CN108709788A - 采用一测多评法测定姜药材提取物中姜辣素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用一测多评法测定姜药材提取物中姜辣素含量的方法，通过超高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测器及紫外检测器的分离分析技术，借助一测多评方法，采用试样中不存在的性能稳定且易得的纯物质N‑香草基壬烷酰胺对照品作为内参物，建立该组分与试样中4个姜辣素组分之间的相对校正因子，通过校正因子计算，实现对姜药材提取物中的4个姜辣素组分的含量进行测定。本发明操作简单，灵敏度高，准确高效，成本低廉，可以客观，准确的评价姜药材提取物的品质，并用于质量控制，可解决因对照品缺乏而无法客观、合理地控制姜药材提取物质量的问题，对控制质量和保证疗效具有重要意义。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种采用一测多评法测定姜药材提取物中姜辣素含量的方法。
背景技术
姜(Zingiber officinal Rosc)别名生姜、干姜、白姜、均姜，属姜科(Zingiberaceae)姜属多年生草本植物，在我国主要分布于西南部至东南部区域。姜的組分多而复杂，具有独特的芳香风味和辛辣口感，这种独特的感官品质主要来源于两类有效成分：挥发性的姜精油和不具有挥发性的姜辣素，姜精油为姜提供独特的芳香风味；姜辣素为姜提供独特的辛辣口感。不同产地的姜因生长环境不同其药性和功效也有一定差异，研究发现，姜具有独特的药用和食用价值，祖国传统医药学认为，姜乃药中佳品，主治风寒感冒、喘咳、呕吐、痰饮、胀满、泄泻等。其始载于《神农本草经》，味辛，性热，归脾、胃、肾、心、肺经，具有温中散寒，回阳通脉，燥湿消痰等功效。现代药理学研究表明，生姜和干姜均具有抗氧化，抗炎，抗菌，抗肿瘤，抗溃疡，抗胃肠道出血，胃黏膜保护，改善局部血液循环等多种药理作用。有研究采用HPLC-UV技术建立了干姜中姜酚的分析方法，但所测定指标对照品分离制备难度大，分析成本高，作为姜药材质量控制方法不易广泛应用，另有报道采用HPLC-UV-ES-MS技术对生姜甲醇提取物及姜油树脂提取物进行分离分析，鉴定出多种姜辣素组分，提供了一个有价值的姜提取物的指纹图谱信息，但并未对其主成分进行准确的筛选和定量测定，而且多种成分并不能仅仅基于质谱信息进行准确识别。截止目前，2015版《中国药典》收载的用于姜药材(包括生姜和干姜)分析评价方法，以6-姜辣素作为干姜质量控制指标，以6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚作为生姜的质量控制指标，这些指标少且单一，分析时间长，不能全面反映姜药材及饮片的内在品质，而且目前6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚等对照品难以获得，价格高昂，限制了多指标成分质量控制的实际应用。
一测多评法是一种适合中药特点的多指标质量评价的新模式，它利用有效化学成分间内在的函数和比例关系，只测定1个成分(对照品易得到)来实现多个成分(对照品难以得到或无)的同步监控，克服对照品短缺这一问题，即只测定其中某个代表性成分或试样中不存在且性能相近的成分(易得、廉价、稳定、有效)，同时可计算出其他待测有效成分的含量。
因此，开发一种操作简单，检测灵敏度高，成本低廉，准确高效，且可同时定量分析多种活性成分的质量控制方法(一测多评法)，对于姜药材提取物的质量控制具有重要的现实意义。
发明内容
基于现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种采用一测多评法测定姜药材提取物中姜辣素含量的方法，采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱和紫外检测器，通过一测多评技术，采用试样中不存在且性能相近、稳定易得的纯物质N-香草基壬烷酰胺(合成辣椒碱)对照品作为内参物，建立该组分与6-姜烯酚、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的相对校正因子，通过校正因子计算姜药材提取物中多种姜辣素组分的含量。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种采用一测多评法测定姜药材提取物中姜辣素含量的方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
