhaC1301)，其包含在SEQ IDNO:1的氨基酸序列中的E130D、S325T和Q481K的突变；氨基酸序列(PhaC1310)，其包含在SEQID NO:1的氨基酸序列中的E130D、S477F和Q481K的突变；氨基酸序列(PhaC1437)，其包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的E130D、S325T、S477G和Q481K的突变；以及氨基酸序列(PhaC1439)，其包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的E130D、S325T、S477F和Q481K的突变。
在本发明中，木糖脱氢酶-和木糖酸内酯酶-编码基因可衍生自新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)，并且重组微生物通过引入这些基因可使用Dahms途径。
在本发明中，木糖脱氢酶-和木糖酸内酯酶-编码基因可分别具有SEQ IDNO:3和4的核苷酸序列。
用于生产根据本发明的聚(乳酸-共-乙醇酸)的方法包括以下步骤：(a)通过培养上述具有生产聚(乳酸-共-乙醇酸)的能力的重组微生物来生产聚(乳酸-共-乙醇酸)；以及(b)回收所生产的聚(乳酸-共-乙醇酸)，其中用于培养的碳源可以是单独供应的木糖或者同时供应的木糖和葡萄糖。
本发明人对大肠杆菌菌株进行了代谢工程化，以便构建能够在没有外部添加乙醇酸的情况下直接从生物质衍生的碳源如木糖生产PLGA的大肠杆菌突变体。此外，本发明人证实大肠杆菌XL1-Blue菌株具有参与经由乙醛酸生产乙醇酸的代谢途径的基因，但它在培养期间不天然生产乙醇酸。因此，进行了乙醇酸代谢途径的增强和对乙醇酸的代谢通量的优化。
关于能够在大肠杆菌中生产乙醇酸的代谢途径，作为形成TCA循环的代谢物的异柠檬酸被转化为乙醛酸(乙醛酸分流)，并且然后乙醛酸通过乙醛酸酶被转化为乙醇酸。换句话说，异柠檬酸在异柠檬酸节点中被异柠檬酸裂解酶转化为乙醛酸，或被异柠檬酸脱氢酶转化为2-酮戊二酸，并流入TCA循环。这种代谢通量机制受异柠檬酸脱氢酶的磷酸化/去磷酸化调节，并受各种调节剂调节。以前，尝试了通过使用该代谢途径由葡萄糖生产PLGA(US 8,883,463 B2)。
在本发明中，考虑到乙醇酸可以从称为Dahms途径的木糖利用途径生产的事实，尝试了构建通过使用木糖作为主要碳源来生产高浓度PLGA的大肠杆菌菌株。
关于Dahms途径，当菌株如柄杆菌属(Caulobacter)使用木糖作为碳源时，木糖依次转化为木糖酸内酯(xylonolactone)、木糖酸(xylonate)和2-脱氢-3-脱氧-戊酸，然后通过醛缩酶将其分离成乙醇醛和丙酮酸，并且通过醛脱氢酶将乙醇醛转化为乙醇酸(参见图1B)。当大肠杆菌菌株使用木糖作为碳源时，木糖通过转运蛋白进入细胞，并且然后被木糖异构酶转化为木酮糖，并且经由磷酸戊糖途径而不是Dahms途径进行代谢。因此，尝试了通过将外部基因引入使用Dahms途径的微生物中来构建大肠杆菌中的Dahms途径。由于已知Dahms途径下游的酶存在于大肠杆菌中，因此从新月柄杆菌的染色体扩增Dahms途径上游的木糖脱氢酶和木糖酸内酯酶，从而构建pTacxylBC质粒。将pTacxylBC载体转化到大肠杆菌XL1-Blue菌株中，然后将该菌株在含有20g/l木糖作为单一碳源的MR培养基中培养，并且结果，生产0.89g/L的乙醇酸。
在本发明中，重组微生物的乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)的染色体启动子可以被选自以下的强启动子替换：trc、tac、pBAD、trp、lacUV5和T7。
除了具有增加的生产PLGA的能力之外，本发明构建的菌株可以同时使用葡萄糖和木糖，并因此可通过使用木质纤维素生物质如废木材、稻秆等作为碳源直接由生物质水解产物生产PLGA聚合物，这些木质纤维素生物质是非精制碳源、不用于食品、并且在地球上最为丰富，表明可以大大降低底物的价格。
在本发明中，可从重组微生物中缺失葡萄糖PTS酶IIBC组分编码基因。
在本发明中，可从重组微生物中进一步缺失醛-醇脱氢酶编码基因(adhE)、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因(pflB)、富马酸还原酶编码基因和丙酮酸氧化酶编码基因。
在本发明中，可从重组微生物中进一步缺失dld基因，该基因是另一种乳酸脱氢酶编码基因。
在本发明中，还可从重组微生物中进一步缺失苹果酸合酶编码基因和乙醇酸氧化酶编码基因。
在本发明的实施例中，由于使用丙酮酸作为前体生产作为PLGA的另一单体的乳酸，因此重要的是不通过将丙酮酸转化为乙酸和甲酸中的每一种来减少乳酸的通量。因此，在本发明的一个实施例中，缺失了参与丙酮酸转化的基因poxB(丙酮酸氧化酶)和pflB(丙酮酸甲酸裂解酶)，并且还缺失了frdB(富马酸还原酶)基因，该基因已知可阻止生产潜在的副产物琥珀酸且具有增加乳酸生产的作用。此外，为了增加乙酰辅酶A功能池以便在通过Pct540将乳酸和乙醇酸转化为乳酰辅酶A和乙醇酰辅酶A的过程中提供辅酶A，并且为了阻止在大肠杆菌发酵中的副产物乙醇的产生，还缺失了adhE基因，从而构建了X15菌株。如上所述构建的X15菌株生产1.06g/L的乙醇酸(图3)。
然而，在这种情况下，没有生产乳酸。为此，为了增加乳酸生产，将对应于乳酸脱氢酶(其是将丙酮酸转化为乳酸的酶)的ldhA基因的现有启动子用更强的trc启动子替换，从而构建X15-p菌株。结果证实，生产的乳酸量增加了很少量，并且生产高达0.07g/l的乳酸(图3)。据信，维持较强的乳酸通量对于PLGA生产是重要的，并且努力阻止乳酸随时间的减少。除了ldhA以外，大肠杆菌具有另一种乳酸脱氢酶编码基因(dld)。假设dld基因再次将乳酸转化为丙酮酸，则使dld基因缺失，从而构建X15ld菌株。在X15ld菌株的情况下，生产的乳酸量大大增加至0.67g/L，并且也没有显示随培养时间减少的趋势，同时还生产0.95g/L的乙醇酸(图3)。
