CN108414666A - 一种姜药材挥发油提取物中姜辣素含量的测定方法 - Google Patents

一种姜药材挥发油提取物中姜辣素含量的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种姜药材挥发油提取物中姜辣素含量的测定方法，通过超高效液相色谱串联紫外检测器（UPLC‑DAD）的分离分析技术，借助一测多评方法，采用试样中不存在的性能稳定且易得的纯物质N‑香草基壬烷酰胺对照品作为内参物，建立该组分与试样中4个姜辣素组分之间的相对校正因子，通过校正因子计算，实现对姜药材挥发油提取物中的4个姜辣素组分的含量进行测定。本发明操作简单，灵敏度高，准确高效，成本低廉，可以客观，准确的评价姜药材及其提取物与制剂的品质，并用于质量控制，可解决因对照品缺乏而无法客观、合理地控制姜药材挥发油提取物的问题，对控制质量和保证疗效具有重要意义。

Description

一种姜药材挥发油提取物中姜辣素含量的测定方法
技术领域
本发明具体涉及一种姜药材挥发油提取物中姜辣素含量的测定方法。
背景技术
姜(Zingiber officinal Rosc)别名生姜、干姜、白姜、均姜，属姜科(Zingiberaceae)姜属多年生草本植物，在我国主要分布于西南部至东南部区域。姜的組分多而复杂，具有独特的芳香风味和辛辣口感，这种独特的感官品质主要来源于两类有效成分：挥发性的姜精油和不具有挥发性的姜辣素，姜精油为姜提供独特的芳香风味；姜辣素为姜提供独特的辛辣口感。不同产地的姜因生长环境不同其药性和功效也有一定差异，研究发现，姜具有独特的药用和食用价值，祖国传统医药学认为，姜乃药中佳品，主治风寒感冒、喘咳、呕吐、痰饮、胀满、泄泻等。其始载于《神农本草经》，味辛，性热，归脾、胃、肾、心、肺经，具有温中散寒，回阳通脉，燥湿消痰等功效。现代药理学研究表明，生姜和干姜均具有抗氧化，抗炎，抗菌，抗肿瘤，抗溃疡，抗胃肠道出血，胃黏膜保护，改善局部血液循环等多种药理作用。有研究采用HPLC-UV技术建立了干姜中姜酚的分析方法，但所测定指标对照品分离制备难度大，分析成本高，作为姜药材质量控制方法不易广泛应用，另有报道采用HPLC-UV-ES-MS技术对生姜甲醇提取物及姜油树脂提取物进行分离分析，鉴定出多种姜辣素组分，提供了一个有价值的姜提取物的指纹图谱信息，但并未对其主成分进行准确的筛选和定量测定，而且多种成分并不能仅仅基于质谱信息进行准确识别。截止目前，2015版《中国药典》收载的用于姜药材(包括生姜和干姜)分析评价方法，以6-姜辣素作为干姜质量控制指标，以6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚作为生姜的质量控制指标，这些指标少且单一，分析时间长，不能全面反映姜药材及饮片的内在品质，而且目前6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚等对照品难以获得，价格高昂，限制了多指标成分质量控制的实际应用。
一测多评法是一种适合中药特点的多指标质量评价的新模式，它利用有效化学成分间内在的函数和比例关系，只测定1个成分(对照品易得到)来实现多个成分(对照品难以得到或无)的同步监控，克服对照品短缺这一问题，即只测定其中某个代表性成分或试样中不存在且性能相近的成分(易得、廉价、稳定、有效)，同时可计算出其他待测有效成分的含量。
因此，开发一种操作简单，检测灵敏度高，成本低廉，准确高效，且可同时定量分析多种活性成分的质量控制方法(一测多评法)，对于姜药材挥发油提取物的质量控制具有重要的现实意义。
发明内容
基于现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种姜药材挥发油提取物中姜辣素含量的测定方法，采用超高效液相色谱-紫外检测器，通过一测多评技术，采用试样中不存在且性能相近、稳定易得的纯物质N-香草基壬烷酰胺对照品作为内参物，建立该组分与6-姜烯酚、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的相对校正因子，通过校正因子计算姜药材挥发油提取物中多种姜辣素组分的含量。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种姜药材挥发油提取物中姜辣素含量的测定方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
