CN109142610A - 一种文冠果中三萜类化合物的提取检验与含量测定的方法 - Google Patents

一种文冠果中三萜类化合物的提取检验与含量测定的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种文冠果中三萜类化合物提取检验与含量测定的方法，涉及文冠果中生物活性物质提取检验与含量测定领域，以文冠果不同部位为原料，粉碎筛选，脱脂，加入乙醇，超声波微波萃取仪分阶段提取，离心过滤，浓缩，加入甲醇溶解，过滤，定容至25mL，分别获得文冠果果壳、嫩枝、嫩叶、种仁样品溶液备用，利用紫外分光光度计测定不同浓度下标准品的吸光度，绘制得到标准曲线，并计算样品中三萜类化合物含量及提取率，利用质谱仪测定样品分子量信息，用红外检测其官能团，利用旋光仪测定旋光度和比旋光度，蒸发结晶测定熔点。本发明方法省时省力，分离效果较好，纯度高，结果准确，是一种操作简单、效率高的提取检验与含量测定的方法。

Description

一种文冠果中三萜类化合物的提取检验与含量测定的方法
技术领域
本发明涉及文冠果中生物活性物质的提取检验与含量测定领域，具体为一种文冠果中三萜类化合物的提取检验与含量测定的方法。
背景技术
文冠果别名木瓜，文登阁等，为无患子科文冠果属植物落叶乔木或大灌木，产于我国北方，生于海拔52～2260米处的荒山坡、沟谷间和丘陵地带。其种仁含油55%～65%，含蛋白23%～26%，总碳水化合物8%～9%，总糖2%～3%，三萜皂甙5%，18种微量元素等，其心材、茎和果实等均可入药，是蒙古族习用药材，祛风湿，消肿止痛，主要用于治疗风湿病。有研究表明，文冠果油对高血压、血管硬化、疽石症、风湿症、神经性遗尿症和消炎止痛等均有一定疗效。
三萜类化合物是文冠果中的一类有效成分，是一类基本母核由30个碳原子构成的基本碳架，大多数三萜类化合物由6个异戊二烯单位联结而成，三萜类化合物大多数为四环三萜和五环三萜，少数有链状、单环、三环等结构。已有研究表明文冠果壳中三萜皂苷成分对治疗阿兹海默综合症及小儿遗尿症有很好的疗效。三萜类化合物种类繁多，但提取检验方法普遍存在着操作步骤繁琐，有机溶剂用量大，不利于环境保护，溶剂和树脂单体残留等缺点。
为解决文冠果中三萜类化合物的提取检验与含量测定操作繁琐，避免了手动刮点、萃取、重组，进而在质谱上注射分析获取质谱图的过程耗时耗力，含量测定结果易受到干扰而不准确的问题，本发明提供了一种省时省力、易于操作的可快速从文冠果中提取检测三萜类化合物并测定含量的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种文冠果中三萜类化合物提取检验与含量测定的方法，用以克服上述技术缺陷。
本发明是通过如下技术方案来实现的：一种文冠果中三萜类化合物提取检验与含量测定的方法，以文冠果不同部位为原料，采用超声波微波萃取对三萜类化合物进行粗提取，测定不同浓度下标准品的吸光度，绘制得到标准曲线，计算含量及提取率，经薄层层析法分离，利用质谱仪测定样品分子量信息，用红外检测其官能团，测定旋光度、比旋光度和熔点；具体为：以文冠果不同部位为原料，粉碎筛选，脱脂，加入乙醇，超声波微波萃取仪分阶段提取，离心过滤，浓缩，加入甲醇溶解，过滤，定容至25mL，分别获得文冠果不同部位样品溶液备用，利用紫外分光光度计测定不同浓度下标准品的吸光度，绘制得到标准曲线，并计算样品中三萜类化合物含量及提取率，利用质谱仪测定样品分子量信息，用红外检测其官能团，利用旋光仪测定旋光度和比旋光度，蒸发结晶测定熔点。
进一步地，具体过程为：
步骤a，以文冠果果壳、嫩枝、嫩叶和种仁为原料，粉碎筛选，脱脂，取粉末分别加入乙醇，超声波微波萃取仪分阶段提取，超声波功率恒定，获得提取液，以5000r/min离心，过滤，重复3次，浓缩，加入甲醇溶解，过滤，定容至25mL，分别获得文冠果果壳样品溶液、文冠果嫩枝样品溶液、文冠果嫩叶样品溶液、文冠果种仁样品溶液备用；