分别精密称定N-香草基壬烷酰胺、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚5种对照品，用甲醇溶解稀释，制得各单一对照品储备液，然后量取单一对照品储备液，用甲醇稀释混匀，制得混合对照品标准溶液；同时，配制质量浓度分别为CoL及CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液，CoL小于CoH；将混合对照品标准溶液及N-香草基壬烷酰胺标准溶液冷冻避光保存；
(2)供试品溶液的制备
直接取姜药材提取物，加入步骤(1)制得的N-香草基壬烷酰胺对照品储备液或N-香草基壬烷酰胺标准溶液，混合并用溶剂定容，得到供试品溶液；
或者将姜药材提取物用50％～100％甲醇稀释，得到提取物母液，再取提取物母液，加入步骤(1)制得的N-香草基壬烷酰胺对照品储备液或N-香草基壬烷酰胺标准溶液，混合并用溶剂定容，得到供试品溶液；
供试品溶液中N-香草基壬烷酰胺的含量为0.05～1.00μg/mL；
(3)相对校正因子fox和相对保留时间RtR的计算
用UPLC-MS-DAD进行测定，进样系列浓度的步骤(1)制备得到的混合对照品标准溶液，获得TIC色谱图和MRM色谱图并进行峰面积积分，选取N-香草基壬烷酰胺为内参化合物，分别计算混合对照品标准溶液中N-香草基壬烷酰胺对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的相对校正因子fox和相对保留时间RtR；
所述校正因子fox的计算公式为：
式中：Ao为内参物N-香草基壬烷酰胺对照品的峰面积，Co为内参物N-香草基壬烷酰胺对照品的质量浓度，Ax为被测组分对照品x的峰面积，Cx为被测组分对照品x的质量浓度；
所述相对保留时间RtR的计算公式为：
式中：tRx为被测组分对照品x的保留时间，tRo为内参物N-香草基壬烷酰胺对照品的保留时间；
(4)供试品中活性成分的测定
取步骤(1)制备得到的N-香草基壬烷酰胺标准溶液及步骤(2)制备得到的供试品溶液进样，用UPLC-MS-DAD进行测定，获得TIC色谱图和MRM色谱图，按公式计算供试品溶液中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的质量浓度；
上述的公式为：
C'x＝(CxL'+CxH')/2
式中：Cx’为供试品溶液中被测定组分x的质量浓度，CxL’为供试品溶液中被测定组分x相对于浓度为CoL的N-香草基壬烷酰胺标准溶液所计算出的质量浓度，CxH’为供试品溶液中被测定组分x相对于浓度为CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液所计算出的质量浓度，Ax’为供试品溶液中被测组分x的峰面积，AoL为CoL浓度N-香草基壬烷酰胺标准溶液的峰面积，AoH为CoH浓度N-香草基壬烷酰胺标准溶液的峰面积，fox为步骤(3)所得N-香草基壬烷酰胺对被测组分的相对校正因子，N为浓度影响因数。
优选地，步骤(3)及步骤(4)所述UPLC测定的条件为：色谱柱为反相C18色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，以体积浓度为0.02～0.2％甲酸的水溶液或体积浓度0.02～0.2％乙酸的水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，流速为0.4～0.6mL/min，检测波长为280nm±2nm；柱温35℃，进样量为2.0～10.0μL。
进一步，所述梯度洗脱的程序为：
更优地，色谱柱选用型号为Eclipse Plus C18色谱柱(100×4.6mm,3.5μm)；流动相由流动相A和流动相B组成，以体积浓度为0.1％甲酸的水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，流速为0.5mL/min。
优选的，步骤(2)中所述溶剂由流动相A和流动相B按照梯度洗脱初始比例混匀而成。
优选地，步骤(3)及步骤(4)所述MS测定的条件为：离子源为ESI，检测方式为MRM多反应监测，扫描模式为正离子模式，雾化气压力为275.8～379.2kPa，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10～12L/min，毛细管电压为4.0kV。
优选地，步骤(3)及步骤(4)所述MS测定的条件参数包括：
采用MRM方式检测的N-香草基壬烷酰胺，6-姜酚，8-姜酚，10-姜酚，6-姜烯酚的用于定性定量分析的离子对，驻留时间、碰撞能量及碎裂电压为：
其中，所述MS测定的条件还包括：用于定量分析的离子对：N-香草基壬烷酰胺294.1→137.0、6-姜酚277.1→177.1、8-姜酚305.1→177.1、10-姜酚333.2→177.1、6-姜烯酚277.1→137.0。用于定性分析的离子对：N-香草基壬烷酰胺294.1→122.0、6-姜酚277.1→145.0、8-姜酚305.1→117.1、10-姜酚333.2→145.0、6-姜烯酚277.1→94.1。