分别精密称定N-香草基壬烷酰胺、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚5种对照品，用甲醇溶解稀释，制得各单一对照品储备液，然后量取单一对照品储备液，用甲醇稀释混匀，制得混合对照品标准溶液；同时，配制质量浓度分别为CoL及CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液，CoL小于CoH；将混合对照品标准溶液及N-香草基壬烷酰胺标准溶液冷冻避光保存；
(2)供试品溶液的制备
直接取姜药材挥发油提取物，加入步骤(1)制得的N-香草基壬烷酰胺对照品储备液或N-香草基壬烷酰胺标准溶液，混合并用溶剂定容，得到供试品溶液；
或者将姜药材挥发油提取物用50％～100％甲醇稀释，得到提取物母液，再取提取物母液，加入步骤(1)制得的N-香草基壬烷酰胺对照品储备液或N-香草基壬烷酰胺标准溶液，混合并用溶剂定容，得到供试品溶液；
其中，供试品溶液中N-香草基壬烷酰胺的含量为2.0～100.0μg/mL；
(3)相对校正因子fox和相对保留时间RtR的计算
用UPLC-DAD进行测定，进样系列浓度的步骤(1)制备得到的混合对照品标准溶液，获得DAD色谱图并进行峰面积积分，选取N-香草基壬烷酰胺为内参化合物，分别计算混合对照品标准溶液中N-香草基壬烷酰胺对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的相对校正因子fox和相对保留时间RtR；
所述校正因子fox的计算公式为：
式中：Ao为内参物N-香草基壬烷酰胺对照品的峰面积，Co为内参物N-香草基壬烷酰胺对照品的质量浓度，Ax为被测组分对照品x的峰面积，Cx为被测组分对照品x的质量浓度；
所述相对保留时间RtR的计算公式为：
式中：tRx为被测组分对照品x的保留时间，tRo为内参物N-香草基壬烷酰胺对照品的保留时间；
(4)供试品中活性成分的测定
取步骤(1)制备得到的N-香草基壬烷酰胺标准溶液及步骤(2)制备得到的供试品溶液进样，用UPLC-DAD进行测定，获得DAD色谱图，按公式计算供试品溶液中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的质量浓度；
上述的公式为：
C'x＝(C′xL+C′xH)/2
式中：Cx’为供试品溶液中被测定组分x的质量浓度，CxL’为供试品溶液中被测定组分x相对于浓度为CoL的N-香草基壬烷酰胺标准溶液所计算出的质量浓度，CxH’为供试品溶液中被测定组分x相对于浓度为CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液所计算出的质量浓度，Ax’为供试品溶液中被测组分x的峰面积，AoL为CoL浓度N-香草基壬烷酰胺标准溶液的峰面积，AoH为CoH浓度N-香草基壬烷酰胺标准溶液的峰面积，fox为步骤(3)所得N-香草基壬烷酰胺对被测组分的相对校正因子，N为浓度影响因数。
优选地，步骤(3)及步骤(4)所述UPLC测定的条件为：色谱柱为反相C18色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，以体积浓度为0.05～0.5％甲酸的水溶液或体积浓度0.05～0.5％乙酸的水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，流速为0.4～0.6mL/min，检测波长为280nm±2nm；柱温35℃，进样量：2.0～10.0μL。
优选地，所述梯度洗脱的程序为：
优选地，步骤(2)中所述溶剂由流动相A和流动相B按照梯度洗脱初始比例混匀而成。
优选地，所述姜药材挥发油提取物为姜药材通过水蒸馏法、超临界法或亚临界法所得到的挥发油提取物。
本发明采用N-香草基壬烷酰胺(N-香草基壬烷酰胺，Nonivamide)对照品作为内参物进行一测多评法的建立，因其与待测组分结构相似，极性相近，性能稳定且试样中不存在，与天然辣椒素相比更加廉价易得，具有镇疼、消炎、杀菌、祛风湿等功效，更加环保、经济，因此最终优选N-香草基壬烷酰胺作为内标物。
本发明所测定的姜辣素组分其结构相似，经UPLC分离，进入DAD检测分析，经比较不同流动相体系，对其分离效果的影响，特别的，流动相中加入少许酸性缓冲盐能有效改善峰形，使得峰形更加尖锐对称，分离度更高，因此优选出以甲酸或乙酸的水溶液为水相(流动相A)，乙腈为有机相(流动相B)较适宜于上述成分的分离。
不同品牌色谱柱对上述化合物的分离效能影响也较大，经大量实验筛选以及采用超高效液相分离技术，最终选择分析速度更快的Eclipse Plus C18色谱柱(100×4.6mm,3.5μm)较为理想，并且本发明还通过大量实验筛选了流动相的流速，研究发现，低流速有助于减小溶剂效应，提高检测灵敏度，还能节省溶剂，降低成本，综合考虑最终确认以0.5mL/min的流速最为适宜。