步骤b，齐墩果酸标准品加甲醇溶解，充分溶解后得到0.2mg/mL的齐墩果酸标准品溶液，保存备用；吸取不同体积的齐墩果酸标准品溶液，分别加入5%香草醛-冰醋酸溶液，高氯酸，摇匀，水浴加热，立即冷却，加冰醋酸，在537nm处测定吸光度，记录数据，绘制标准曲线；取供试样品溶液加入甲醇溶液，在537nm处测定吸光度；
步骤c，将层析板加热活化并冷却后，吸取样液，均匀点样，以氯仿：丙酮=35:3(v/v)为文冠果果壳样品、文冠果嫩枝样品的展开剂，以氯仿：甲醇：水=40:2:1(v/v)为文冠果嫩叶样品的展开剂，以氯仿：丙酮=11:1(v/v)为文冠果种仁样品的展开剂，倒入层析缸，保温20min，上行展开，待展开剂前沿距层析板顶端0.8～1.2cm处时，取出晾干，选取10%硫酸乙醇溶液为显色剂，喷在晾干的层析板上，105℃保持，待其显色后取出，放入薄层色谱成像系统，于紫外波长365nm下，观察层析情况，系统拍照，并标志；
步骤d，用色谱甲醇和超纯水作为流动相，用微量进样器吸取10μL的标准品溶液，进样，对谱图进行分析、保存；将供试品层析板置于TLC-质谱接口上，使激光对准圈出的待测斑点中心处，取样，对谱图进行分析/保存；
步骤e，打开傅里叶红外光谱仪，测试背景，用毛细管吸取标准品溶液于点样中心处，测试样品，对红外谱图进行处理分析，轻刮层析板上的待测斑点置于烧杯中，加入色谱甲醇，过滤取滤液，待测液的红外检测方法与标准品的检测相同；
步骤f，取待测液分别测定旋光度和比旋光度，记录数据并计算平均值；
步骤g，将待测液加热蒸发至样品结晶，测量熔点。
与现有技术相比较本发明的有益效果在于：采用超声波微波粗提取三萜类化合物，薄层层析保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点，同时展开速率快，能实现对三萜类化合物的分离纯化，使得三萜类化合物准确分离，本发明采用Plate ExpressTM技术可直接从TLC薄层板上获取质谱图，其优点是不经过样品前处理，可快速从复杂混合物中获得目标物分子质量信息，并对其进行鉴定，提取率高，分离效果较好，纯度高，是一种省时省力、易于操作的可快速从文冠果中提取检测三萜类化合物并测定含量的方法。
附图说明
图1为本发明的含量测定的流程图。
图2为紫外光下文冠果果壳样品与齐墩果酸标准品的TLC图像，图中1、2为文冠果果壳样品溶液，3为齐墩果酸标准品。
图3为显色后可见光下文冠果果壳样品与齐墩果酸标准品的TLC图像，图中1、2为文冠果果壳样品溶液，3为齐墩果酸标准品。
图4为紫外光下文冠果嫩枝样品与齐墩果酸标准品的TLC图像，图中1、2为文冠果嫩枝样品溶液，3为齐墩果酸标准品。
图5为显色后可见光下文冠果嫩枝样品与齐墩果酸标准品的TLC图像，图中1、2为文冠果嫩枝样品溶液，3为齐墩果酸标准品。
图6为紫外光下文冠果嫩叶样品与齐墩果酸标准品的TLC图像，图中1、2为文冠果嫩叶样品溶液，3为齐墩果酸标准品。
图7为显色后可见光下文冠果种仁样品与齐墩果酸标准品的TLC图像，图中1、2为文冠果种仁样品溶液，3为齐墩果酸标准品。
图8为齐墩果酸的标准曲线。
图9为齐墩果酸标准品的质谱波谱。
图10为文冠果果壳样液的质谱图。
图11为文冠果嫩枝样液的质谱图。
图12为文冠果嫩叶样液的质谱图。
图13为文冠果种仁样液的质谱图。
图14为齐墩果酸标准品的红外光谱。
图15为文冠果果壳的红外光谱。
图16为文冠果嫩枝的红外光谱。
图17为文冠果嫩叶的红外光谱。
图18为文冠果种仁的红外光谱。
具体实施方式
以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
一种文冠果中三萜类化合物提取检验与含量测定的方法，以文冠果不同部位为原料，采用超声波微波萃取对三萜类化合物进行粗提取，测定不同浓度下标准品的吸光度，绘制得到标准曲线，计算含量及提取率，经薄层层析法分离，利用质谱仪测定样品分子量信息，用红外检测其官能团，测定旋光度、比旋光度和熔点；具体为：以文冠果不同部位为原料，粉碎筛选，脱脂，加入乙醇，超声波微波萃取仪分阶段提取，离心过滤，浓缩，加入甲醇溶解，过滤，定容至25mL，分别获得文冠果不同部位样品溶液备用，利用紫外分光光度计测定不同浓度下标准品的吸光度，绘制得到标准曲线，并计算样品中三萜类化合物含量及提取率，利用质谱仪测定样品分子量信息，用红外检测其官能团，利用旋光仪测定旋光度和比旋光度，蒸发结晶测定熔点。