因此，在本发明的实施例中，产生具有生产聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物的能力的重组微生物，其中引入了聚羟基链烷酸酯合酶编码基因、丙酰辅酶A转移酶编码基因、以及木糖脱氢酶和木糖酸内酯酶编码基因，其中缺失了葡萄糖PTS酶IIBC组分编码基因(ptsG)、醛-醇脱氢酶编码基因(adhE)、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因(pflB)、富马酸还原酶编码基因(frdB)、丙酮酸氧化酶编码基因(poxB)、乳酸脱氢酶编码基因(dld)、苹果酸合酶编码基因(aceB)、乙醇酸氧化酶编码基因(glcDEFG)和另一种苹果酸合酶编码基因(glcB)，并且其中乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)的染色体启动子被trc启动子替换。
在另一个方面，本发明涉及一种具有生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-3-羟基丁酸)的能力的重组微生物，其中将聚羟基链烷酸酯合酶编码基因、丙酰辅酶A转移酶编码基因、木糖脱氢酶编码基因、木糖酸内酯酶编码基因、β-酮硫解酶编码基因和乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因引入具有由丙酮酸生产乳酰辅酶A的能力的微生物中，并且涉及使用其生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-3-羟基丁酸)的方法。
用于生产根据本发明的聚(乳酸-共-乙醇酸-共-3-羟基丁酸)的方法包括以下步骤：(a)通过培养上述具有生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-3-羟基丁酸)的能力的重组微生物来生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-3-羟基丁酸)；以及(b)回收所生产的聚(乳酸-共-乙醇酸-共-3-羟基丁酸)，其中用于培养的碳源可以是单独供应的木糖或者同时供应的木糖和葡萄糖。
在本发明中，聚羟基链烷酸酯合酶可以是假单胞菌属物种6-19衍生的PHA合酶或PHA合酶的突变酶，其具有选自以下氨基酸序列的氨基酸序列：
氨基酸序列，其包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的至少一个选自以下的突变：E130D、S325T、S477G、S477F、S477Y、S477G和Q481K；氨基酸序列(PhaC1202)，其包含在SEQID NO:1的氨基酸序列中的E130D和Q481K的突变；氨基酸序列(PhaC1301)，其包含在SEQ IDNO:1的氨基酸序列中的E130D、S325T和Q481K的突变；氨基酸序列(PhaC1310)，其包含在SEQID NO:1的氨基酸序列中的E130D、S477F和Q481K的突变；氨基酸序列(PhaC1437)，其包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的E130D、S325T、S477G和Q481K的突变；以及氨基酸序列(PhaC1439)，其包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的E130D、S325T、S477F和Q481K的突变。
在本发明中，丙酰辅酶A转移酶可以是由SEQ ID NO:2的氨基酸序列代表的Pct540酶。
在本发明中，可从重组微生物中进一步缺失选自以下的基因：葡萄糖PTS酶IIBC组分编码基因、醛-醇脱氢酶编码基因、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因、富马酸还原酶编码基因、丙酮酸氧化酶编码基因、作为乳酸脱氢酶编码基因的dld基因、苹果酸合酶编码基因、和乙醇酸氧化酶编码基因。
在仍另一个方面，本发明涉及一种具有生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-4-羟基丁酸)的能力的重组微生物，其中将聚羟基链烷酸酯合酶编码基因、丙酰辅酶A转移酶编码基因、木糖脱氢酶编码基因、和木糖酸内酯酶编码基因、辅酶A依赖性琥珀酸半醛脱氢酶编码基因、和4-羟基丁酸脱氢酶编码基因引入具有由丙酮酸生产乳酰辅酶A的能力的微生物中，并且涉及使用其生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-4-羟基丁酸)的方法。
用于生产根据本发明的聚(乳酸-共-乙醇酸-共-4-羟基丁酸)的方法包括以下步骤：(a)通过培养上述具有生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-4-羟基丁酸)的能力的重组微生物来生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-4-羟基丁酸)；以及(b)回收所生产的聚(乳酸-共-乙醇酸-共-4-羟基丁酸)，其中用于培养的碳源可以是单独供应的木糖或者同时供应的木糖和葡萄糖。此外，可在培养期间添加异亮氨酸和/或2-羟基异戊酸作为前体。
在本发明中，聚羟基链烷酸酯合酶可以是假单胞菌属物种6-19衍生的PHA合酶或PHA合酶的突变酶，其具有选自以下氨基酸序列的氨基酸序列：
氨基酸序列，其包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的至少一个选自以下的突变：E130D、S325T、S477G、S477F、S477Y、S477G和Q481K；氨基酸序列(PhaC1202)，其包含在SEQID NO:1的氨基酸序列中的E130D和Q481K的突变；氨基酸序列(PhaC1301)，其包含在SEQ IDNO:1的氨基酸序列中的E130D、S325T和Q481K的突变；氨基酸序列(PhaC1310)，其包含在SEQID NO:1的氨基酸序列中的E130D、S477F和Q481K的突变；氨基酸序列(PhaC1437)，其包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的E130D、S325T、S477G和Q481K的突变；以及氨基酸序列(PhaC1439)，其包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的E130D、S325T、S477F和Q481K的突变。