本发明针对姜辣素组分为姜药材中含有的主成分之一，采用一测多评技术建立同时测定姜药材挥发油提取物中4种含量相对较高且具有代表性的姜辣素组分化合物的方法。在建立相对校正因子时，分别比较了直接以定量离子峰面积和进样量计算相对校正因子，以及取峰面积和进样量的对数进行计算的两种相对校正因子计算方法。结果表明，两种方法均可，RSD值均小于5％，由于后期检测含量较低的样品时宜选用灵敏度更高的质谱法分析，而质谱法分析中采用峰面积和进样浓度的对数进行计算时，相对较好，因此最终优选为选择峰面积和进样量的对数值进行校正因子的计算。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：本发明根据姜药材挥发油提取物中活性成分与杂质成分的结构特点，通过大量实验优选出超高效液相色谱分析条件，采用试样中不存在的性能稳定且廉价易得的纯物质N-香草基壬烷酰胺对照品作为内参物进行一测多评法的建立，测定其与6-姜烯酚、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的相对校正因子，并计算4种姜辣素组分含量。该方法操作简单，灵敏度高，线性范围宽，准确高效，成本低廉，可以客观、准确地评价姜药材挥发油提取物的品质，并用于质量控制，可解决因对照品缺乏而无法客观、合理地控制提取物质量的问题，对控制质量和保证疗效具有重要意义。
附图说明
图1是实施例1所述混合对照品标准溶液的DAD色谱图；
图2是实施例1所述供试品溶液2(水蒸馏)的DAD色谱图；
图3是实施例2所述供试品溶液4(超临界)的DAD色谱图；
图4是实施例3所述供试品溶液6(亚临界)的DAD色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明，但所述实施例旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
下述实施例中所用仪器包括：Agilent 1290UPLC超高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)、AUW220D型电子分析天平(日本Shimadzu公司)、ME204/十万分之一天平(瑞士梅特勒-托利多)、QL-901型涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、移液枪：100μL、200μL、1000μL(Eppendorf)。
下述实施例中所用材料及供试样品包括：对照品6-姜酚(CAS：23513-14-6，98.27％)，批号为PCL-G432，购于英国PCL；对照品8-姜酚(CAS：23513-08-8，93.8％)，10-姜酚(CAS：23513-15-7，97.1％)，批号分别为111994-201501和111993-201601，均购于中国食品药品检定研究院；对照品6-姜烯酚(CAS：555-66-8，98.20％)，批号为16122601，购于成都普菲德生物技术有限公司；对照品N-香草基壬烷酰胺(CAS：2444-46-4，≥98％)，批号为wkq16090106，购于四川维克奇生物科技有限公司；甲醇、乙腈(LC/MS级别，FisherScientific)；甲酸(LC/MS级，Fisher Scientific)；超纯水(娃哈哈矿泉水)。选自不同产地的姜：张良姜，安徽姜，山东姜，小分子张良姜，信阳姜，怀(博爱)姜，并挑选完整、无虫病害的姜作为试验原料，其中，鲜姜指未发汗生姜，老姜指发汗生姜，干姜指干燥的姜。
实施例1
一种姜药材挥发油提取物中姜辣素含量的测定方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
分别精密称定N-香草基壬烷酰胺、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚5种对照品，用甲醇溶解稀释，制得各单一对照品储备液；其中，N-香草基壬烷酰胺对照品储备液的浓度为509.60μg/mL，6-姜酚对照品储备液的浓度为552.72μg/mL，8-姜酚对照品储备液的浓度为806.68μg/mL，10-姜酚对照品储备液的浓度为592.31μg/mL，6-姜烯酚对照品储备液的浓度为509.60μg/mL。
然后分别量取上述单一对照品储备液，用甲醇稀释、混匀，制得混合对照品标准溶液，混合对照品标准溶液中N-香草基壬烷酰胺、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚的浓度分别为50.960、55.272、80.668、59.231、50.960μg/mL；同时，配制质量浓度分别为CoL及CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液，CoL为102.0μg/mL、CoH为509.6μg/mL；将混合对照品标准溶液及N-香草基壬烷酰胺标准溶液于-20℃冰箱中避光保存。