请参阅图1所示，具体过程为：
步骤a，以文冠果果壳、嫩枝、嫩叶和种仁为原料，粉碎筛选，脱脂，取粉末分别加入乙醇，超声波微波萃取仪分阶段提取，超声波功率恒定，获得提取液，以5000r/min离心，过滤，重复3次，浓缩，加入甲醇溶解，过滤，定容至25mL，分别获得文冠果果壳样品溶液、文冠果嫩枝样品溶液、文冠果嫩叶样品溶液、文冠果种仁样品溶液备用；
步骤b，齐墩果酸标准品加甲醇溶解，充分溶解后得到0.2mg/mL的齐墩果酸标准品溶液，保存备用；吸取不同体积的齐墩果酸标准品溶液，分别加入5%香草醛-冰醋酸溶液，高氯酸，摇匀，水浴加热，立即冷却，加冰醋酸，在537nm处测定吸光度，记录数据，绘制标准曲线；取供试样品溶液加入甲醇溶液，在537nm处测定吸光度；
步骤c，将层析板加热活化并冷却后，吸取样液，均匀点样，以氯仿：丙酮=35:3(v/v)为文冠果果壳样品、文冠果嫩枝样品的展开剂，以氯仿：甲醇：水=40:2:1(v/v)为文冠果嫩叶样品的展开剂，以氯仿：丙酮=11:1(v/v)为文冠果种仁样品的展开剂，倒入层析缸，保温20min，上行展开，待展开剂前沿距层析板顶端0.8～1.2cm处时，取出晾干，选取10%硫酸乙醇溶液为显色剂，喷在晾干的层析板上，105℃保持，待其显色后取出，放入薄层色谱成像系统，于紫外波长365nm下，观察层析情况，系统拍照，并标志；
步骤d，用色谱甲醇和超纯水作为流动相，用微量进样器吸取10μL的标准品溶液，进样，对谱图进行分析、保存；将供试品层析板置于TLC-质谱接口上，使激光对准圈出的待测斑点中心处，取样，对谱图进行分析/保存；
步骤e，打开傅里叶红外光谱仪，测试背景，用毛细管吸取标准品溶液于点样中心处，测试样品，对红外谱图进行处理分析，轻刮层析板上的待测斑点置于烧杯中，加入色谱甲醇，过滤取滤液，待测液的红外检测方法与标准品的检测相同；
步骤f，取待测液分别测定旋光度和比旋光度，记录数据并计算平均值；
步骤g，将待测液加热蒸发至样品结晶，测量熔点。
下面通过实施例进行说明。
实施例：
步骤a，三萜类化合物的提取：
预处理：将文冠果果壳、嫩枝、嫩叶、种仁阴干，粉碎，过100目筛筛选，60～90℃下加入石油醚，料液比为1:10(w/v)，浸泡数小时后滤干，重复上述步骤3次，得到脱脂粉。
乙醇浸提：称取果壳脱脂粉、嫩叶脱脂粉各10g加入80%乙醇，称取嫩枝脱脂粉、种仁脱脂粉各10g加入70%乙醇，料液比为1:30(w/v)，恒温磁力搅拌器搅拌成悬浮液。
微波超声波萃取：超声波微波萃取仪分三阶段提取，时间为6min、7min、8min，温度为50℃、55℃、60℃，超声波功率恒定，超声波功率为750W、850W、950W，超声波频率为25KHz，模式15:10，电机转速900r/min，形成匀浆。
浓缩与定容：将上述匀浆以5000r/min离心10min，过滤，重复3次并合并滤液。设置温度为100℃，浓缩；加入甲醇溶解，过滤3次，定容至25mL，分别获得文冠果果壳样品溶液、文冠果嫩枝样品溶液、文冠果嫩叶样品溶液、文冠果种仁样品溶液备用。
步骤b，三萜类化合物的含量检测：
标准品的制备：精确称量2mg的齐墩果酸标准品，加甲醇溶解，充分溶解后定容到10mL，得到0.2mg/mL的标准品溶液，保存备用。
绘制标准曲线：分别吸取齐墩果酸标准品溶液50、100、200、400、800、1600μL转移至10mL试管中，待溶剂挥发尽，分别加入0.2mL5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8mL高氯酸，摇匀，在60℃恒温水浴加热15min，立即置于冰水流水冲洗，冷却，加5.0mL冰醋酸，以甲醇试剂作为空白，在537nm波长处测定吸光度，重复3次，记录数据；以横坐标为质量（X），纵坐标为吸光度（Y）绘制标准曲线。