在本发明中，丙酰辅酶A转移酶可以是由SEQ ID NO:2的氨基酸序列代表的Pct540酶。
在本发明中，可从重组微生物中进一步缺失选自以下的基因：葡萄糖PTS酶IIBC组分编码基因、醛-醇脱氢酶编码基因、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因、富马酸还原酶编码基因、丙酮酸氧化酶编码基因、作为乳酸脱氢酶编码基因的dld基因、苹果酸合酶编码基因、和乙醇酸氧化酶编码基因。
如本文使用的，“缺失”意指通过基因的取代、缺失或突变来修饰基因，使得由该基因编码的蛋白质不能表现出其原始功能。
在本发明中，通过缺失葡萄糖PTS酶IIBC组分编码基因(ptsG)，木糖和葡萄糖可同时用作碳源。
在本发明中，乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)的染色体启动子可被trc启动子替换，并且可从重组微生物中缺失乳酸脱氢酶编码基因(dld)。
在本发明中，可从重组微生物中缺失苹果酸合酶编码基因(aceB)、乙醇酸氧化酶编码基因(glcDEFG)和另一种苹果酸合酶编码基因(glcB)。
在本发明中，开发了生产PLGA(一种非天然存在的聚合物)的大肠杆菌菌株，并且对大肠杆菌的代谢途径进行工程化，使得可以高浓度生产具有各种单体级分的PLGA。此外，本发明涉及一种生产共聚物的方法，该方法包括以下步骤：在不供应外部前体的情况下生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-3-羟基丁酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸-共-4-羟基丁酸)、或聚(乳酸-共-乙醇酸-共-2-羟基丁酸)，并回收所生产的聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物。
在又另一个方面，本发明涉及一种用于生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-羟基羧酸)的方法，该方法包括以下步骤：(a)在羟基羧酸存在的情况下通过培养上述重组微生物生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-羟基羧酸)；以及(b)回收所生产的聚(乳酸-共-乙醇酸-共-羟基羧酸)。
在本发明中，羟基羧酸可选自：2-羟基异戊酸、5-羟基戊酸和6-羟基己酸。
本发明提供了一种生产聚(乳酸-共-乙醇酸)的方法，该方法包括通过供应各种前体从具有生产聚(乳酸-共-乙醇酸)的能力的重组微生物生产和回收聚(乳酸-共-乙醇酸-共-2-羟基异戊酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸-共-5-羟基戊酸)、或聚(乳酸-共-乙醇酸-共-6-羟基己酸)的步骤。
在本发明的一个实施例中，表达Pct540Cp、PhaC1437Ps6-19、衍生自新月柄杆菌的木糖脱氢酶和木糖酸内酯酶的重组大肠杆菌X17ld-p菌株以4.5wt％的浓度生产聚(68.4mol％乳酸-共-31.6mol％乙醇酸)。这是第一个证明使用木糖作为主要碳源在代谢工程化的大肠杆菌菌株中生产聚(乳酸-共-乙醇酸)的结果。
实施例
在下文中，将参考实施例进一步对本发明进行详细描述。对于本领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例仅用于说明性目的，而不应解释为限制本发明的范围。
实施例1：用于参与PLGA生产的基因的质粒的构建、菌株以及培养方法
以下实施例中使用的菌株、质粒和引物示于下表1和2中。
1-1：质粒pTacxylBC的构建
由于木糖脱氢酶编码基因xylB和木糖酸内酯酶编码基因xylC作为操纵子存在于从KCTC获得的新月柄杆菌菌株的染色体上，因此使用下表2中所示的xylBC_F和xylBC_R引物通过PCR同时扩增xylB和xylC基因，并且然后通过EcoRI和PstI限制酶位点克隆到pTac15k载体(表1)中，使得它们可以在trc启动子的控制下表达。
1-2：质粒pTacxylBC_phaAB的构建
使用通过克隆来自富养罗尔斯通菌(KCTC No.22469)的phaCAB操纵子及其启动子获得的pCnCAB载体作为模板，使用两种引物(Pcncab_invF和Pcncab_invR)进行反向PCR，从而构建缺失phaC的pCnAB。使用两种引物(phaAB_F和phaAB_R)通过PCR扩增来自pCnAB质粒的富养罗尔斯通菌PHA生物合成启动子和phaAB基因，并且然后通过SphI限制酶位点克隆到pTacxylBC载体中，从而构建pTacxylBC_phaAB载体。
1-3：质粒pTacxylBC_s4D的构建
使用两种引物(s4D_F和s4D_R)通过PCR扩增对应于来自pTrc99s4质粒的trc启动子-sucD-4hbD的DNA，并且然后经由SphI限制酶位点克隆到pTacxylBC质粒中。
1-4：培养条件和分析方法
用于在本发明实施例中的每种重组大肠杆菌菌株中生产PLGA共聚物的含100mMMOPS的MR培养基每升含有6.67g KH2PO4、4g(NH4)2HPO4、0.8gMgSO4·H2O、0.8g柠檬酸、0.8g/l的MgSO4·H2O、100mM(3-吗啉代丙烷-1-磺酸)MOPS和5ml的痕量金属溶液。痕量金属溶液每升含有0.5M HCl、10gFeSO4·H2O、2g CaCl2、2.2g ZnSO4·H2O、0.5g MnSO4·H2O、1g CuSO4·H2O、0.1g(NH4)6Mo7O24·H2O、和0.02g Na2B4O7·10H2O。
