CN110632237A - 应用tlc-cms技术评价红枣中植物甾醇抗氧化性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种应用TLC‑CMS技术评价红枣中植物甾醇抗氧化性的方法，以乙酸乙酯为提取剂，微波超声波萃取仪辅助处理从红枣（木枣、骏枣、酸枣）中提取β‑谷甾醇，双波长扫描测定红枣中β‑谷甾醇的含量，质谱对其定性分析，紫外及荧光测定其抗氧化性。经IR检测，供试样品与标准品均含有相同官能团：‑OH和‑CH3。同等浓度下VC、VE、β‑谷甾醇的抗氧化性由强到弱为：VC>β‑谷甾醇>VE。结论：薄层可快速从枣中分离纯化出β‑谷甾醇，β‑谷甾醇表现出良好的抗氧化性，可在化妆品和医疗方面进一步研究。
Description
技术领域
本发明涉及植物甾醇检测方法，具体为一种应用TLC-CMS技术评价红枣中植物甾醇抗氧化性的方法。
背景技术
甾醇具有较强的抗氧化特性，可直接猝灭活性氧簇，阻断不饱和脂肪酸过氧化链式反应，改善机体氧化还原平衡，从而缓解炎症、神经性退化等慢性疾病。还可作为食品抗氧化剂及营养添加剂；也可作为动物生长剂原料，促进动物生长，增进动物健康。
目前，植物甾醇主要从植物油精炼脱臭馏出物中提取。常见的方法有溶剂提取法、分子蒸馏法、超临界CO2提取法和酶法等。溶剂提取法成本较低，但是耗时长、提取率低。超临界CO2提取法和酶法则存在成本较高，不易推广的缺点。红枣中含油量较低，初步计划先用提取剂浸提。超声波具有有效破碎植物细胞、利于传质及促进有效成分溶出但不容易破坏有效物质化学结构的优点，在苦瓜皂苷、番茄红素、木瓜籽油和石榴籽油以及紫苏等多种植物有效成分提取方面取得了较好的效果，但对于红枣中甾醇的含量少有研究。
目前，利用高效液相色谱（HPLC）、高效气相色谱（GC）、薄层（TLC）对甾醇的研究很多，尤其是GC，但TLC-CMS联用仍无人采用，应用Plate ExpressTM技术可直接从TLC 薄层板上获取质谱图，其优点是不经过样品前处理，可快速从复杂混合物中获得目标物分子质量信息，并对其进行鉴定。
植物甾醇是一种结构上与动物甾醇相似而功能完全不同的天然的植物活性成分，食源性甾醇具有抗氧化的功效，能够作为表面活性剂。可以保持皮肤表面水分，促进皮肤新陈代谢、抑制皮肤炎症，可防日晒红斑、皮肤老化，还有生发、养发之功效。本方法致力于红枣中的甾醇的提取，并分析其抗氧化性。
发明内容
本发明目的是提供一种应用TLC-CMS技术评价红枣中植物甾醇抗氧化性的方法，本方法主要是结合微波超声技术从红枣（木枣、骏枣、酸枣、木枣核、骏枣核、酸枣核）中提取β-谷甾醇，通过TLC-CMS联用技术对其进行抗氧化性测定。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种应用TLC-CMS技术评价红枣中植物甾醇抗氧化性的方法，包括如下步骤：
（1）、微波超声技术粗提甾醇
材料的预处理：以红枣仁或者红枣核为原料，清洗后55℃烘干，粉碎过80目筛备用。
样品的制备：以乙酸乙酯为提取剂，称取红枣仁粉或红枣核粉于容器中，料液比1:15；微波超声波萃取时间为40min、萃取功率为400W；萃取后4000r/min离心10min，过滤3次，浓缩，用氯仿定容。
标准溶剂的制备：取标准β-谷甾醇，色谱甲醇定溶，配成1mg/ml的标准溶剂待用。
（2）、TLC分离纯化甾醇
点样：用微量进样器吸取50μL β-谷甾醇标准品溶液，置于全自动点样机上，设置点样参数：点样间距10mm、点样宽度8mm、点样数目3、点样量分别为5μL、10μL、15μL、点样速度5s/μL，在硅胶板上进行点样，在吸取10μL供试品溶液，点样10μL。
展开：配制石油醚:乙酸乙酯=10:1（V/V）的混合溶液，再滴加一滴乙酸，静置作为展开剂，倒入展开缸中，让其在展开缸中氤氲 20~30分钟直至饱和，将点样完成的硅胶G板轻轻放入展开剂液面高10~15mm的平卧式展开缸内，待到展开剂前沿距离硅胶板顶端1cm处时，取出，晾干。