优选地，步骤(2)所述姜药材提取物为姜药材通过水蒸馏法、超临界法或亚临界法所得到的挥发油提取物。
本发明采用N-香草基壬烷酰胺对照品作为内参物进行一测多评法的建立，因其与待测组分结构相似，极性相近，性能稳定且试样中不存在，与天然辣椒素相比更加廉价易得，具有镇疼、消炎、杀菌、祛风湿等功效，更加环保、经济，因此最终优选合成N-香草基壬烷酰胺作为内标物。
本发明所测定的姜辣素组分其结构相似，紫外检测响应灵敏度较低，经UPLC分离，进入MS检测分析，灵敏度较高，经比较不同流动相体系，对其分离效果的影响，优选出以甲酸或乙酸的水溶液为水相(流动相A)，乙腈为有机相(流动相B)较适宜于上述成分的分离。
不同品牌色谱柱对上述化合物的分离效能影响也较大，经大量实验筛选以及采用超高效液相分离技术，最终选择分析速度更快的Eclipse Plus C18色谱柱(100×4.6mm,3.5μm)较为理想，并且本发明还通过大量实验筛选了流动相的流速，研究发现，低流速有助于提高上述化合物的离子化效率，提高检测灵敏度，还能节省溶剂，降低成本，综合考虑最终确认以0.5mL/min的流速最为适宜。
本发明针对姜辣素组分为姜药材中含有的主成分之一，采用一测多评技术建立同时测定姜药材提取物中4种含量相对较高且具有代表性的姜辣素组分化合物的方法。在建立相对校正因子时，分别比较了直接以定量离子峰面积和进样量计算相对校正因子，以及取峰面积和进样量的对数进行计算的两种相对校正因子计算方法。结果表明，若直接采用峰面积和进样量的计算方法，所得的校正因子相对标准偏差值较大，而采用峰面积和进样量的对数进行计算时，RSD值均小于5％，最终优选为选择峰面积和进样量的对数值进行校正因子的计算。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：本发明根据姜药材中活性成分与杂质成分的结构特点，通过大量实验优选出超高效液相色谱和质谱分析条件，采用试样中不存在的性能稳定且廉价易得的纯物质N-香草基壬烷酰胺对照品作为内参物进行一测多评法的建立，测定其与6-姜烯酚、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的相对校正因子，并计算4种姜辣素组分含量。该方法操作简单，灵敏度高，准确高效，成本低廉，可以客观，准确的评价姜药材提取物的品质，并用于质量控制，可解决因对照品缺乏而无法客观、合理地控制姜药材提取物质量的问题，对控制质量和保证疗效具有重要意义。
附图说明
图1是实施例1所述混合对照品标准溶液的TIC和MRM谱图；
图2是实施例1所述供试品溶液2(水蒸馏)的TIC和MRM谱图；
图3是实施例2所述供试品溶液2(超临界)的TIC和MRM谱图；
图4是实施例3所述供试品溶液2(亚临界)的TIC和MRM谱图。
具体实施方式
为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明，但所述实施例旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
下述实施例中所用仪器包括：Agilent QQQ 6460C-1290UPLC超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪(美国安捷伦科技有限公司)、AUW220D型电子分析天平(日本Shimadzu公司)、ME204/十万分之一天平(瑞士梅特勒-托利多)、QL-901型涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、移液枪：100μL、200μL、1000μL(Eppendorf)。
下述实施例中所用材料及供试样品包括：对照品6-姜酚(CAS：23513-14-6，98.27％)，批号为PCL-G432，购于英国PCL；对照品8-姜酚(CAS：23513-08-8，93.8％)，10-姜酚(CAS：23513-15-7，97.1％)，批号分别为111994-201501和111993-201601，均购于中国食品药品检定研究院；对照品6-姜烯酚(CAS：555-66-8，98.20％)，批号为16122601，购于成都普菲德生物技术有限公司；对照品N-香草基壬烷酰胺(CAS：2444-46-4，≥98％)，批号为wkq16090106，购于四川维克奇生物科技有限公司；甲醇、乙腈(LC/MS级别，FisherScientific)；甲酸(LC/MS级，Fisher Scientific)；超纯水(娃哈哈矿泉水)。选自不同产地的姜：张良姜、安徽姜、山东大姜、山东小姜，并挑选完整、无虫病害的姜作为试验原料，其中，鲜姜指未发汗生姜，干姜指干燥的姜。