在每种菌株的培养中，通过在含有5mL LB培养基的25mL管中在30℃下振荡培养过夜来进行种子培养，并且将1mL培养物接种到含有100mL补充有10g/L木糖和10g/L葡萄糖的含100mM MOPS的MR培养基的250mL烧瓶中，并在30℃下振荡培养持续96小时。
为了在trc启动子的控制下表达ldhA基因，当OD600值达到0.4-0.6时添加1mMIPTG。如有必要，向培养基中添加50μg/mL氨苄青霉素、30μg/mL卡那霉素和10μg/mL硫胺素。
本发明中使用的重组菌株和质粒的遗传特征示于下表1中，并且用于构建本发明中的重组菌株和质粒的引物示于下表2中。
[表1]
使用的菌株和质粒
Figure GDA0001873586740000121
Figure GDA0001873586740000131
aAp：氨苄青霉素；Km：卡那霉素；R:耐药。bStratagene Cloning System,La Jolla,CA,USA。c,1.US 20130078673A1 2.Yang,T.H.等人Appl.Microbiol.Biotechnol.90,603-614(2011)。3.Yang,T.H.等人Biotechnol.Bioeng.105,150-160(2010)。
[表2]
本发明中使用的引物序列
Figure GDA0001873586740000132
Figure GDA0001873586740000141
Figure GDA0001873586740000151
Figure GDA0001873586740000161
使用HPLC(Varian ProStar 210,USA)分析包括木糖、葡萄糖、丙酮酸、乙酸、甲酸、乳酸和琥珀酸在内的代谢物，该HPLC配备有UV/VIS(Varian ProStar 320,USA)和折射率检测器(Shodex RI-71,Japan)，使用MetaCarb 87H柱(300x 7.8mm)。使用Ultraspec 300分光光度计(Amersham Bioscience,Sweden)在600nm的波长下测量细胞生长。
使用气相色谱法(Agilent 6890N，配备有Agilent 7683自动注射器、火焰离子化检测器和熔融二氧化硅毛细管柱(ATTM-Wax，30m，ID 0.53mm，膜厚：1.20m，Alltech,Deerfield,IL,USA))进行对细胞内聚合物浓度和组分的分析。
实施例2：分析在表达PHA合酶和丙酰辅酶A转移酶的重组大肠杆菌菌株中含有乙醇酸的聚合物的生产
在该实施例中，检测了待插入以构建生产含有乙醇酸的PHA的重组大肠杆菌菌株的基因。
选择在丙酸梭菌丙酰辅酶A转移酶中具有V193A突变和4个沉默突变(T78C、T669C、A1125G和T1158C)的酶(Pct 540)，使得乙醇酸可以转化为乙醇酰辅酶A，并且通过测量其体外活性来鉴定该酶。
接下来，为了选择PHA合酶，对假单胞菌属物种6-19衍生的PHA合酶(野生型PhaC1)(其生产具有高含量乳酸级分的聚(乳酸-共-3-羟基丁酸))和五种突变酶(PhaC1202(E130D、Q481K)，PhaC1301(E130D、S325T、Q481K)，PhaC1310(E130D、S477F、Q481K)，PhaC1437(E130D、S325T、S477G和Q481K)，PhaC1439(E130D、S325T、S477F、Q481K))进行了测试。为了检测由乙醇酸合成细胞内聚合物的程度，将乙醇酸钠作为前体以2g/L的浓度添加到培养基中，并且同时，添加2g/L的3-羟基丁酸钠以便通过提供3-羟基丁酸辅酶A(其是PHA合酶偏好的底物)来促进聚合物生产。由转化的重组大肠杆菌XL1-Blue菌株生产的聚合物的分析结果示于下表3中。
[表3]
由重组大肠杆菌菌株生产的共聚物的组成和浓度
Figure GDA0001873586740000171
aLA：乳酸；GA：乙醇酸；3HB：3-羟基丁酸。
对于上述基因中除野生型PhaC1以外的突变酶，已证实生产包含乙醇酸和乳酸的聚合物。在PhaC1437突变酶的情况下，生产具有最高含量的乙醇酸和乳酸的聚合物。因此，使用PhaC1437进行了后续实验。
实施例3：通过对使用木糖作为碳源的大肠杆菌菌株代谢工程化来生产PLGA
在实施例2中，已证实大肠杆菌XL1-Blue菌株可在细胞中通过PhaC1437和Pct540将外部添加的乙醇酸转化成聚合物。因此，在该实施例中，进行了大肠杆菌菌株的代谢工程化以便在没有外部添加乙醇酸的情况下直接从生物质衍生的碳源如木糖生产PLGA。据显示，大肠杆菌XL1-Blue菌株具有参与代谢途径的基因，该代谢途径经由乙醛酸生产乙醇酸，但它在培养期间不天然生产乙醇酸。因此，进行了乙醇酸代谢途径的增强和对乙醇酸的代谢通量的优化。
关于能够在大肠杆菌中生产乙醇酸的代谢途径，作为形成TCA循环的代谢物的异柠檬酸被转化为乙醛酸(乙醛酸分流)，并且然后乙醛酸通过乙醛酸酶被转化为乙醇酸。换句话说，异柠檬酸被异柠檬酸裂解酶转化为乙醛酸(乙醛酸分流)，或被异柠檬酸脱氢酶转化为2-酮戊二酸(TCA循环)。这种代谢通量机制受异柠檬酸脱氢酶的磷酸化/去磷酸化调节，并受各种调节剂调节。以前，尝试了通过使用该代谢途径由葡萄糖生产PLGA(US 8,883,463B2)。
在本发明中，考虑到乙醇酸可以从称为Dahms途径的木糖利用途径生产的事实，尝试了构建通过使用木糖作为主要碳源来生产高浓度PLGA的大肠杆菌菌株。
关于Dahms途径，当菌株如柄杆菌属(Caulobacter)使用木糖作为碳源时，木糖依次转化为木糖酸内酯(xylonolactone)、木糖酸(xylonate)和2-脱氢-3-脱氧-戊酸，然后通过醛缩酶将其分离成乙醇醛和丙酮酸，并且通过醛脱氢酶将乙醇醛转化为乙醇酸(参见图1B)。当大肠杆菌菌株使用木糖作为碳源时，木糖通过转运蛋白进入细胞，并且然后被木糖异构酶转化为木酮糖，并且经由磷酸戊糖途径而不是Dahms途径进行代谢。因此，尝试了通过从使用Dahms途径的微生物中引入外部基因来构建大肠杆菌中的Dahms途径。由于已知Dahms途径下游的酶存在于大肠杆菌中，因此从新月柄杆菌的染色体扩增参与Dahms途径上游的木糖脱氢酶和木糖酸内酯酶，从而构建pTacxylBC质粒。将pTacxylBC载体转化到大肠杆菌XL1-Blue菌株中，然后将该菌株在含有20g/l木糖作为单一碳源的MR培养基中培养，并且结果，生产0.89g/L的乙醇酸。