显色：待硅胶板干燥后均匀喷撒10%硫酸乙醇溶液，放于105℃烘箱中烘至斑点显色清晰。
拍照：将显色过后的层析板放入薄层色谱成像系统，在365nm的紫外光灯下拍照，观察层析情况，拍照记录。
双波长薄层扫描法进一步测定β-谷甾醇含量：薄层色谱扫描仪将待测薄层板进行双波长扫描，通过轨迹跟踪确定斑点位置参数后，扫描确定斑点最大和最小吸收峰值，用反射扫描测定目标斑点峰面积，利用峰面积与点样量的线性关系确定目标斑点物质含量。
（3）、CMS检测甾醇
质谱条件：电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；传输线温度290℃母离子285m/z；激活电压1.5V；质量扫描范围35~500；检测方式SRM模式。
对标准β-谷甾醇的检测：取20μg/ml β-谷甾醇标准品，用微量进样器吸取10μL，排气泡后将进样处从Load档移至Inject档，微量进样，图谱分析。
对样品的检测：将分离纯化好的薄层板放在TLC-质谱接口上，用激光校准位置，开始运行进行取样，图谱分析。
（4）、红外检测
将液体工作台安置好，打开软件，预热30min后，使用擦镜纸将金刚石擦拭干净，测定背景光，继而使用毛细管在金刚石处滴一滴β-谷甾醇标准液，得其官能团图谱；继而将薄层板上分离纯化好的斑点进行抠样，用色谱甲醇溶解，离心，用毛细管取上清液至金刚石台面进行检测，并与标准品比对分析。
（5）、抗氧化测定
5.1、同等浓度下的VC、VE与甾醇对DPPH·的清除能力的测定
对DPPH自由基清除能力的测定：取若干试管，准确吸取浓度为100μg/mL、80μg/mL、60μg/mL、40μg/mL、20μg/mL的β-谷甾醇样品液0.1mL，分别加入0.06mmoL/L的DPPH溶液3.50mL，严格避光30min，在515nm处测得吸光值，记为Ai；再取5支试管吸取不同浓度的样品提取液0.1mL，各加入甲醇溶液3.50mL，测量吸光值，记为Aj；再取1支试管准确吸取DPPH溶液3.50mL，加入0.10mL甲醇溶液后测量其吸光值，记为A0；配备和样品提取液相同浓度梯度的VC和VE甲醇溶液，作为实验对照组；各吸光度值均取测量三次后的平均值：清除率S=[1–(Ai–Aj)/A0]×100%。
5.2、同等浓度下的VC、VE与甾醇对OH自由基的清除率
对OH·清除能力的测定：配置1.0mL 9mmol/L的FeSO4、1.0mmol/L的H2O2溶液于37℃恒温条件下反应15min，在536nm处测其吸光值A0，然后分别加入20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的甾醇样品以及VC、VE的甲醇溶液，在536nm处测其吸光值Ax；每个样品重复3次，取平均值；OH·清除率的计算公式是：清除率S=(A0–Ax)/A0×100%。
本发明方法以乙酸乙酯为提取剂，微波超声波萃取仪辅助处理从红枣（木枣、骏枣、酸枣）中提取β-谷甾醇，双波长扫描测定红枣中β-谷甾醇的含量，质谱对其定性分析，紫外及荧光测定其抗氧化性。结果显示，在展开剂（石油醚：乙酸乙酯=10:1（v/v））展开下，供试样品与β-谷甾醇标准品展开位置一致，显色后均呈紫红色斑点，其Rf值为0.18；供试样品扫描波长（λS）为295nm，参比波长（λR）为850nm下，薄层扫描峰积分值与含量呈线性关系良好；精密度试验，β-谷甾醇标准品RSD为1.46%（n=5），供试样品在2.5h内稳定，RSD分别为1.30%、1.38%、1.28%、1.29%、1.30%、1.32%，其含量分别为0.0294%，0.0286%，0.0293%，0.0853%，0.0633%，0.0924%。经CMS检测，供试样品与标准品均含有相同离子碎片峰。经IR检测，供试样品与标准品均含有相同官能团：-OH和-CH3。同等浓度下VC、VE、β-谷甾醇的抗氧化性由强到弱为：VC>β-谷甾醇>VE。结论：薄层可快速从枣中分离纯化出β-谷甾醇，β-谷甾醇表现出良好的抗氧化性，可在化妆品和医疗方面进一步研究。