检测含量：取供试样品溶液分别置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶液定容至刻度，在波长537nm处测定吸光度。
提取率=（实验前称取文冠果样品的质量-乙醇浸提量-最后蒸干所得的残渣质量）/文冠果样品的质量×100%
步骤c，薄层层析分离纯化：
点样：活化后的层析板冷却后，用玻璃毛细管缓慢吸取样液，均匀点样。样点呈圆点状，直径为2～4mm，点样基线距底边2.0cm，点间距离约为1.5～2.0cm。
展开：以氯仿：丙酮=35:3(v/v)为文冠果果壳样品、文冠果嫩枝样品的展开剂，以氯仿：甲醇：水=40:2:1(v/v)为文冠果嫩叶样品的展开剂，以氯仿：丙酮=11:1(v/v)为文冠果种仁样品的展开剂，保持层析缸温度为25℃，倒入展开剂，密封混匀，静置20min，将点样后的层析板放入层析缸，待展开剂前沿跑到距离层析板约1cm处时，取出层析板晾干。
显色：选取10%硫酸乙醇溶液为显色剂，将显色剂以雾状喷在晾干的层析板上，于105℃恒温保持，待其显色后取出。
成像：将显色的层析版放入薄层色谱成像系统，于紫外波长365nm下拍照观察层析情况，并拍照记录并标志。
计算Rf值：计算原点到斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离；
步骤d，薄层-质谱仪检测：
齐墩果酸标准品的质谱检测：用色谱甲醇和超纯水作为流动相，将Expressions质谱仪和软件打开使其处于工作状态，用微量进样器吸取10μL的齐墩果酸标准品溶液插入到进样口处，打到Load档开始进样，进完样后打回到Inject档；点开谱图界面对谱图进行分析并保存。
待测液的质谱检测：用色谱甲醇和超纯水作为流动相，使质谱仪和软件处于工作状态，将供试品层析板置于TLC-质谱接口上，使激光对准圈出的三萜类化合物斑点中心处，用软件操作进行取样，点开谱图界面对谱图进行分析并保存。通过二者质谱图的比对确定样品的分子信息。
步骤e，薄层-红外光谱仪检测：
齐墩果酸标准品的红外检测：打开傅里叶红外光谱仪选择相应的工作界面，用擦镜纸擦干净点样中心处，测试背景，用毛细管吸取少量的齐墩果酸标准品溶液于点样中心处，测试样品，对谱图界面出现的谱图进行处理分析。
待测样品溶液的红外检测：用小刀轻刮层析板上的画出的待三萜类化合物斑点置于烧杯中，在烧杯中加入5mL色谱甲醇，过滤取滤液，打开傅里叶红外光谱仪选择相应的工作界面，用擦镜纸擦干净点样中心处，测试背景，用毛细管吸取少量的待测液于点样中心处，测试样品，对谱图界面出现的红外谱图进行处理分析。
步骤f，比旋度、旋光度的测定：
通过对TLC的图谱色谱的分析，判定所分离的物质为有效分离，用甲醇校正旋光仪，分别倒入标准品、待测液于旋光仪，调节模式，测定旋光度和比旋光度，记录数据。
步骤g，熔点的测定；
取出一部分分离物用不锈钢电热板加热结晶，将待测液完全蒸发结晶，分别放入特制毛细管中，置入熔点仪中分别测量熔点，分别记录融化时温度。
结果分析：
1. 文冠果中三萜类化合物薄层色谱分析：
文冠果果壳样品中三萜类化合物薄层色谱分析：将齐墩果酸标准品溶液、文冠果果壳样品溶液，使用层析板展开，以氯仿：丙酮=35:3(v/v)为展开剂，如图2，文冠果果壳样品TLC图像展开效果良好，图像清晰。如图3，使用10%硫酸乙醇溶液显色后，日光检视均显紫红色斑点，在紫外光下，出现10个色谱斑点，较为明显的斑点有7个。其中有1个在层析板上的位置与齐墩果酸标准品位置一致，且斑点清晰，其Rf值为0.90。基本判断该色谱斑点为文冠果果皮样品溶液中含有的三萜类化合物。