由于使用丙酮酸作为前体生产作为PLGA的另一单体的乳酸，因此重要的是不通过将丙酮酸转化为乙酸和甲酸中的每一种来减少乳酸的通量。因此，缺失了参与丙酮酸转化的基因poxB(丙酮酸氧化酶)和pflB(丙酮酸甲酸裂解酶)，，并且还缺失了frdB(富马酸还原酶)基因，该基因已知可阻止生产潜在的副产物琥珀酸且具有增加乳酸生产的作用。此外，为了增加乙酰辅酶A功能池以便在通过Pct540将乳酸和乙醇酸转化为乳酰辅酶A和乙醇酰辅酶A的过程中提供辅酶A，并且为了阻止在大肠杆菌发酵中的副产物乙醇的产生，还缺失了adhE基因，从而构建了X15菌株。如上所述构建的X15菌株生产1.06g/L的乙醇酸(图3)。
然而，在这种情况下，没有生产乳酸。为此，为了增加乳酸生产，将对应于乳酸脱氢酶(其是将丙酮酸转化为乳酸的酶)的ldhA基因的现有启动子用更强的trc启动子替换，从而构建X15-p菌株。结果证实，生产的乳酸量增加了很少量，并且生产高达0.07g/l的乳酸(图3)。据信，维持较强的乳酸通量对于PLGA生产是重要的，并且努力阻止乳酸随时间的减少。除了ldhA以外，大肠杆菌具有另一种乳酸脱氢酶编码基因(dld)。假设dld基因再次将乳酸转化为丙酮酸，则使dld基因缺失，从而构建X15ld菌株。在构建的X15ld菌株的情况下，生产的乳酸量大大增加至0.67g/L，并且也没有显示随培养时间减少的趋势，同时还生产0.95g/L的乙醇酸(图3)。
当XylBC、PhaC1437和Pct540全部都在X15ld菌株中表达时，基于菌株的总干重以3.1wt％的浓度生产聚合物，并且生产含有量分别为63.8mol％和34.9mol％的乳酸和乙醇酸的PLGA样聚合物(表4)。但是，出乎意料地，生产含有极少量的2-羟基丁酸的聚合物。为了解决这个问题，尝试了阻断2-酮丁酸生物合成途径，该途径被认为是经由其可在大肠杆菌中生产2-羟基丁酸的途径。在编码作为将苏氨酸转化成2-酮丁酸的酶的苏氨酸脱水酶的两个基因(ilvA和tdcB)中，已知在需氧培养中起重要作用的ilvA活性被异亮氨酸抑制(反馈抑制)。因此，重组大肠杆菌菌株在含有5mM异亮氨酸的培养基中培养，并且结果，显示生产的PLGA的量为74.5mol％和23.7mol％，并且浓度相当于1.9wt％的菌株干重(表4)。
[表4]
由重组大肠杆菌菌株生产的PLGA共聚物的组成和浓度
Figure GDA0001873586740000191
a用pPs619C1437Pct540和ptacxylBC转化每种菌株并且在含有100mMMOPS的培养基中培养持续96小时。
bLA：乳酸；GA：乙醇酸；2HB：2-羟基丁酸。
*培养在补充有5mM异亮氨酸的培养基中。
实施例4：同时使用木糖和葡萄糖的大肠杆菌菌株的开发以及对生产PLGA的能力的评估
如上文实施例3中所述，用编码木糖脱氢酶的xylB基因和编码木糖酸内酯酶的xylC基因转化大肠杆菌XL1-Blue菌株并培养，并且结果，生产0.89g/L的乙醇酸。然而，在这种情况下，OD600值降低至对照菌株的约一半，表明菌株的细胞生长速率和细胞密度低。作为这种细胞生长抑制问题的解决方案，将该菌株进行工程化，使得其也可以使用葡萄糖作为另外的碳源。当向大肠杆菌同时给予木糖和葡萄糖时，它首先通过称为碳分解代谢物阻抑的机制使用葡萄糖，并且然后在葡萄糖被完全消耗后使用木糖作为碳源。为了克服这个问题并开发可同时使用两种不同碳源的菌株，从大肠杆菌XL1-Blue菌株中缺失了参与葡萄糖转运系统的ptsG基因，从而构建了XB-p菌株。用pTacxylBC转化的XB-p菌株可同时使用葡萄糖和木糖，并且其细胞生长水平恢复到与不表达XylBC的情况相似的水平。此外，所生产的乙醇酸的量大大增加至1.82g/L。因此，证实了引入葡萄糖作为另外的碳源的策略将是有效的。因此，在实施例4中，构建了使用两种不同碳源的菌株，从而增加了PLGA生产。
通过从XB-p菌株缺失poxB(丙酮酸氧化酶)、pflB(丙酮酸甲酸裂解酶)、frdB(富马酸还原酶)和adhE基因获得的X15-p菌株生产1.82g/L的乙醇酸，并且即使到培养的后期阶段乳酸生产降低了，也生产高达0.99g/L的乳酸(图4)。
虽然培养X15-p菌株的同时XylBC、PhaC1437和Pct540全部都表达了，但是已证实仅生产可忽略量的聚合物。在培养期间乙醇酸生产保持在一定水平以上，而乳酸生产高达0.99g/l，但在一段时间后再次降低。因此，据信增加乳酸的通量对于PLGA生产将是重要的(图4)。
当X15l-p(其中对应于编码将丙酮酸转化成乳酸的乳酸脱氢酶的基因的ldhA基因的现有启动子替换为更强的trc启动子以便增加乳酸生产)在表达XylBC的同时进行培养时，据显示生产高达1.38g/l的乳酸并且增加了乳酸通量(图5)。然而，在该菌株中，与先前菌株的情况一样，所生产的乳酸在一段时间后再次消耗，并且在培养结束时培养基中几乎没有保留乳酸。然而，当XylBC、PhaC1437和Pct540全部都在X15l-p菌株中表达时，可以生产包含乳酸和乙醇酸的聚合物。在这种情况下，尽管乳酸生产在一段时间后降低，但与先前菌株的情况一样，显示出更高的乳酸生产，表明生产聚合物(表5)。
X15ld-p菌株中另外缺失另一种乳酸脱氢酶编码基因(dld)的情况中，乳酸生产大大增加至2.51g/L，并且还显示没有随培养时间降低的趋势，并且同时，乙醇酸生产也略微增加至1.48g/L，表明制备了这样的菌株，该菌株在培养期间生产两种化合物同时将这些化合物浓度保持在高于一定水平(图5)。