附图说明
图1表示本发明方法流程示意图。
图2a表示β-谷甾醇标准品与样品TLC成像图（365nm下）。
图2b表示β-谷甾醇标准品与样品TLC成像图（白光下）。
图3表示β-谷甾醇标准品与样品TLC成像图。
图4表示β-谷甾醇标准品质谱图。
图5表示样品质谱图。
图6表示β-谷甾醇标准品红外成像图。
图7表示样品红外成像图。
图8表示对DPPH的清除能力比较。
图9表示对羟基自由基的清除能力比较。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施例进行详细说明。
一种应用TLC-CMS技术评价红枣中植物甾醇抗氧化性的方法，如下：
1、实验材料
1.1、材料
木枣、酸枣、骏枣（由特色植物资源省市共建山西省重点实验室培育基地提供）。
1.2 试剂和仪器
1.2.1试剂
表1 主要试剂及出厂
1.2.2仪器
表2 主要仪器及出厂
2、实验方法
2.1、微波超声技术粗提甾醇
实验材料的预处理：以木枣、骏枣、酸枣、木枣核、骏枣核、酸枣核为原料，清洗后55℃烘干，粉碎过80目筛备用。
样品的制备：以乙酸乙酯为提取剂，用电子天平分别称取红枣仁粉或红枣核粉15g于250mL容量瓶中待用，料液比分别1:10、1:15、1:20、1:25；微波超声波萃取时间分别为20min、40min、60min、80min；萃取功率分别为300W、350W、400W、450W。萃取后4000r/min离心10min，过滤3次，浓缩，用氯仿定容。
标准溶剂的制备：取5mg标准β-谷甾醇，色谱甲醇定溶于5ml容量瓶中，配成1mg/ml的标准溶剂待用。
2.2、TLC分离纯化甾醇
点样后，在展缸中经合适的展开剂展开后，合并相同的Rf值的组分，用氮气进行干浴，结晶后，制备出甾醇纯化样品。
点样：用微量进样器吸取50μL β-谷甾醇标准品溶液，置于全自动点样机上，设置点样参数（点样间距10mm、点样宽度8mm、点样数目3、点样量分别为5μL、10μL、15μL、点样速度5s/μL），在硅胶板（115℃活化20min）上进行点样，在吸取10μL供试品溶液，点样10μL。
展开：配制石油醚:乙酸乙酯=10:1（v/v）的混合溶液，再滴加一滴乙酸，静置作为展开剂，倒入展开缸中，让其在展开缸中氤氲 20~30分钟直至饱和，将点样完成的硅胶G板轻轻放入展开剂液面高约10~15mm的平卧式展开缸内，待到展开剂前沿距离硅胶板顶端约1cm处时，取出，晾干。
显色：待硅胶板干燥后均匀喷撒10%硫酸乙醇溶液，放于105℃烘箱中烘至斑点显色清晰（约8~12min）。
拍照：将显色过后的层析板放入薄层色谱成像系统，在365nm的紫外光灯下拍照，观察层析情况，拍照记录。
双波长薄层扫描法进一步测定β-谷甾醇含量：薄层色谱扫描仪将待测薄层板进行双波长扫描，通过轨迹跟踪确定斑点位置参数后，扫描确定斑点最大和最小吸收峰值，用反射扫描测定目标斑点峰面积，利用峰面积与点样量的线性关系确定目标斑点物质含量。
2.3、CMS检测甾醇
质谱条件：电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；传输线温度290℃母离子285m/z；激活电压1.5V；质量扫描范围35~500；检测方式SRM模式。
对标准β-谷甾醇的检测：取20μg/ml β-谷甾醇标准品，用微量进样器吸取10μL，排气泡后将进样处从Load档移至Inject档，微量进样；图谱分析。
对样品的检测：将分离纯化好的薄层板放在TLC-质谱接口上，用激光校准位置，开始运行进行取样；图谱分析。