文冠果嫩枝样品中三萜类化合物薄层色谱分析：将齐墩果酸标准品溶液、文冠果嫩枝样品溶液，使用层析板展开，以氯仿：丙酮=35:3(v/v)为展开剂，如图4，文冠果嫩枝样品TLC图像展开效果良好，图像清晰。如图5，使用10%硫酸乙醇溶液显色后，日光检视多显紫红色斑点，在紫外光下，出现11个色谱斑点，提取物质种类居多，较为明显的斑点有9个。其中有1个在层析板上的位置与齐墩果酸标准品位置一致，且斑点清晰，其Rf值为0.90。基本判断该色谱斑点为文冠果果皮样品溶液中含有的三萜类化合物。
在其他未知斑点中，在紫外下，显亮蓝色荧光的未知斑点有3个，推测可能为香豆素类化合物，呈红色未知斑点有2个，日光检视为绿色，初步判定其为绿色素，另外，3个未知斑点在喷10%硫酸乙醇显色后，均显现出微弱的紫红色，根据三萜类物质的显色特性，可初步判断为其他母核的三萜类化合物。1个未知斑点紫外下呈浅绿色，基本判断其为黄酮类化合物。
文冠果嫩叶样品中三萜类化合物薄层色谱分析：将齐墩果酸标准品溶液、文冠果嫩叶样品溶液，使用层析板展开，以氯仿：甲醇：水=40:2:1(v/v)为展开剂，如图6，文冠果嫩叶样品TLC图像展开效果良好，图像清晰，没有拖尾现象。使用10%硫酸乙醇溶液显色后，日光检视显紫红色斑点，在紫外光下，在层析板上的位置与齐墩果酸标准品位置一致，且斑点清晰，其Rf值为0.61，基本判断该色谱斑点为文冠果果皮样品溶液中另一种母核的三萜类化合物，判定其中含有的三萜类化合物。
文冠果种仁样品中三萜类化合物薄层色谱分析：将齐墩果酸标准品溶液、文冠果种仁样品溶液，使用层析板展开，以氯仿：丙酮=11:1(v/v)为展开剂，使用10%硫酸乙醇溶液显色后，日光检视均显紫红色斑点，符合三萜类物质的特征，如图7，在紫外光下，斑点颜色较浅，可能与种仁中三萜类物质含量较少有关。
2. 文冠果样品中三萜类物质含量及提取率分析：
计算得到文冠果不同部位的提取率如表1所示，其中嫩枝中三萜类物质提取率最高，为3.5%，其次是果壳，为2.8%，种仁中提取率为最低为2.2%。
表1 文冠果样品中三萜类物质的粗提取率（%）
果壳 嫩枝 嫩叶 种仁 平均提取率
粗提取率% 2.80 3.50 2.60 2.20 2.78
在波长537nm下测定不同浓度的标准品的吸光值，齐墩果酸质量分别在0.01mg、0.02mg、0.04mg、0.08mg、0.16mg、0.32mg时对应的吸光值分别为0.028、0.051、0.123、0.236、0.448、0.866，绘制标准曲线如图8所示，齐墩果酸在0.01～0.32mg质量范围内体现良好的线性关系。测定的回归方程结果显示为：
Y=2.6999X+0.0085，R2=0.9991；
在537nm波长处测定待测样液吸光度，测得，文冠果果壳、文冠果嫩枝、文冠果嫩叶、文冠果种仁中三萜类物质含量分别为1.39mg/100g、5.44mg/100g、2.66mg/100g、1.11mg/100g，平均值为2.67mg/100g。
3. 质谱检测分析：
齐墩果酸标准品的质谱检测分析：由图9，齐墩果酸标准品样液中存在质荷比m/z456.1和m/z437.0两个主要离子碎片。已知的齐墩果酸分子质量为456.0，与质谱仪打出的准分子离子峰456.1基本一致，相差不大。并且满足讨论范围内最强峰、氮律的必要条件，图中的另一个强峰为437.0，可基本推断其为[M+-H2O]，推测为被轰掉一个H2O后的碎片离子峰，符合正常的碎片丢失。
文冠果果壳样品的质谱检测分析：由图10，文冠果果壳样品中主要的强峰为m/z203、208、248。已知的，m/z203为[M+-COOH]，m/z248、208为齐墩果烷型三萜物质被轰碎的两个离子碎片，被轰掉一个COOH后的碎片离子峰，符合合理的碎片丢失，同时满足讨论范围内最强峰、氮律两个必要条件。也因此可以基本推断该物质为齐墩果烷型三萜类化合物。
文冠果嫩枝样品的质谱检测分析：由图11，进入质谱仪后被打成碎片，文冠果嫩枝斑点的主要离子碎片为m/z178.2、332.4、409.8、457.2。其中457.2与齐墩果酸标准品波谱中的456.1基本一致，可认定其为加氢峰[M+H]+。另一个强峰409.8则为[M-COOH]，符合合理的碎片丢失，同时满足讨论范围内最强峰、氮律两个必要条件。可以基本推断该物质为齐墩果烷型三萜类化合物。