当XylBC、PhaC1437和Pct540全部都在X15ld-p菌株中表达时，基于菌株的总干重以16.5wt％的浓度生产聚合物，并且生产含有量分别为77.6mol％和19.6mol％的乳酸和乙醇酸的PLGA样聚合物(表5)。但是，出乎意料地，生产含有极少量的2-羟基丁酸的聚合物。为了解决这个问题，尝试了阻断2-酮丁酸生物合成途径，该途径被认为是经由其可在大肠杆菌中生产2-羟基丁酸的途径。在编码作为将苏氨酸转化成2-酮丁酸的酶的苏氨酸脱水酶的两个基因(ilvA和tdcB)中，缺失已知在需氧培养中起重要作用的ilvA基因，从而构建了异亮氨酸-营养缺陷型X15ld-pi菌株。培养表达PhaC1437、Pct540和XylBC全部的X15ld-pi菌株，并且结果，可生产不含有2-羟基丁酸且包含89.6mol％的乳酸和10.2mol％的乙醇酸的PLGA(表5)。
[表5]
由重组菌株生产的PLGA共聚物的组成和浓度
Figure GDA0001873586740000211
a用pPs619C1437Pct540和ptacxylBC转化每种菌株并且在含有100mMMOPS的培养基中培养持续96小时。
bLA：乳酸；GA：乙醇酸；2HB：2-羟基丁酸。
实施例5：通过另外的代谢工程化生产具有高乙醇酸含量的PLGA
在实施例4中，使用从XL1-Blue工程化的重组X15l-p和X15ld-p菌株，成功地从木糖和葡萄糖生产了PLGA，但是仅生产具有相对高乳酸含量的聚合物。因此，为了增加聚合物的乙醇酸含量，进行了增加细胞内乙醇酸生产的工程化(图5)。为了增强乙醛酸途径，从染色体DNA中同时缺失构成操纵子(glcDEFGB)的苹果酸合酶编码基因aceB、乙醇酸氧化酶编码基因glcDEFG和另一种编码苹果酸合酶的glcB基因，从而构建了X17ld-p菌株。当X17ld-p菌株表达木糖脱氢酶和木糖酸内酯酶时，它生产的乙醇酸的量为2.32g/L，其比先前的重组菌株(X15ld-p)高1.6倍，表明基因的缺失在增加乙醇酸生产方面是有效的。当培养表达聚羟基链烷酸酯合酶、丙酰辅酶A转移酶、木糖脱氢酶和木糖酸内酯酶全部的大肠杆菌X17ld-p菌株时，如从两种单体的生产速率的变化可以看出，乙醇酸的摩尔分数大大增加，并且，以约15.0wt％的浓度生产具有约48％的乙醇酸含量的PLGA样聚合物(表6)。在这种情况下，还含有非常少量的2-羟基丁酸。为此，在缺失ilvA基因之后进行培养，但是细胞生长受到很大抑制，并且没有生产足够量的聚合物。因此，在另一个替代方案中，在不缺失ilvA的情况下，向培养基中添加5mM异亮氨酸以便抑制IlvA的活性，接着进行培养。结果，细胞生长没有受到很大抑制，可成功生产不含有2-羟基丁酸并且包含68.4mol％的乳酸和31.6mol％的乳酸的PLGA(与由X15ld-pi菌株生产的相比乳酸含量大大增加)(表6)。
[表6]
由重组菌株生产的PLGA共聚物的组成和浓度
Figure GDA0001873586740000221
a用pPs619C1437Pct540和ptacxylBC转化每种菌株并且在含有100mMMOPS的培养基中培养持续96小时。
bLA：乳酸；GA：乙醇酸；2HB：2-羟基丁酸。
*该菌株培养在补充有5mM异亮氨酸的培养基中。
实施例6：在重组大肠杆菌菌株中合成的PLGA的特征
通过气相色谱法和NMR分析了本发明中合成的共聚物的单体组分，并且通过有机溶剂萃取法从细胞中纯化了聚合物(Jacquel等人,Biochem Eng J 39:15-27,2008)。分别通过GPC(凝胶渗透色谱法)和DSC(差示扫描量热法)测量了聚合物的分子量和热特性。
已证实由大肠杆菌X17ld-p生产的PLGA由50.3mol％乳酸和48.1mol％乙醇酸组成，并且具有与化学合成的PLGA相同的结构，如通过1H NMR和13C NMR分析的(图5)。在PLGA的600MHz 1H NMR光谱中，在5.2ppm处可看到乳酸的氧基次甲基质子(-OCH-)，并且在4.6-4.9ppm的峰处可看到乙醇酸的甲基质子(-CH3)(图6A)。在PLGA的125MHz 13C NMR光谱中，在169.4ppm处出现了GA*-GA序列的羰基碳峰，并且在169.63ppm处出现了LA*-LA和LA-LA*序列的羰基峰，并且在169.80ppm处出现了LA*-GA+GA-LA*序列的羰基峰(图6B)。
通过GPC分析获得的分子量值和通过DSC分析获得的热特性值示于表5中。分子量在15kDa至25kDa的范围内，其对应于PLGA的分子量，该PLGA经常被用于药物递送，并且在DSC图中未观察到对应于熔点(Tm)的峰，表明生产与通过化学合成生产的PLGA相同的无定形PLGA。另外，玻璃转换温度(Tg)在40℃至46℃的范围内，其与含有非常少量2-HB的市售PLGA的相同(表7)。
[表7]
由重组大肠杆菌菌株生产的PLGA共聚物的分子量和热特性
Figure GDA0001873586740000231
a用pPs619C1437Pct540和ptacxylBC转化每种菌株并且在含有100mMMOPS的培养基中培养持续96小时。
bLA：乳酸；GA：乙醇酸；2HB：2-羟基丁酸。
*该菌株培养在补充有5mM异亮氨酸的培养基中。
实施例7：生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-3-羟基丁酸)的重组微生物菌株的构建
3-羟基丁酸是最众所周知的PHA单体，并且引入了聚-3-羟基丁酸的生物合成的代谢途径以便开发生产包含乳酸、乙醇酸和3-羟基丁酸的聚合物的微生物菌株(图7)。将通过从富养罗尔斯通菌中克隆β-酮硫解酶编码基因phaA和乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因phaB获得的pTacxylBC_phaAB质粒(表1)、以及pPs619C1437Pct540质粒转化到X15ld-p和X17ld-p菌株中的每一种中。将菌株在补充有5mM异亮氨酸的含有100mM MOPS的MR培养基中培养持续96小时。结果，重组大肠杆菌X15ld-p菌株以29.5wt％的浓度生产聚(51.9mol％乳酸-共-7.3mol％乙醇酸-共-40.8mol％3-羟基丁酸)，并且X17ld-p菌株以20.0wt％的浓度生产聚(63.3mol％乳酸-共-13.2mol％乙醇酸-共-23.5mol％3-羟基丁酸)。
实施例8：生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-4-羟基丁酸)的重组微生物菌株的构建