实施例1
采用一测多评法测定姜药材提取物中姜辣素含量的方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
分别精密称定N-香草基壬烷酰胺、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚5种对照品，用甲醇溶解稀释，制得各单一对照品储备液；其中，N-香草基壬烷酰胺对照品储备液的浓度为509.60μg/mL，6-姜酚对照品储备液的浓度为552.72μg/mL，8-姜酚对照品储备液的浓度为806.68μg/mL，10-姜酚对照品储备液的浓度为592.31μg/mL，6-姜烯酚对照品储备液的浓度为509.60μg/mL。
然后分别量取上述单一对照品储备液，用甲醇稀释、混匀，制得混合对照品标准溶液，混合对照品标准溶液中N-香草基壬烷酰胺、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚的浓度分别为50.960、55.272、80.668、59.231、50.960μg/mL；同时，配制质量浓度分别为CoL及CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液，CoL为10.20μg/mL、CoH为50.96μg/mL；将混合对照品标准溶液及N-香草基壬烷酰胺标准溶液于-20℃冰箱中避光保存。
(2)供试品溶液的制备
取鲜姜洗净，趁鲜切片，于50℃烘干并粉碎，过50目筛，得到干姜粉末；精密称取干姜粉末50.0g，置于圆底烧瓶中，按照料液比1:14加入水作为溶剂，蒸馏提取约5h，得水蒸馏法挥发油提取物。
精密称取水蒸馏法挥发油提取物0.02g(精确到0.00001g)于5.0mL容量瓶中，然后加入0.05mL步骤(1)所制备浓度为CoL的N-香草基壬烷酰胺标准溶液，用溶剂(由0.1％甲酸的水溶液和乙腈按照体积比80∶20混匀而成)定容，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过后，即得供试品溶液1(水蒸馏)。
精密称取水蒸馏法挥发油提取物0.02g(精确到0.00001g)于5.0mL容量瓶中，然后加入0.05mL步骤(1)所制备浓度为CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液，用溶剂(由0.1％甲酸的水溶液和乙腈按照体积比80∶20混匀而成)定容，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过后，即得供试品溶液2(水蒸馏)。
其中，鲜姜分别采用张良姜、安徽姜、山东大姜及山东小姜。
(3)相对校正因子fox和相对保留时间RtR的计算
采用UPLC-MS-DAD(超高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测器及紫外检测器)进行测定，参数设置如下：
1)UPLC条件
色谱柱：Eclipse Plus C18柱(100×4.6mm,3.5μm)
流速：0.5mL/min
柱温：35℃
检测波长：280nm±2nm
流动相：0.1％甲酸的水溶液(A)——乙腈(B)
梯度洗脱：
2)MS条件
离子源：ESI，检测方式：多反应监测(MRM)，正离子模式(Positive)扫描；干燥气温度：350℃；雾化气压力：275.8kPa；干燥气流速：10L/min；毛细管电压：4.0kV。采用MRM方式检测的N-香草基壬烷酰胺，6-姜酚，8-姜酚，10-姜酚，6-姜烯酚的用于定性定量分析的离子对，驻留时间、碰撞能量及碎裂电压为：
其中，N-香草基壬烷酰胺、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚用于定量分析的离子对分别为：294.1([M+H]+)→137.0，277.1([M-H2O+H]+)→177.1，305.1→177.1([M-H2O+H]+)，333.2→177.1([M-H2O+H]+)和277.1→137.0。