文冠果嫩叶样品的质谱检测分析：由图12，m/z551.6为文冠果嫩叶样品的准分子离子峰，其满足讨论范围内最强峰、氮律、碎片丢失等三个必要条件，相邻的碎片离子峰为m/z550.9，所以被轰击的碎片为H，即[M-H]，符合正常的碎片丢失。已知的，m/z551.6是一种三萜类物质的相对分子质量。将文冠果嫩叶样品与齐墩果酸标准品对比分析，m/z248和m/z208为齐墩果酸456轰击成的两个离子碎片，m/z189.0为m/z208-[H-H2O]，属于合理的碎片丢失。基本推断该物质为齐墩果烷型三萜类化合物。
文冠果种仁样品的质谱检测分析：由图13，将文冠果种仁样品与齐墩果酸标准品比对发现，m/z437.0为齐墩果酸m/z456被轰击掉一个H2O后的碎片离子峰，即[M-H2O]，相邻的碎片离子峰m/z411.0则为[M-COOH]的碎片离子峰，符合合理的碎片丢失。基本推断该物质为齐墩果烷型三萜类化合物。
综上所述，文冠果果壳、嫩枝、嫩叶和种仁所含分子离子峰与齐墩果酸标准品基本相符，认定为齐墩果烷型三萜类化合物。
4. 红外检测分析：
不同的有机官能团在红外光谱扫描过程中会具有其特定的吸收峰，三萜类化合物的红外光谱主要在A区（1392～1355cm-1）和B区（1330～1245cm-1）两个区域。另外，三萜类化合物分子中主要含有OH，CH2，CH3，C=O，C=C等基团，因而在3300～3450cm-1，1050cm-1左右有强的羟基吸收峰。同时三萜类化合物在2600～2400cm-1有弱吸收峰，当羧酸被酯化以后这一吸收峰消失，在1720～1730cm-1会出现酯的吸收峰。由图14，齐墩果酸标准品的Ａ区有两个峰（1392～1379cm-1，1370～1355cm-1）；B区有三个峰（1330～1315cm-1，1306～1299cm-1，1269～1250cm-1）。
由图15可知，文冠果果壳样品中在3417cm-1、2922cm-1、1603cm-1处有明显的吸收峰，说明其含有羟基、羧基、羰基。在1375cm-1、1367cm-1和1251cm-1处有吸收峰，处于三萜类化合物A区（1392～1355cm-1）和B区（1330～1245cm-1）的范围内，符合三萜类化合物红外光谱特征，同时也符合齐墩果烷型三萜物质的吸收光谱特征，说明文冠果果壳中含有齐墩果烷型三萜类化合物。
由图16，文冠果嫩枝样品在3385cm-1、2925cm-1、2854cm-1、1688cm-1、1643cm-1有主要吸收峰，分别可以推断出该分子含有羟基、羰基和羧基。1688cm-1的吸收峰显示了六元环酮的存在，表明在母环上的A环或B环上可能存在羰基。同时，在1384cm-1、1365cm-1处和1305cm-1、1274cm-1处有吸收峰，处于三萜类化合物A区（1392～1355cm-1）和B区（1330～1245cm-1）的范围内，符合三萜类化合物红外光谱特征，并且符合齐墩果烷型三萜类物质的主要特质。说明文冠果嫩枝中含有齐墩果烷型三萜类化合物。
由图17，文冠果嫩叶样品的主要吸收峰有3356cm-1、2963cm-1、2184cm-1、1648cm-1、1634cm-1、1373cm-1、1316cm-1、1265cm-，分别可以推断出该提取物含有-OH、C=O、-COOH和C=C。在3400cm-1、1650cm-1、1400cm-1处的吸收峰说明有类似苯环的结构存在；在1650cm-1、1400cm-1左右处有吸收峰，为苯环的骨架振动。同时该提取物在1376cm-1处和1316cm-1、1265cm-1处有吸收峰，处于三萜类化合物A区（1392～1355cm-1）和B区（1330～1245cm-1）的范围内，符合三萜类化合物红外光谱特征，说明文冠果嫩叶中有三萜类化合物的存在。