为了在不供应外部前体的情况下生产4-羟基丁酸，从克氏梭菌的染色体中扩增辅酶A依赖性琥珀酸半醛脱氢酶编码基因sucD和4-羟基丁酸脱氢酶编码基因4hbD，从而构建pTacxylBC_s4D质粒(表1)。当用pTacxylBC_s4D质粒和pPs619C1437Pct540质粒转化的重组大肠杆菌X17ld-p菌株在补充有5mM异亮氨酸和100mM MOPS的MR培养基中培养，同时向培养基中供应10g/L木糖和10g/L葡萄糖作为碳源时，对于96小时的培养其以7.3wt％的浓度生产聚(61.2mol％乳酸-共-38.4mol％乙醇酸-共-0.4mol％4-羟基丁酸)。为了增加4-羟基丁酸级分，从X17ld-p菌株中缺失编码将琥珀酸半醛转化成琥珀酸并与4Hbd竞争的琥珀酸半醛脱氢酶的两个基因(yneI和gabD)，从而构建了X17ld-pyg菌株(表1和图8)。表达PhaC1437、Pct540、XylBC、SucD和4HbD全部的X17ld-pyg菌株在上述条件下培养，并且结果，以13.8wt％的浓度生产聚(67.1mol％乳酸-共-23.8mol％乙醇酸-共-9.1mol％4-羟基丁酸)。在这种情况下，4-羟基丁酸的含量大大增加至9.1mol％，表明两个基因(yneI和gabD)的缺失对于增加4-羟基丁酸通量是有效的。
实施例9：通过使用生产PLGA的重组微生物菌株生产包含乳酸和乙醇酸的各种共聚物
为了生产含有各种羟基羧酸的共聚物，除了在实施例7和8中生产的含有3-羟基丁酸和4-羟基丁酸的共聚物之外，选择了2-羟基异戊酸、5-羟基戊酸和6-羟基己酸。
当在添加2g/L的2-羟基异戊酸作为前体之后在含有5mM异亮氨酸的培养基中培养用pTacxylBC和pPs619C1437Pct540质粒转化的重组大肠杆菌X17ld-p菌株时，其以20.8wt％的浓度生产聚(53.6mol％乳酸-共-23.3mol％乙醇酸-共-23.1mol％2-羟基异戊酸)。
在添加2g/L的5-羟基戊酸钠作为前体之后培养重组菌株，并且结果，以16.7wt％的浓度生产聚(69.2mol％乳酸-共-24.7mol％乙醇酸-共-6.1mol％5-羟基戊酸)。此外，当在添加2g/L的6-羟基己酸作为前体之后培养菌株时，其以16.5wt％的浓度生产聚(76.4mol％乳酸-共-22.0mol％乙醇酸-共-1.6mol％6-羟基己酸)。
工业实用性
根据本发明，有可能在不必从外部来源供应乳酸和乙醇酸前体的情况下以高浓度生产聚(乳酸-共-乙醇酸)及其共聚物。
尽管已经参考具体特征对本发明进行了详细描述，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，该描述仅针对优选实施方案并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附的权利要求书及其等同物限定。
所附的文本文件
参见序列表。
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Figure IDA0001873586770000021
Figure IDA0001873586770000031
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Figure IDA0001873586770000061
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Figure IDA0001873586770000201

Claims (19)

1.一种具有生产聚(乳酸-共-乙醇酸)的能力的重组大肠杆菌，其中聚羟基链烷酸酯合酶编码基因、丙酰辅酶A转移酶编码基因、木糖脱氢酶编码基因和木糖酸内酯酶编码基因被引入到具有由丙酮酸生产乳酸的能力的大肠杆菌中；
其中缺失醛-醇脱氢酶编码基因、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因、富马酸还原酶编码基因和丙酮酸氧化酶编码基因；
其中乳酸脱氢酶编码基因(1dhA)的染色体启动子被选自以下的强启动子替换：trc、tac、pBAD、trp、lacUV5和T7；且
其中缺失任何一种或多种作为乳酸脱氢酶编码基因的dld基因和葡萄糖PTS酶IIBC组分编码基因，
其中所述聚羟基链烷酸酯合酶编码基因编码PHA合酶的突变酶，该PHA合酶的突变酶选自由以下组成的组：
PhaC1202，其中在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中E130D和Q481K突变；
PhaC1301，其中在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中E130D、S325T和Q481K突变；
PhaC1310，其中在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中E130D、S477F和Q481K突变；
PhaC1437，其中在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中E130D、S325T、S477G和Q481K突变；和
PhaC1439，其中在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中E130D、S325T、S477F和Q481K突变。
2.权利要求1的重组大肠杆菌，其中从该重组大肠杆菌中缺失葡萄糖PTS酶IIBC组分编码基因。
3.权利要求1的重组大肠杆菌，其中从该重组大肠杆菌中进一步缺失醛-醇脱氢酶编码基因、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因、富马酸还原酶编码基因、丙酮酸氧化酶编码基因、和作为乳酸脱氢酶编码基因的dld基因。
4.权利要求1的重组大肠杆菌，其中从该重组大肠杆菌中进一步缺失葡萄糖PTS酶IIBC组分编码基因、醛-醇脱氢酶编码基因、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因、富马酸还原酶编码基因、和丙酮酸氧化酶编码基因。