6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚在优化过程中，较易得到[M+Na]+、[M+K]+，不易得到[M+H]+离子峰，即使出现[M+H]+离子峰，但是丰度较低，不易得到二级碎片离子，而[M+Na]+，[M+K]+离子丰度虽然较高，但是二级碎片也难以得到，满足不了后期定性定量要求，经过大量试验分析发现，[M-H2O+H]+离子峰丰度较强，且能准确地分析待测成分，并得到对应的二级碎片离子，故而选择[M-H2O+H]+离子作为定性定量母离子，并进行优化，筛选定性定量子离子。经优化得出每个化合物对应的四个子离子分别为：N-香草基壬烷酰胺137.0、122.0、94.1、141.1；6-姜酚177.1、145.0、117.1、137.0；8-姜酚177.1、145.0、117.1、115.0；10-姜酚117.1、145.0、117.1、137.0；6-姜烯酚137.0、94.1、122.0、106。其中，筛选一个丰度最高的作为定量离子，一个较高的作为定性离子。即得出：N-香草基壬烷酰胺、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚用于定量分析的离子对分别为：294.1→137.0、277.1→177.1、305.1→177.1、333.2→177.1、277.1→137.0；N-香草基壬烷酰胺、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚用于定性分析的离子对分别为：294.1→122.0、277.1→145.0、305.1→117.1、333.2→145.0、277.1→94.1。
首先，取步骤(1)混合对照品标准溶液，进样0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0μL，进行UPLC-MS-DAD检测，获得MRM色谱图和TIC色谱图，如图1所示；进行峰面积积分，所得线形关系、相关系数及检出限如下：
选取N-香草基壬烷酰胺为内参化合物，按照公式计算相对校正因子和相对保留时间。
所述校正因子fox的计算公式为：
式中：Ao为内参物N-香草基壬烷酰胺对照品的峰面积，Co为内参物N-香草基壬烷酰胺对照品的质量浓度，Ax为被测组分对照品x的峰面积，Cx为被测组分对照品x的质量浓度；
所述相对保留时间RtR的计算公式为：
式中：tRx为被测组分对照品x的保留时间，tRo为内参物N-香草基壬烷酰胺对照品的保留时间。
结合峰面积数据，分别计算N-香草基壬烷酰胺对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的相对校正因子fox和RtR，结果见表1。
表1N-香草基壬烷酰胺对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚及6-姜烯酚的相对校正因子fox和RtR
(4)供试品中活性成分的测定
取步骤(1)制备得到的N-香草基壬烷酰胺标准溶液(浓度分别为CoL及CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液)及步骤(2)制备得到的供试品溶液(供试品溶液1及供试品溶液2)，进样5μL，用UPLC-MS-DAD进行测定，获得TIC色谱图和MRM色谱图，如图2所示；按公式计算供试品溶液中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的质量浓度；
上述的公式为：
C'x＝(CxL'+CxH')/2
式中：Cx’为供试品溶液中被测定组分x的质量浓度，CxL’为供试品溶液中被测定组分x相对于浓度为CoL的N-香草基壬烷酰胺标准溶液所计算出的质量浓度，CxH’为供试品溶液中被测定组分x相对于浓度为CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液所计算出的质量浓度，Ax’为供试品溶液中被测组分x的峰面积，AoL为CoL浓度N-香草基壬烷酰胺标准溶液的峰面积，AoH为CoH浓度N-香草基壬烷酰胺标准溶液的峰面积，fox为步骤(3)所得N-香草基壬烷酰胺对被测组分的相对校正因子，N为浓度影响因数。
分别计算得到供试品溶液1与供试品溶液2中被测定组分含量后，再对同一被测组分的含量取平均值，即得供试品中活性组分的最终测定值。
实施例2
采用一测多评法测定姜药材提取物中姜辣素含量的方法，按照实施例1的步骤，不同之处仅在于，步骤(2)供试品溶液的制备不同。
供试品溶液的制备具体如下：
取鲜姜洗净，趁鲜切片，于50℃烘干并粉碎，过50目筛，得到干姜粉末；称取175g干姜粉末置于超临界CO2萃取装置中，于40psi压力条件下，分别以35℃提取2h，45℃提取3h，55℃提取5h，得(三个)超临界法挥发油提取物。
精密称取超临界法挥发油提取物0.02g(精确到0.00001g)于5.0mL容量瓶中，用50％甲醇的水溶液提取定容，然后再用50％甲醇的水溶液稀释50倍后，取1mL，转移至10mL量瓶中，加入0.1mL步骤(1)所制备浓度为CoL的N-香草基壬烷酰胺标准溶液，用溶剂(由0.1％甲酸的水溶液和乙腈按照体积比80∶20混匀而成)定容，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过后，即得供试品溶液1(超临界)。