由图18，文冠果种仁样品具有3310cm-1、2948cm-1、1652cm-1等主要吸收峰，与齐墩果酸标准品红外光谱出现的吸收峰基本一致，说明种仁提取物中所含主要官能团与标准品一致，在三萜类化合物的红外光谱的主要区域B区（1330～1245cm-1）中1319cm-1处有吸收峰，符合三萜类化合物红外光谱特征。同时该提取物以推断出文冠果种仁中同样含有三萜类物质。
综上，在文冠果样品中，在3400cm-1、1650cm-1、1400cm-1处有吸收峰，说明有类似苯环的结构存在；在1650cm-1、1400cm-1处有吸收峰，为苯环的骨架振动；在3400cm-1处有强吸收峰，说明有-OH存在，这符合三萜类化合物的分子结构特征。文冠果果壳、嫩枝、嫩叶、种仁样品红外光谱图与齐墩果酸标准品的图谱出现的吸收峰基本一致，主要的吸收峰出现位置都相同，说明样品分子中的主要官能团与齐墩果酸标准品一致。但是出现其余峰不明显的原因，可能样品不纯存在关系，其他杂质干扰产生峰迁移的现象。
5. 三萜类化合物的旋光度、比旋光度分析：
参考表2，测得文冠果果壳、嫩枝、嫩叶和种仁样品的旋光度和比旋光度在+62.391°和+58.930°左右，与齐墩果酸标准品基本相符。
表2 文冠果中三萜类物质的旋光度、比旋光度值
次数 1 2 3 平均值
果壳 旋光度 +63.029° +62.091° +62.091° +62.391°
果壳 比旋光度 +59.245° +59.245° +58.953° +59.067°
嫩枝 旋光度 +60.133° +60.133° +61.087° +60.447°
嫩枝 比旋光度 +58.766° +58.766° +59.131° +58.930°
嫩叶 旋光度 +61.453° +61.453° +61.941° +61.461°
嫩叶 比旋光度 +59.354° +59.354° +58.733° +58.963°
种仁 旋光度 +63.658° +63.658° +62.929° +63.199°
种仁 比旋光度 +59.597° +59.071° +59.071° +59.208°
6.熔点分析：
将色谱斑点溶解后过滤，使用熔点测定仪分别测出熔点，其中文冠果果壳的熔点为279℃，嫩枝熔点为286℃，嫩叶的熔点为275℃，种仁的熔点为272℃。与三萜类化合物的熔点在270℃～290℃之间也基本吻合。
结论：
本发明是以文冠果不同部位为原料，加入料液比为1:30(w/v)的80%乙醇，于微波超声波组合萃取仪处理，获得提取液并计算得到，文冠果果壳、嫩枝、嫩叶和种仁的提取率（%）分别是：2.8%、3.5%、2.6%和2.2%，平均提取率为2.78%；三萜化合物总含量分别为1.39mg/100g、5.44mg/100g、2.66mg/100g、1.11mg/100g。平均含量为2.67mg/100g。以氯仿：丙酮=35:3(v/v)为文冠果果壳样品、文冠果嫩枝样品的展开剂，以氯仿：甲醇：水=40:2:1(v/v)为文冠果嫩叶样品的展开剂，以氯仿：丙酮=11:1(v/v)为文冠果种仁样品的展开剂，经薄层分离纯化后，展开效果良好，图像清晰，得到清晰的斑点，均出现紫红色斑点，与齐墩果酸标准品色谱斑点位置一致，其Rf值基本一致。
文冠果果壳、嫩枝、嫩叶和种仁样液的碎片离子峰与齐墩果酸标准品的碎片离子峰（m/z：208和248）基本相符，被轰击后的离子碎片符合合理的碎片丢失。另外，质谱图中除包含与齐墩果酸相符的碎片离子峰外，存在其他多个碎片离子峰或者基峰。推测原因：1.选择的离子源不合适，导致打出的碎片杂多；2.在电轰击过程中，产生了成倍的碎片离子峰；3.分离纯化程度不够，进入质谱的样液尚存在杂质。三萜类化合物分子中主要含有OH，CH2，CH3，C=O，C=C等基团，目标斑点的红外检测有其对应的吸收峰出现，与齐墩果酸比对发现，文冠果中三萜类化合物均符合齐墩果烷型的吸收峰的特征，可基本判断文冠果中的三萜类化合物主要为齐墩果烷型。红外图谱中，洗脱物的特征峰除与对照品一致外，还有其他峰，但峰面积较小，影响较小，分析可能是TLC分离物中还有些许杂质，或者是以齐墩果酸为母核以外的结构。文冠果果壳、嫩枝、嫩叶和种仁样液的分子离子峰和所含官能团与齐墩果酸标准品基本相符，均具有三萜类化合物的分子结构特征，其旋光度为+63.625°，熔点在270～290℃范围内，可证明了从文冠果中提取的物质为三萜类化合物。