5.权利要求1的重组大肠杆菌，其中从该重组大肠杆菌中进一步缺失葡萄糖PTS酶IIBC组分编码基因、醛-醇脱氢酶编码基因、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因、富马酸还原酶编码基因、丙酮酸氧化酶编码基因、和作为乳酸脱氢酶编码基因的dld基因。
6.权利要求1的重组大肠杆菌，其中从该重组大肠杆菌中进一步缺失葡萄糖PTS酶IIBC组分编码基因、醛-醇脱氢酶编码基因、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因、富马酸还原酶编码基因、丙酮酸氧化酶编码基因、作为乳酸脱氢酶编码基因的dld基因、苹果酸合酶编码基因、和乙醇酸氧化酶编码基因。
7.权利要求1的重组大肠杆菌，其中将β-酮硫解酶编码基因和乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因进一步引入该大肠杆菌中，并且该重组大肠杆菌具有生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-3-羟基丁酸)的能力。
8.权利要求7的重组大肠杆菌，其中从该重组大肠杆菌中进一步缺失葡萄糖PTS酶IIBC组分编码基因、醛-醇脱氢酶编码基因、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因、富马酸还原酶编码基因、和丙酮酸氧化酶编码基因。
9.权利要求7的重组大肠杆菌，其中从该重组大肠杆菌中进一步缺失葡萄糖PTS酶IIBC组分编码基因、醛-醇脱氢酶编码基因、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因、富马酸还原酶编码基因、丙酮酸氧化酶编码基因、和作为乳酸脱氢酶编码基因的dld基因。
10.权利要求7的重组大肠杆菌，其中从该重组大肠杆菌中进一步缺失葡萄糖PTS酶IIBC组分编码基因、醛-醇脱氢酶编码基因、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因、富马酸还原酶编码基因、丙酮酸氧化酶编码基因、作为乳酸脱氢酶编码基因的dld基因、苹果酸合酶编码基因、和乙醇酸氧化酶编码基因。
11.权利要求1的重组大肠杆菌，其中将辅酶A依赖性琥珀酸半醛脱氢酶编码基因、和4-羟基丁酸脱氢酶编码基因进一步引入该大肠杆菌中，并且该重组大肠杆菌具有生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-4-羟基丁酸)的能力。
12.权利要求11的重组大肠杆菌，其中从该重组大肠杆菌中进一步缺失葡萄糖PTS酶IIBC组分编码基因、醛-醇脱氢酶编码基因、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因、富马酸还原酶编码基因、和丙酮酸氧化酶编码基因。
13.权利要求11的重组大肠杆菌，其中从该重组大肠杆菌中进一步缺失葡萄糖PTS酶IIBC组分编码基因、醛-醇脱氢酶编码基因、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因、富马酸还原酶编码基因、丙酮酸氧化酶编码基因、和作为乳酸脱氢酶编码基因的dld基因。
14.权利要求11的重组大肠杆菌，其中从该重组大肠杆菌中进一步缺失葡萄糖PTS酶IIBC组分编码基因、醛-醇脱氢酶编码基因、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因、富马酸还原酶编码基因、丙酮酸氧化酶编码基因、作为乳酸脱氢酶编码基因的dld基因、苹果酸合酶编码基因、和乙醇酸氧化酶编码基因。
15.一种用于生产聚(乳酸-共-乙醇酸)的方法，该方法包括以下步骤：
(a)通过培养权利要求1至6中任一项的具有生产聚(乳酸-共-乙醇酸)的能力的重组大肠杆菌来生产聚(乳酸-共-乙醇酸)；以及
(b)回收所生产的聚(乳酸-共-乙醇酸)。
16.一种用于生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-3-羟基丁酸)的方法，该方法包括以下步骤：
(a)通过培养权利要求7至10中任一项的具有生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-3-羟基丁酸)的能力的重组大肠杆菌来生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-3-羟基丁酸)；以及
(b)回收所生产的聚(乳酸-共-乙醇酸-共-3-羟基丁酸)。
17.一种用于生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-4-羟基丁酸)的方法，该方法包括以下步骤：
(a)通过培养权利要求11至14中任一项的具有生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-4-羟基丁酸)的能力的重组大肠杆菌来生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-4-羟基丁酸)；以及
(b)回收所生产的聚(乳酸-共-乙醇酸-共-4-羟基丁酸)。
18.一种用于生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-羟基羧酸)的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在羟基羧酸存在的情况下通过培养权利要求1至6中任一项的重组大肠杆菌生产聚(乳酸-共-乙醇酸-共-羟基羧酸)；以及
(b)回收所生产的聚(乳酸-共-乙醇酸-共-羟基羧酸)。
19.权利要求18的方法，其中该羟基羧酸选自：2-羟基异戊酸、5-羟基戊酸和6-羟基己酸。
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