(2)供试品溶液的制备
取鲜姜洗净，趁鲜切成厚度5mm左右姜片，精密称取鲜姜片100g，置于圆底烧瓶中，按照料液比1:3.5加入水作为溶剂，蒸馏提取约5h，得水蒸馏法挥发油提取物。其中，鲜姜采用张良姜。
精密称取水蒸馏法挥发油提取物0.50g(精确到0.00001g)于5.0mL容量瓶中，加入0.5mL步骤(1)所制备浓度为CoL的N-香草基壬烷酰胺标准溶液，用溶剂(由0.1％甲酸的水溶液和乙腈按照体积比80∶20混匀而成)定容，然后摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过后，即得供试品溶液1(水蒸馏)。
精密称取水蒸馏法挥发油提取物0.50g(精确到0.00001g)于5.0mL容量瓶中，加入0.5mL步骤(1)所制备浓度为CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液，用溶剂(由0.1％甲酸的水溶液和乙腈按照体积比80∶20混匀而成)定容，然后摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过后，即得供试品溶液2(水蒸馏)。
(3)相对校正因子fox和相对保留时间RtR的计算
采用UPLC-DAD(超高效液相色谱-紫外检测器)进行测定，参数设置如下：
色谱柱：Eclipse Plus C18柱(100×4.6mm,3.5μm，配12.5×4.6mm,5.0μm预柱)
流速：0.5mL/min
柱温：35℃
检测波长：280nm±2nm
流动相：0.1％甲酸的水溶液(A)——乙腈(B)
梯度洗脱：
首先，取步骤(1)混合对照品标准溶液，分别进样0.2、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μL，进行UPLC-DAD检测，紫外波长280nm下得色谱图如图1所示，进行峰面积积分，选取N-香草基壬烷酰胺为内参化合物，按照公式计算相对校正因子和相对保留时间。
所述校正因子fox的计算公式为：
式中：Ao为内参物N-香草基壬烷酰胺对照品的峰面积，Co为内参物N-香草基壬烷酰胺对照品的质量浓度，Ax为被测组分对照品x的峰面积，Cx为被测组分对照品x的质量浓度；
所述相对保留时间RtR的计算公式为：
式中：tRx为被测组分对照品x的保留时间，tRo为内参物N-香草基壬烷酰胺对照品的保留时间。
结合峰面积数据，分别计算N-香草基壬烷酰胺对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的相对校正因子fox和RtR，结果见表1。
表1N-香草基壬烷酰胺对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚及6-姜烯酚的相对校正因子fox和RtR
(4)供试品中活性成分的测定
取步骤(1)制备得到的N-香草基壬烷酰胺标准溶液(浓度分别为CoL及CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液)及步骤(2)制备得到的供试品溶液(供试品溶液1(水蒸馏)及供试品溶液2(水蒸馏))，进样2.5μL，用UPLC-DAD进行测定，获得DAD色谱图，供试品溶液的DAD色谱图如图2所示；按公式计算供试品溶液中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的质量浓度；
上述的公式为：
C'x＝(C′xL+C′xH)/2
式中：Cx’为供试品溶液中被测定组分x的质量浓度，CxL’为供试品溶液中被测定组分x相对于浓度为CoL的N-香草基壬烷酰胺标准溶液所计算出的质量浓度，CxH’为供试品溶液中被测定组分x相对于浓度为CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液所计算出的质量浓度，Ax’为供试品溶液中被测组分x的峰面积，AoL为CoL浓度N-香草基壬烷酰胺标准溶液的峰面积，AoH为CoH浓度N-香草基壬烷酰胺标准溶液的峰面积，fox为步骤(3)所得N-香草基壬烷酰胺对被测组分的相对校正因子，N为浓度影响因数。
分别计算得到供试品溶液1(水蒸馏)与供试品溶液2(水蒸馏)中被测定组分含量后，再取平均值，即得供试品中活性组分的最终测定值。
(5)外标法测定
