CN109136355A - 一种体外评估胎儿双胎输血综合征发生的snp阵列芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种体外评估胎儿双胎输血综合征发生的SNP阵列芯片，所述芯片含有针对位于人体染色体2号、5号、6号、7号、8号、9号、19号号染色体上，9个SNP位点的9条探针序列；本发明进一步提供了一种体外评估胎儿双胎输血综合征发生的检测试剂盒，所述试剂盒由所述SNP阵列芯片和相关基因引物对组成；本发明所提供的阵列芯片和检测试剂盒可以对胎儿双胎输血综合征的发生提供早期的评估，检测过程快速，通量高，且准确性高，适合工业产业化。
Description
技术领域
本发明属于生命科学和生物技术领域，具体涉及一种体外评估胎儿双胎输血综合征发生的SNP阵列芯片以及试剂盒。
技术背景
胎儿发育异常最为围产期所发生的一系列可导致严重出生缺陷的疾病之一，尽早的发现是及时阻止出生缺陷发生的重要因素。大部分胎儿发育异常如双胎输血综合征(Twin to Twin Transfusion Syndrome,TTTs)如果能够早期发现，均可采取有效措施阻断出生缺陷的发生。而胎儿发育异常导致的出生缺陷往往在孕妇即将分娩或儿童期才被发现，导致患有先天性出生缺陷的婴儿死亡或伴有终生无法治愈的疾病，严重影响患儿一生的生活质量。建立针对胎儿发育异常早期预测与评估的能力，一直人们长期追求的目标，对制定针对患有发育异常的胎儿采取何种阻止手段有重要指导意义。
严重的双胎输血综合征在妊娠26周之前就会造成胎儿流产或死产，即使存活的胎儿也会伴随有残疾的高风险，未经治疗的严重双胎输血综合征的预后是不理想的，围产期死亡率高达90％。这种并发症的最佳初始治疗仍有争议。目前广泛使用的治疗方法有两种。1、连续的羊膜穿刺重复去除大量的羊水。这种技术的原理是防止羊水过多有关的早产，并通过减少胎盘表面的压力来改善胎儿的血流动力学。据报道，存活率为18％～83％，神经系统并发症发生率为5％～58％。胎儿激光凝固术在多个专科中心被应用于双胎输血综合征的治疗，据报导导致生存率在55％和69％之间，随后的神经系统并发症率在5％至11％之间。
根据现有的技术很难在孕早期对TTTs做出准确判断，多数情况是在妊娠33周以后才能做出判断。因此人们对是否利于分子生物学的手段来对胎儿发育异常进行早期预测与评估给予很高期望，在基因突变预测与评估方面做出了诸多努力。尽管国内外研究众多，至今仍然缺乏能够早期准确识别TTTs的方法。
现有的B超与多普勒彩超的技术方法多数在孕晚期才能对TTTs进行判断，由于晚孕周诊断，孕妇只能采取引产或减胎的治疗方法。对孕妇心理与生理都造成巨大伤害。同时，由于多为人为因素判断，存在较高假阳性率。
在分子生物学与分子标志物检测快速发展的今天，人们对胎儿发育异常有了更加深刻的认识。国外市场上已出现了人类全基因组SNP基因芯片，检测得到的数据量很大，需要人工进行数据手机，并进行专门的数据软件分析，检测成本高。
因此是否能够在基因领域开发一种体外检测芯片，能够针对胎儿的发育异常，尤其是胎儿双胎输血综合征的发生进行较早的评估，从而能够更早地为后期的诊断和治疗提供参考，成为了胎儿发育异常领域的技术难题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种胎儿双胎输血综合征发生的SNP阵列芯片，其中，所述阵列芯片含有针对人体染色体2号、5号、6号、7号、8号、9号和19号染色体上，9个相关基因SNP位点的9条探针序列，所述探针序列SEQ ID No：1-9。
发明人前期进行了大规模的研究(数据尚未公布)，临床上使用4837个病例(含正常人群样本)的TTTs作为病例组，正常样本为对照组，即胎儿发育异常孕妇与高龄未患有胎儿发育异常孕妇的数据进行全基因组关联分析。
研究发现位于人体染色体2号、5号、6号、7号、8号、9号和19号染色体上，9个相关基因SNP位点具有显著相关性，这一研究结果对于科研和产业化进行具有了重大的指导意义。
发明人针对这次SNP进行了探针的设计，见表1
表1 相关SNP信息和探针序列
本发明进一步提供了一种体外评估胎儿双胎输血综合征发生的检测试剂盒，其中，所述检测试剂盒由权利要求1所述的阵列芯片和相关基因的引物对组成，所述引物对为SEQ ID No：10-43。
相关序列见表2。
表2 相关基因引物对