精密称取超临界法挥发油提取物0.02g(精确到0.00001g)于5.0mL容量瓶中，用50％甲醇的水溶液提取定容，然后再用50％甲醇的水溶液稀释50倍后，取1mL，转移至10mL量瓶中，加入0.1mL步骤(1)所制备浓度为CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液，用溶剂(由0.1％甲酸的水溶液和乙腈按照体积比80∶20混匀而成)定容，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过后，即得供试品溶液2(超临界)。
其中，鲜姜采用张良姜。
实施例3
采用一测多评法测定姜药材提取物中姜辣素含量的方法，按照实施例1的步骤，不同之处仅在于，步骤(2)供试品溶液的制备不同。
供试品溶液的制备具体如下：
取鲜姜洗净，趁鲜切片，于50℃烘干并粉碎，过50目筛，得到干姜粉末；取20kg鲜姜或干姜粉末置于亚临界萃取装置中，以丁烷为夹带剂，40℃提取4h，得亚临界法挥发油提取物。
精密称取亚临界法挥发油提取物0.02g(精确到0.00001g)于5.0mL容量瓶中，用50％甲醇的水溶液提取定容，然后再用50％甲醇的水溶液稀释50倍后，取1mL，转移至10mL量瓶中，加入0.1mL步骤(1)所制备浓度为CoL的N-香草基壬烷酰胺标准溶液，用溶剂(由0.1％甲酸的水溶液和乙腈按照体积比80∶20混匀而成)定容，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过后，即得供试品溶液1(亚临界)。
精密称取亚临界法挥发油提取物0.02g(精确到0.00001g)于5.0mL容量瓶中，用50％甲醇的水溶液提取定容，然后再用50％甲醇的水溶液稀释50倍后，取1mL，转移至10mL量瓶中，加入0.1mL步骤(1)所制备浓度为CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液，用溶剂(由0.1％甲酸的水溶液和乙腈按照体积比80∶20混匀而成)定容，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过后，即得供试品溶液2(亚临界)。
其中，鲜姜采用张良姜。
实施例1～3的测定结果如表2所示。
表2 一测多评法(QAMS)与外标法含量测定结果比较(mg/g)
注：a：水蒸馏提取张良姜，b：水蒸馏提取安徽姜，c：水蒸馏提取山东大姜，d：水蒸馏提取山东小姜，e：35℃超临界提取张良姜2h，f：45℃超临界提取张良姜3h，g：55℃超临界提取张良姜5h，h：亚临界提取张良姜干姜，k：亚临界提取张良姜鲜姜。
以上实验结果表明，本发明提供的一种采用一测多评法测定姜药材提取物中姜辣素含量的方法操作简单、灵敏度高、准确高效、成本低廉，可以客观、准确地评价姜药材提取物的品质，并用于质量控制，并且实验对比结果表明，与外标法检测结果准确性相当，但本发明采用一测多评法更加高效、快捷，并且采用试样中不存在N-香草基壬烷酰胺作为内参物，性能相近、稳定且容易获取，更加经济。
本发明通过大量实验优选出最佳的流动相梯度洗脱、流速、色谱柱、质谱参数等分析条件以及挥发油提取条件，采用UPLC分离，MS的离子对定性，DAD也定性，定性更准确，MS定量检测，通过一测多评技术，以N-香草基壬烷酰胺为内参物，建立其与6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的相对校正因子，并计算4种姜辣素组分含量的方法，可解决因对照品缺乏而无法客观合理的控制姜药材提取物的质量问题，取得了较好的技术效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下所做的任何修改，等同替换和修饰改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.采用一测多评法测定姜药材提取物中姜辣素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
分别精密称定N-香草基壬烷酰胺、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚5种对照品，用甲醇溶解稀释，制得各单一对照品储备液，然后量取单一对照品储备液，用甲醇稀释混匀，制得混合对照品标准溶液；同时，配制质量浓度分别为CoL及CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液，CoL小于CoH；将混合对照品标准溶液及N-香草基壬烷酰胺标准溶液冷冻避光保存；
(2)供试品溶液的制备