精密量取步骤(1)制备得到的混合对照品标准溶液，分别进样0.2、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μL，进行UPLC-DAD检测，紫外波长280nm，对色谱图进行峰面积积分，以进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求得直线回归方程，分别以信噪比3:1和10:1作为检出限(LOD)和检测限(LOQ)。其标准曲线和线性范围见表2，由表中可以看出5个化合物线性范围较宽，且相关系数均大于0.9999，表明5个化合物线性关系良好。
表2标准曲线及线性范围、检出限(LOD)和检测限(LOQ)
然后精密量取步骤(2)制备得到的供试品溶液2.5μL，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图及峰面积，根据标准曲线计算各成分浓度。
(5)添加回收率、精密度试验
分别精密称定N-香草基壬烷酰胺、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚5种对照品，用甲醇溶解稀释，得到单一成分母液，然后分别量取上述单一成分母液，用甲醇稀释、混匀，制得低、中、高三种浓度的混合对照溶液。
低浓度的混合对照溶液中N-香草基壬烷酰胺、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚的浓度分别为20.38μg/mL、11.05μg/mL、16.13μg/mL、23.69μg/mL、50.96μg/mL；中浓度的混合对照溶液中N-香草基壬烷酰胺、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚的浓度分别为50.96μg/mL、22.11μg/mL、32.27μg/mL、59.23μg/mL、101.92μg/mL；高浓度的混合对照溶液中N-香草基壬烷酰胺、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚的浓度分别为203.85μg/mL、55.27μg/mL、80.67μg/mL、118.46μg/mL、203.85μg/mL。
向三个5.0mL容量瓶中各加入水蒸馏法挥发油提取物0.25g(精确到0.00001g)，然后分别加入1mL低、中、高三种浓度的混合对照溶液，用溶剂(由0.1％甲酸的水溶液和乙腈按照体积比80∶20混匀而成)定容，然后摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过后，得到样品溶液1、2、3。样品溶液1、2、3平行制备3份。
以(测定值-本底值)/添加值×100％计算回收率；精密度考察分为日内精密度和日间精密度试验，日内精密度为高、中、低三个浓度的同一份供试品溶液在一天内连续进样5次，日间精密度为连续5天内连续进样5次，重复性试验为平行制备6份姜挥发油提取物样品溶液连续进样，每份样品进样2针。分别按照外标法和一测多评法计算各个待测成分的添加回收率、精密度和稳定性，结果见表3，表4。
表3外标法和一测多评法计算精密度、稳定性试验结果
表4外标法和一测多评法计算回收率结果
从表3和表4中的数据可以看出，实施例1所述测定方法的添加回收率符合要求，精密度及稳定性均较好。结果还表明实施例1的测定方法准确，重复性高，可用于姜药材挥发油提取物含量测定。
(6)稳定性试验
为确保分析结果的可靠与重复性，需要考察样品的稳定性，本实验主要考察了室温下放置的供试品溶液的稳定性。稳定性试验为高、中、低3个浓度的供试品溶液(每个浓度水平制备3份)分别在室温下放置0、2、4、8、12、24、48h后，以设定的条件进行测定，6-姜酚，N-香草基壬烷酰胺，8-姜酚，6-姜烯酚和10-姜酚的稳定性分别在98.19％～99.40％，98.10％～100.46％，89.72％～93.42％，91.04％～94.27％和90.65％～95.67％，所测定值的RSD在0.30％～8.80％之间，RSD均小于10％，表明供试品溶液在室温条件下放置48h内稳定性良好。
按照实施例1一测多评方法及外标法，仅更换姜原料，进行测定并对比，结果见表5。
表5一测多评法(QAMS)与外标法(ED)含量测定结果比较(mg/g)
注：A-张良姜鲜姜；B-张良姜老姜；C-小分子张良姜鲜姜；D-小分子张良姜老姜；E-山东姜鲜姜；
F-山东姜老姜；G-怀姜鲜姜；H-怀姜老姜；I-信阳鲜姜。
结果表明，一测多评分析方法和外标法测定结果基本一致，说明该一测多评方法可以用来对姜药材挥发油提取物进行质量控制。
实施例2