| SNP编号 | 上游引物 | 下游引物 |
| rs2111485 | CACTACCATGGGCAGGACTT | TGACTCTCCAGGGCTGATCT |
| CATGGGCAGGACTTTGTGTA | CTGAGCAGTTCTGCCATTGA | |
| rs17643738 | TGCTGTGCAACTGATTTGTTC | TCACATGCTCACACAACATGA |
| AAATTCATGCTGTGCAACTG | TTGAGAGGGCTTGGAAGATG | |
| rs7736157 | CTTGTCCCCAGCTGAAAAAC | TGGAATGGACATCGAGTGAG |
| rs4140483 | GCCCTTATCATCCCACTGAA | GCCACCCTGAAATCTTCTGA |
| TAGGGAGCTCCTTGGAGTGA | GTGCGGTGCACGTATGTACT | |
| rs11773381 | ACTTGCAATGGGCTGAGAGT | ATGTTGGCCAGAATGGTCTC |
| AGGCAGAGCTCAGGCAGTAA | AGGTGTGAGCCACTTGTGTG | |
| rs6967009 | GTGCTGGAGATGCCAGTGTA | AGCCCTTGCCCTATCTGTCT |
| CCCAGAGAATTGCTGGAGAT | AGCCCTTGCCCTATCTGTCT | |
| rs4737639 | CGGCTAGGACTTCCAATCAA | CACGCCCAGCTAGTTTTTGT |
| CGGCTAGGACTTCCAATCAA | CAGGATGGTCTCGATCTCTGA | |
| rs12236821 | TTGGGACCTGTGTTGGATTT | GATGGGATTCCAGGTGTGAG |
| GCTCAGCCCCTACCTAGGAC | CCCAGTCTGTGGCTTGTCTT | |
| rs11667640 | AAGGTCAGAGCCTGCAGAAC | TCTGAGAGTGACCCCAGGAG |
| CAGAGCCTGCAGAACACAGA | CCCAGGAGCTTTGAGTGTGT |
由表2所示，除rs7736157外，本发明对于所述相关基因的引物对优选2对。
以上引物对，每一对都可以进行PCR扩增，另一对为备用引物，rs9517416由于其SNP的位置特殊性，本发明只提供了一对可靠引物。
本发明还提供了一种上述阵列芯片的制备方法，其中，所述阵列芯片按照探针序列进行DNA合成方法合成为寡核苷酸探针，进行3’和/或5’端羟基化修饰，使用Biodot芯片合成设备将制备好的寡核苷酸探针点样至以硝酸纤维素膜或经氨基修饰后的玻璃为介质的阵列基层，最终制成阵列芯片。
其中所述5’或3’端羟基化修饰方法，可采用阵列芯片原位合成方法，相较于传统方法可更加容易的进行大批量规模化生产。
本发明还提供了一种上述的阵列芯片或上述的检测试剂盒进行胎儿双胎输血综合征发生体外评估的应用，其中，所述应用由以下步骤组成：
1)样本准备：获取孕妇样本，根据基因提取方法获取样本基因组,使用的限制性内切酶进行消化；
2)PCR扩增：将获取的样本基因组使用所述引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。扩增时需使用Clonetech Takara出品的TITANIUM DNA Amplification Kits，该优化方法的优点在于可保证在全基因组扩增时，可最大限度的保证DNA序列的高保真性。之后需进行PCR扩增产物的纯化，得到纯化后的PCR扩增产物；
3)PCR产物的定量：使用分光光度计对纯化后的PCR扩增产物进行定量，定量方法可按照分光光度计操作指南进行；
4)PCR产物的片段化：对PCR产物进行片段化，以适应芯片探针的长度确保最佳的杂交效果，得到PCR片段化产物；
5)杂交：将步骤4)的PCR片段化产物与所述阵列芯片进行杂交；
6)洗涤、扫描：将杂交后的阵列芯片洗涤，去除未杂交的样本残留；再使用链霉亲和素偶联染料与生物素化抗链霉亲和素抗体两者的复合体对阵列进行染色，而后进行芯片扫描仪的扫描，得到杂交数据；
7)数据分析：所产生的杂交数据由配套软件的基因分型模块进行分析，并判读结果。