2.4、红外检测
将液体工作台安置好，打开软件，预热30min后，使用擦镜纸将金刚石擦拭干净，测定背景光，继而使用毛细管在金刚石处滴一滴β-谷甾醇标准液，得其官能团图谱。继而将薄层板上分离纯化好的斑点进行抠样，用色谱甲醇溶解，离心，用毛细管取上清液至金刚石台面进行检测，并与标准品比对分析。
2.5、抗氧化测定
Ⅰ、同等浓度下的VC、VE与甾醇对DPPH·的清除能力的测定
对DPPH自由基清除能力的测定：依据DPPH自由基有单电子，在515nm 左右处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。取若干试管，准确吸取浓度为100μg/mL，80μg/mL，60μg/mL，40μg/mL，20μg/mL的β-谷甾醇样品液0.1mL，分别加入0.06mmoL/L的DPPH溶液3.50mL，严格避光30min，在515nm处测得吸光值，记为Ai。再取5支试管吸取不同浓度的样品提取液0.1mL，各加入甲醇溶液3.50mL，测量吸光值，记为Aj。再取1支试管准确吸取DPPH溶液3.50mL，加入0.10mL甲醇溶液后测量其吸光值，记为A0。配备和样品提取液相同浓度梯度的VC和VE甲醇溶液，作为实验对照组。各吸光度值均取测量三次后的平均值：
清除率S=[1–(Ai–Aj)/A0]×100%。
Ⅱ、同等浓度下的VC、VE与甾醇对OH自由基的清除率
对OH·清除能力的测定：配置1.0mL 9mmol/L FeSO4、1.0mmol/L H2O2溶液于37℃恒温条件下反应15min，在536nm处测其吸光值A0，然后分别加入20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的甾醇样品以及VC、VE的甲醇溶液，在536nm处测其吸光值Ax。每个样品重复3次，取平均值。
OH·清除率的计算公式是：清除率=(A0–Ax)/A0×100%。
Ⅲ、荧光进一步验证其抗氧化性。
3、结果与分析
3.1、最佳提取工艺的确定
表3 优化实验结果
可知，其他条件相同时，提取剂为乙酸乙酯时提取率最高。由表3可知，料液比一定时，随着超声时间的不断增大，甾醇的提取率先增大后减小，超声时间为40min，超声功率为400W时在240nm下吸光值最高，也即提取率最高。
由此可推测骏枣、酸枣、木枣核、骏枣核、酸枣核的最优提取方案为料液比1:15，超声萃取时间为40min，超声功率为400W时，提取率最高。
3.2、薄层层析结果
3.2.1 成像
供试样品溶液与β-谷甾醇标准品溶液展开后，均匀喷10%硫酸-乙醇溶液，烘箱内105℃加热至斑点显色清晰；薄层色谱成像系统拍照显示，供试样品显色斑点与β-谷甾醇标准品斑点一致，其Rf值日光下均显紫红色斑点（如图2b所示），紫外（365nm）检视时均显灰白色的荧光斑点（如图2a所示）。
3.2.2、含量测定
线性范围考察：精密吸取以上配置好的β-谷甾醇标准品溶液5μL、10μL、15μL，分别点于同一硅胶板上（10×10cm），展开后进行波长扫描，以标准品浓度为横坐标（X），吸收峰面积值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，试验数据经直线回归，得回归方程：Y=0.0375X +2.6823（r=0.9812），如图3所示。
结果表明：β-谷甾醇在5~15微升的范围内，峰面积与对照品量呈良好的线性关系。
稳定性试验：取粗提物于硅胶板上按上述条件展开，立即测定峰面积，以后每隔30min测定一次峰面积，结果显示，在2.5h内稳定，RSD分别为1.46%（n=5），1.52%（n=5），1.43%（n=5），1.48%（n=5），1.45%（n=5），1.63%（n=5）。
精密度试验：相同浓度的β-谷甾醇溶液，在一块硅胶板上点样5点，测定峰面积结果RSD分别为1.30%。