一种姜药材挥发油提取物中姜辣素含量的测定方法，按照实施例1的步骤，不同之处仅在于步骤(2)供试品溶液的制备。
供试品溶液的制备具体如下：
取鲜姜洗净，趁鲜切片，于50℃烘干并粉碎，过50目筛，得到干姜粉末；称取175g干姜粉末置于超临界CO2萃取装置中，于40psi压力条件下，分别以35℃提取2h，45℃提取3h，55℃提取5h，得(三个)超临界法挥发油提取物。
精密称取超临界法挥发油提取物0.02g(精确到0.00001g)于5.0mL容量瓶中，用50％甲醇的水溶液提取定容，然后再用50％甲醇的水溶液稀释10倍，取1mL转移至10mL量瓶中，再加入1mL步骤(1)所制备浓度为CoL的N-香草基壬烷酰胺标准溶液，用溶剂(由0.1％甲酸的水溶液和乙腈按照体积比80∶20混匀而成)定容，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过后，即得供试品溶液3(超临界)。
精密称取超临界法挥发油提取物0.02g(精确到0.00001g)于5.0mL容量瓶中，用50％甲醇的水溶液提取定容，然后再用50％甲醇的水溶液稀释10倍，取1mL转移至10mL量瓶中，再加入1mL步骤(1)所制备浓度为CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液，用溶剂(由0.1％甲酸的水溶液和乙腈按照体积比80∶20混匀而成)定容，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过后，即得供试品溶液4(超临界)。
其中，鲜姜采用张良姜，供试品溶液4(超临界)的DAD色谱图如图3所示。
实施例3
一种姜药材挥发油提取物中姜辣素含量的测定方法，按照实施例1的步骤，不同之处仅在于步骤(2)供试品溶液的制备。
供试品溶液的制备具体如下：
取鲜姜洗净，趁鲜切片，于50℃烘干并粉碎，过50目筛，得到干姜粉末；取20kg鲜姜或干姜粉末置于亚临界萃取装置中，以丁烷为夹带剂，40℃提取4h，得亚临界法挥发油提取物。精密称取亚临界法挥发油提取物0.02g(精确到0.00001g)于5.0mL容量瓶中，用50％甲醇的水溶液提取定容，然后再用50％甲醇的水溶液稀释10倍，取1mL转移至10mL量瓶中，再加入1mL步骤(1)所制备浓度为CoL的N-香草基壬烷酰胺标准溶液，用溶剂(由0.1％甲酸的水溶液和乙腈按照体积比80∶20混匀而成)定容，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过后，即得供试品溶液5(亚临界)。
取鲜姜洗净，趁鲜切片，于50℃烘干并粉碎，过50目筛，得到干姜粉末；取20kg鲜姜或干姜粉末置于亚临界萃取装置中，以丁烷为夹带剂，40℃提取4h，得亚临界法挥发油提取物。精密称取亚临界法挥发油提取物0.02g(精确到0.00001g)于5.0mL容量瓶中，用50％甲醇的水溶液提取定容，然后再用50％甲醇的水溶液稀释10倍，取1mL转移至10mL量瓶中，再加入1mL步骤(1)所制备浓度为CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液，用溶剂(由0.1％甲酸的水溶液和乙腈按照体积比80∶20混匀而成)定容，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过后，即得供试品溶液6(亚临界)。
其中，鲜姜分别采用张良姜，山东姜，云南姜。采用张良姜得到的供试品溶液6(亚临界)的DAD色谱图如图4所示。
按照实施例1中步骤(3)～(5)，实施例2、3的测定结果如表6所示。
表6一测多评法(QAMS)与外标法(ED)含量测定结果比较(mg/g)
注：a：35℃超临界提取张良姜2h，b：45℃超临界提取张良姜3h，c：55℃超临界提取张良姜5h，d：亚临界提取张良姜鲜姜，e：亚临界提取张良姜干姜，f：亚临界提取云南姜干姜，g：亚临界提取山东姜干姜。
以上实验结果表明，本发明提供的一种姜药材挥发油提取物中姜辣素含量的测定方法操作简单、灵敏度高、准确高效、成本低廉，可以客观、准确地评价姜药材及其提取物与制剂的品质，并用于质量控制，并且实验对比结果表明，与外标法检测结果准确性相当，但本发明采用一测多评法更加高效、快捷，并且采用试样中不存在N-香草基壬烷酰胺作为内参物，性能相近、稳定且容易获取，更加经济。