本发明是以文冠果果壳、嫩枝、嫩叶和种仁为原料，采用集分离、纯化和检测于一体的TLC-CMS技术，省去了从层析板上手动刮点、萃取、重组，在质谱上注射分析，耗时耗力获取质谱图的过程。Plate ExpressTM技术可直接从TLC薄层板上获取质谱图，不经过样品前处理，可快速从复杂混合物中获得目标物分子质量信息，并对其进行鉴定。采用回流法结合微波超声波组合萃取仪辅助处理从文冠果中获得三萜类化合物提取液，利用紫外分光光度计测定吸光度，计算测得含量及提取率，再经过质谱仪检测，红外光谱仪检测，使用自动旋光仪，熔点仪等进行检验。本发明提供的方法提取率高，分离效果较好，纯度高，结果准确，是一种有效的提取文冠果中三萜类化合物的方法。

Claims (2)

1.一种文冠果中三萜类化合物提取检验与含量测定的方法，其特征在于，以文冠果不同部位为原料，采用超声波微波萃取对三萜类化合物进行粗提取，测定不同浓度下标准品的吸光度，绘制得到标准曲线，计算含量及提取率，经薄层层析法分离，利用质谱仪测定样品分子量信息，用红外检测其官能团，测定旋光度、比旋光度和熔点；具体为：以文冠果不同部位为原料，粉碎筛选，脱脂，加入乙醇，超声波微波萃取仪分阶段提取，离心过滤，浓缩，加入甲醇溶解，过滤，定容至25mL，分别获得文冠果不同部位样品溶液备用，利用紫外分光光度计测定不同浓度下标准品的吸光度，绘制得到标准曲线，并计算样品中三萜类化合物含量及提取率，利用质谱仪测定样品分子量信息，用红外检测其官能团，利用旋光仪测定旋光度和比旋光度，蒸发结晶测定熔点。
2.根据权利要求1所述的一种文冠果中三萜类化合物提取检验与含量测定的方法，其特征在于，该具体过程为：
步骤a，以文冠果果壳、嫩枝、嫩叶和种仁为原料，粉碎筛选，脱脂，取粉末分别加入乙醇，超声波微波萃取仪分阶段提取，超声波功率恒定，获得提取液，以5000r/min离心，过滤，重复3次，浓缩，加入甲醇溶解，过滤，定容至25mL，分别获得文冠果果壳样品溶液、文冠果嫩枝样品溶液、文冠果嫩叶样品溶液、文冠果种仁样品溶液备用；
步骤b，齐墩果酸标准品加甲醇溶解，充分溶解后得到0.2mg/mL的齐墩果酸标准品溶液，保存备用；吸取不同体积的齐墩果酸标准品溶液，分别加入5%香草醛-冰醋酸溶液，高氯酸，摇匀，水浴加热，立即冷却，加冰醋酸，在537nm处测定吸光度，记录数据，绘制标准曲线；取供试样品溶液加入甲醇溶液，在537nm处测定吸光度；
步骤c，将层析板加热活化并冷却后，吸取样液，均匀点样，以氯仿：丙酮=35:3(v/v)为文冠果果壳样品、文冠果嫩枝样品的展开剂，以氯仿：甲醇：水=40:2:1(v/v)为文冠果嫩叶样品的展开剂，以氯仿：丙酮=11:1(v/v)为文冠果种仁样品的展开剂，倒入层析缸，保温20min，上行展开，待展开剂前沿距层析板顶端0.8～1.2cm处时，取出晾干，选取10%硫酸乙醇溶液为显色剂，喷在晾干的层析板上，105℃保持，待其显色后取出，放入薄层色谱成像系统，于紫外波长365nm下，观察层析情况，系统拍照，并标志；
步骤d，用色谱甲醇和超纯水作为流动相，用微量进样器吸取10μL的标准品溶液，进样，对谱图进行分析、保存；将供试品层析板置于TLC-质谱接口上，使激光对准圈出的待测斑点中心处，取样，对谱图进行分析/保存；
步骤e，打开傅里叶红外光谱仪，测试背景，用毛细管吸取标准品溶液于点样中心处，测试样品，对红外谱图进行处理分析，轻刮层析板上的待测斑点置于烧杯中，加入色谱甲醇，过滤取滤液，待测液的红外检测方法与标准品的检测相同；
步骤f，取待测液分别测定旋光度和比旋光度，记录数据并计算平均值；
步骤g，将待测液加热蒸发至样品结晶，测量熔点。
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