样品含量的测定：吸取β-谷甾醇标准品溶液，在硅胶板上分别点样5μL、10μL、15μL。吸取供试品溶液各10μL，在同一硅胶板上点样10μL。展开，测得木枣、骏枣、酸枣、木枣核、骏枣核、酸枣核中β-谷甾醇的含量平均值如下：0.0294%，0.0286%，0.0293%，0.0853%，0.0633%，0.0924%。
表4 含量分析
3.3、质谱检测
标准品扫描如图4所示，样品扫描如图5所示。分离纯化所得的β-谷甾醇图谱与标准品基本一致。其中，β-谷甾醇相对分子量为414.69，H的相对原子量为1.00794，所以推测，415.1处为β-谷甾醇质子化所得的结果；再者，397.4与398.3可能是β-谷甾醇脱了一个羟基使然，进一步印证了所提产物为β-谷甾醇。
3.4、红外检测
标准品扫描如图6所示，样品扫描如图7所示。可知，σOH一般在3670~3200cm-1区域。游离羟基吸收出现在3640~3610cm-1，峰型尖锐，无干扰，极易识别。-OH是个强极性集团，因此羟基化合物的缔合现象非常显著，羟基形成氢键的缔合峰一般出现在3550~3200cm-1。观察可知，标准品与样品均在3316左右出现峰，故推测其为羟基的缔合峰。
γC-H分子中具有—（CH2）n—链节，n大于或等于4时，在722cm-1有一个弱吸收峰，随着CH2个数的减少，吸收峰向高波数方向位移，观察标准图谱与样品图谱推测1021cm-1左右为甲基。
经对比，标准品与样品基本吻合，故进一步推断其为β-谷甾醇。
3.5、抗氧化性测定
3.5.1 同等浓度下的VC、VE与甾醇对DPPH的清除率
同等浓度下，对DPPH自由基的清除能力由大到小是：VC>β-谷甾醇>VE。
3.5.2、同等浓度下的VC、VE与甾醇对OH自由基的清除率
结果表明，红枣中植物甾醇是一种良好的抗氧化剂，具有很好的清除自由基的能力。同等浓度下，含4个OH·的VC的清除能力明显高于β-谷甾醇跟VE，对于只含一个羟基的β-谷甾醇跟VE而言，β-谷甾醇的清除能力要优于VE，唯一不同的是对DPPH的清除能力没有那么明显，原因可能是在制备β-谷甾醇时掺入了部分杂质，导致其浓度略低于标准浓度。
3.5.3、荧光进一步验证其抗氧化性
通过荧光分光光度计进一步对枣中所提取的β-谷甾醇进行分析，结合VC、VE进行对照，根据荧光值差的变化，可得：不论是对DPPH还是羟基自由基，其清除率均为：VC>β-谷甾醇>VE。分析结果与紫外分光光度计的检测结果基本一致。
4、结论
本实验方法是以木枣、骏枣、酸枣、木枣核、骏枣核、酸枣核为原料，经多次试验后，初步判定从木枣、骏枣、酸枣、木枣核、骏枣核、酸枣核中提取β-谷甾醇的提取方案为：用乙酸乙酯为提取剂，以料液比1:15在振荡仪振荡12小时，超声功率400W超声萃取40min。将粗提液浓缩，以甲醇将其定容，经薄层分离纯化，并检测其含量，其中枣核中β-谷甾醇用明显高于果肉中的β-谷甾醇。分离纯化的过程中，各样品展开的斑点中均有与β-谷甾醇标准品展开相同的斑点，初步判定其为β-谷甾醇。质谱与红外检测图谱基本一致，进一步确定该物质为β-谷甾醇。同等浓度下的VC、VE、β-谷甾醇对DPPH·、OH·的清除能力均为：VC>β-谷甾醇>VE。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖于本发明权利要求书的保护范围中。
Claims (1)
1.一种应用TLC-CMS技术评价红枣中植物甾醇抗氧化性的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）、微波超声技术粗提甾醇
材料的预处理：以红枣仁或者红枣核为原料，清洗后55℃烘干，粉碎过80目筛，备用；