本发明通过大量实验优选出最佳的流动相梯度洗脱、流速、色谱柱、质谱参数等分析条件以及挥发油提取条件，采用UPLC分离，DAD定性定量检测，通过一测多评技术，以N-香草基壬烷酰胺为内参物，建立其与6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的相对校正因子，并计算4种姜辣素组分含量的方法，可解决因对照品缺乏而无法客观合理的控制姜药材及其提取物与制剂的质量问题，取得了较好的技术效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下所做的任何修改，等同替换和修饰改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种姜药材挥发油提取物中姜辣素含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
分别精密称定N-香草基壬烷酰胺、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚5种对照品，用甲醇溶解稀释，制得各单一对照品储备液，然后量取单一对照品储备液，用甲醇稀释混匀，制得混合对照品标准溶液；同时，配制质量浓度分别为CoL及CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液，CoL小于CoH；将混合对照品标准溶液及N-香草基壬烷酰胺标准溶液冷冻避光保存；
(2)供试品溶液的制备
直接取姜药材挥发油提取物，加入步骤(1)制得的N-香草基壬烷酰胺对照品储备液或N-香草基壬烷酰胺标准溶液，混合并用溶剂定容，得到供试品溶液；
或者将姜药材挥发油提取物用50％～100％甲醇稀释，得到提取物母液，再取提取物母液，加入步骤(1)制得的N-香草基壬烷酰胺对照品储备液或N-香草基壬烷酰胺标准溶液，混合并用溶剂定容，得到供试品溶液；
其中，供试品溶液中N-香草基壬烷酰胺的含量为2.0～100.0μg/mL；
(3)相对校正因子fox和相对保留时间RtR的计算
用UPLC-DAD进行测定，进样系列浓度的步骤(1)制备得到的混合对照品标准溶液，获得DAD色谱图并进行峰面积积分，选取N-香草基壬烷酰胺为内参化合物，分别计算混合对照品标准溶液中N-香草基壬烷酰胺对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的相对校正因子fox和相对保留时间RtR；
所述校正因子fox的计算公式为：
式中：Ao为内参物N-香草基壬烷酰胺对照品的峰面积，Co为内参物N-香草基壬烷酰胺对照品的质量浓度，Ax为被测组分对照品x的峰面积，Cx为被测组分对照品x的质量浓度；
所述相对保留时间RtR的计算公式为：
式中：tRx为被测组分对照品x的保留时间，tRo为内参物N-香草基壬烷酰胺对照品的保留时间；
(4)供试品中活性成分的测定
取步骤(1)制备得到的N-香草基壬烷酰胺标准溶液及步骤(2)制备得到的供试品溶液进样，用UPLC-DAD进行测定，获得DAD色谱图，按公式计算供试品溶液中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的质量浓度；
上述的公式为：
C'x＝(C′xL+CxH')/2
式中：Cx’为供试品溶液中被测定组分x的质量浓度，CxL’为供试品溶液中被测定组分x相对于浓度为CoL的N-香草基壬烷酰胺标准溶液所计算出的质量浓度，CxH’为供试品溶液中被测定组分x相对于浓度为CoH的N-香草基壬烷酰胺标准溶液所计算出的质量浓度，Ax’为供试品溶液中被测组分x的峰面积，AoL为CoL浓度N-香草基壬烷酰胺标准溶液的峰面积，AoH为CoH浓度N-香草基壬烷酰胺标准溶液的峰面积，fox为步骤(3)所得N-香草基壬烷酰胺对被测组分的相对校正因子，N为浓度影响因数。
2.根据权利要求1所述姜药材挥发油提取物中姜辣素含量的测定方法，其特征在于，步骤(3)及步骤(4)所述UPLC测定的条件为：色谱柱为反相C18色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，以体积浓度为0.05～0.5％甲酸的水溶液或体积浓度0.05～0.5％乙酸的水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，流速为0.4～0.6mL/min，检测波长为280nm±2nm。
3.根据权利要求2所述姜药材挥发油提取物中姜辣素含量的测定方法，其特征在于：所述梯度洗脱的程序为：
4.根据权利要求2或3所述姜药材挥发油提取物中姜辣素含量的测定方法，其特征在于：步骤(2)中所述溶剂由流动相A和流动相B按照梯度洗脱初始比例混匀而成。
5.根据权利要求1所述姜药材挥发油提取物中姜辣素含量的测定方法，其特征在于：所述姜药材挥发油提取物为姜药材通过水蒸馏法、超临界法或亚临界法所得到的挥发油提取物。
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