直接取姜药材提取物，加入步骤(1)制得的N-香草基壬烷酰胺对照品储备液或N-香草基壬烷酰胺标准溶液，混合并用溶剂定容，得到供试品溶液；
或者将姜药材提取物用50％～100％甲醇稀释，得到提取物母液，再取提取物母液，加入步骤(1)制得的N-香草基壬烷酰胺对照品储备液或N-香草基壬烷酰胺标准溶液，混合并用溶剂定容，得到供试品溶液；
供试品溶液中N-香草基壬烷酰胺的含量为0.05～1.00μg/mL；
(3)相对校正因子fox和相对保留时间RtR的计算
用UPLC-MS-DAD进行测定，进样系列浓度的步骤(1)制备得到的混合对照品标准溶液，获得TIC色谱图和MRM色谱图并进行峰面积积分，选取N-香草基壬烷酰胺为内参化合物，分别计算混合对照品标准溶液中N-香草基壬烷酰胺对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的相对校正因子fox和相对保留时间RtR；
所述校正因子fox的计算公式为：
式中：Ao为内参物N-香草基壬烷酰胺对照品的峰面积，Co为内参物N-香草基壬烷酰胺对照品的质量浓度，Ax为被测组分对照品x的峰面积，Cx为被测组分对照品x的质量浓度；
所述相对保留时间RtR的计算公式为：
式中：tRx为被测组分对照品x的保留时间，tRo为内参物N-香草基壬烷酰胺对照品的保留时间；
(4)供试品中活性成分的测定
取步骤(1)制备得到的N-香草基壬烷酰胺标准溶液及步骤(2)制备得到的供试品溶液进样，用UPLC-MS-DAD进行测定，获得TIC色谱图和MRM色谱图，按公式计算供试品溶液中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的质量浓度；
上述的公式为：
C'x＝(C′xL+CxH')/2
式中：Cx’为供试品溶液中被测定组分x的质量浓度，CxL’为供试品溶液中被测定组分x相对于浓度为CoL的N-香草基壬烷酰胺标准溶液所计算出的质量浓度，CxH’为供试品溶液中被测定组分x相对于浓度为CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液所计算出的质量浓度，Ax’为供试品溶液中被测组分x的峰面积，AoL为CoL浓度N-香草基壬烷酰胺标准溶液的峰面积，AoH为CoH浓度N-香草基壬烷酰胺标准溶液的峰面积，fox为步骤(3)所得N-香草基壬烷酰胺对被测组分的相对校正因子，N为浓度影响因数。
2.根据权利要求1所述采用一测多评法测定姜药材提取物中姜辣素含量的方法，其特征在于，步骤(3)及步骤(4)所述UPLC测定的条件为：色谱柱为反相C18色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，以体积浓度为0.02～0.2％甲酸的水溶液或体积浓度0.02～0.2％乙酸的水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，流速为0.4～0.6mL/min，检测波长为280nm±2nm。
3.根据权利要求2所述采用一测多评法测定姜药材提取物中姜辣素含量的方法，其特征在于：所述梯度洗脱的程序为：
4.根据权利要求2或3所述采用一测多评法测定姜药材提取物中姜辣素含量的方法，其特征在于：步骤(2)中所述溶剂由流动相A和流动相B按照梯度洗脱初始比例混匀而成。
5.根据权利要求1所述采用一测多评法测定姜药材提取物中姜辣素含量的方法，其特征在于，步骤(3)及步骤(4)所述MS测定的条件为：离子源为ESI，检测方式为MRM多反应监测，扫描模式为正离子模式，雾化气压力为275.8～379.2kPa，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10～12L/min，毛细管电压为4.0kV。
6.根据权利要求5所述采用一测多评法测定姜药材提取物中姜辣素含量的方法，其特征在于，所述MS测定的条件还包括：用于定量分析的离子对：N-香草基壬烷酰胺294.1→137.0、6-姜酚277.1→177.1、8-姜酚305.1→177.1、10-姜酚333.2→177.1、6-姜烯酚277.1→137.0。
7.根据权利要求5所述采用一测多评法测定姜药材提取物中姜辣素含量的方法，其特征在于，所述MS测定的条件还包括：用于定性分析的离子对：N-香草基壬烷酰胺294.1→122.0、6-姜酚277.1→145.0、8-姜酚305.1→117.1、10-姜酚333.2→145.0、6-姜烯酚277.1→94.1。
8.根据权利要求1所述采用一测多评法测定姜药材提取物中姜辣素含量的方法，其特征在于，步骤(2)所述姜药材提取物为姜药材通过水蒸馏法、超临界法或亚临界法所得到的挥发油提取物。
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