样品的制备：以乙酸乙酯为提取剂，称取红枣仁粉或红枣核粉于容器中，料液比1:15；微波超声波萃取时间为40min、萃取功率为400W；萃取后4000r/min离心10min，过滤3次，浓缩，用氯仿定容；
标准溶剂的制备：取标准β-谷甾醇，色谱甲醇定溶，配成1mg/ml的标准溶剂待用；
（2）、TLC分离纯化甾醇
点样：用微量进样器吸取50μL β-谷甾醇标准品溶液，置于全自动点样机上，设置点样参数：点样间距10mm、点样宽度8mm、点样数目3、点样量分别为5μL、10μL、15μL、点样速度5s/μL，在硅胶板上进行点样，在吸取10μL供试品溶液，点样10μL；
展开：配制石油醚:乙酸乙酯=10:1（V/V）的混合溶液，再滴加一滴乙酸，静置作为展开剂，倒入展开缸中，让其在展开缸中氤氲 20~30分钟直至饱和，将点样完成的硅胶G板轻轻放入展开剂液面高10~15mm的平卧式展开缸内，待到展开剂前沿距离硅胶板顶端1cm处时，取出，晾干；
显色：待硅胶板干燥后均匀喷撒10%硫酸乙醇溶液，放于105℃烘箱中烘至斑点显色清晰；
拍照：将显色过后的层析板放入薄层色谱成像系统，在365nm的紫外光灯下拍照，观察层析情况，拍照记录；
双波长薄层扫描法进一步测定β-谷甾醇含量：薄层色谱扫描仪将待测薄层板进行双波长扫描，通过轨迹跟踪确定斑点位置参数后，扫描确定斑点最大和最小吸收峰值，用反射扫描测定目标斑点峰面积，利用峰面积与点样量的线性关系确定目标斑点物质含量；
（3）、CMS检测甾醇
质谱条件：电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；传输线温度290℃母离子285m/z；激活电压1.5V；质量扫描范围35~500；检测方式SRM模式；
对标准β-谷甾醇的检测：取20μg/ml β-谷甾醇标准品，用微量进样器吸取10μL，排气泡后将进样处从Load档移至Inject档，微量进样，图谱分析；
对样品的检测：将分离纯化好的薄层板放在TLC-质谱接口上，用激光校准位置，开始运行进行取样，图谱分析；
（4）、红外检测
将液体工作台安置好，打开软件，预热30min后，使用擦镜纸将金刚石擦拭干净，测定背景光，继而使用毛细管在金刚石处滴一滴β-谷甾醇标准液，得其官能团图谱；继而将薄层板上分离纯化好的斑点进行抠样，用色谱甲醇溶解，离心，用毛细管取上清液至金刚石台面进行检测，并与标准品比对分析；
（5）、抗氧化测定
5.1、同等浓度下的VC、VE与甾醇对DPPH·的清除能力的测定
对DPPH自由基清除能力的测定：取若干试管，准确吸取浓度为100μg/mL、80μg/mL、60μg/mL、40μg/mL、20μg/mL的β-谷甾醇样品液0.1mL，分别加入0.06mmoL/L的DPPH溶液3.50mL，严格避光30min，在515nm处测得吸光值，记为Ai；再取5支试管吸取不同浓度的样品提取液0.1mL，各加入甲醇溶液3.50mL，测量吸光值，记为Aj；再取1支试管准确吸取DPPH溶液3.50mL，加入0.10mL甲醇溶液后测量其吸光值，记为A0；配备和样品提取液相同浓度梯度的VC和VE甲醇溶液，作为实验对照组；各吸光度值均取测量三次后的平均值：清除率S=[1–(Ai–Aj)/A0]×100%；
5.2、同等浓度下的VC、VE与甾醇对OH自由基的清除率
对OH·清除能力的测定：配置1.0mL 9mmol/L的FeSO4、1.0mmol/L的H2O2溶液于37℃恒温条件下反应15min，在536nm处测其吸光值A0，然后分别加入20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的甾醇样品以及VC、VE的甲醇溶液，在536nm处测其吸光值Ax；每个样品重复3次，取平均值；OH·清除率的计算公式是：清除率S=(A0–Ax)/A0×100%。
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