Clonetech酶是Takara出品的TITANIUM DNA Amplification Kits，具体组份TITANIUM Taq DNA聚合酶缺失5′核酸外切酶活性，酶中含有热启动抗体。试剂盒中含有优化的缓冲液混合物(包含Mgcl2)，缓冲液中混有高纯度dNTPs和独有的GC-MeltReagent，在扩增富含GC或二级结构复杂模板时，有助于提高反应的产量和特异性。
基因提取方法可以选用试剂盒，例如illumina公司的SureMDA相关提取试剂盒与1XPBS。
限制性内切酶可以选用NspI等，将基因组切成基因大片段。
在PCR和片段化步骤后通过凝胶电泳观察反应中间体，以确认尺寸分布合适。
要求：要求PCR产物凝胶质控解读：弥散条带目标分布涵盖150-2,000bp，在300–2,000bp时具有较高的强度。
片段化产物凝胶质控：弥散条带目标分布涵盖25-125bp，在25-125bp时具有高强度。
上述应用中，所述孕妇样本为羊水、脐血或绒毛膜穿刺样本。
上述应用中，所述PCR扩增产物的纯化为磁珠纯化。
上述应用中，所述PCR扩增的方法为：
PCR体系为常规PCR体系。
PCR程序：
ABI9700基因扩增仪，但不限制于这一种
NEB公司，DNA片段化酶，但不限制于这一种
使用DNA杂交炉进行杂交，DNA杂交炉可选择市场上任何成熟产品。将样本与芯片装载至杂交炉中，设置杂交炉温度在50℃，以60rmp的转速旋转16-18小时完成杂交。
上述应用中，所述PCR片段化产物为：25-125bp。
以上未详细写明实验步骤的地方，均为本领域普通人员所掌握的普通知识，可根据相应工具书和试剂盒厂家说明进行的已知操作。
本发明的技术优势：
1、所使用的SNP位点为首次使用，尚未此类相关基因SNP被使用或被有意识的使用，进行体外胎儿双胎输血综合征发生的早期评估。
2、所使用本发明采用的探针长度为50个碱基，探针在合成过程中均通过特殊修饰，但不限制于一种修饰方法。通过修饰的探针有利于与PCR产物进行杂交，提高检测的准确度。在发明者应用上述试剂盒后，检测发现了112名NT芯片阳性患者，临床发现，这112名阳性患者在超声检查下均发现胎儿有不同程度的TTTs发生，检测准确性高。
3、相较于国外的全基因组检测芯片来说，本发明所提供的检测芯片和试剂盒可以针对性地对于TTTs进行早起精确的评估，并且不需要准备进行数据分析，直接通过阳性数据得到结果，快速而准确，检测费用预计降低40-50％，极具商业和工业价值。
具体实施方式
实施例1
检测样本：37岁孕妇，样本编号200860080016_R02C01，样本类型：羊水
1、样本准备：将所获得的羊水样本提取gDNA，提取方法可使用illumina公司的相关提取试剂盒
2、PCR扩增：将提取好的DNA进行PCR扩增，使用TITANIUM DNA AmplificationKits，扩增后的PCR产物经磁珠纯化法。
3、定量：使用分光光度计对纯化后的PCR扩增产物进行定量
4、片段化：将产物进行片段化，操作在PCR仪中进行。
5、杂交：处理好的样本与之前制作好的阵列芯片进行杂交
6、洗涤、扫描：杂交后的阵列需经过洗涤，其目的是为了避免未杂交的样本残留在阵列芯片上，进而影响阵列芯片扫描结果。之后将芯片放入illumina公司iScan芯片扫描仪进行扫描。操作方法可参考illumina公司iScan扫描仪说明书。
7、数据分析：所产生的数据由GenomeStudio软件(illumine，San Diego，CA，USA)的基因分型模块分析，200860080016_R02C01 1 0 0 2 2 A A T T G A C C C C C C G AA A C C，阵列芯片结果为阳性，后经超声检查验证，该孕妇双胎妊娠TTTS-Ⅱ期
实施例2
检测样本，30岁孕妇，样本编号201208840108_R03C01，样本类型：羊水。
1、样本准备：将所获得的羊水样本提取gDNA，提取方法可使用illumina公司的相关提取试剂盒。
2、PCR扩增：将提取好的DNA进行PCR扩增，使用TITANIUM DNA AmplificationKits，扩增后的PCR产物经磁珠纯化法。
3、定量：使用分光光度计对纯化后的PCR扩增产物进行定量。
4、片段化：将产物进行片段化，操作在PCR仪中进行。
5、杂交：处理好的样本与之前制作好的阵列芯片进行杂交。
6、洗涤、扫描：杂交后的阵列需经过洗涤，其目的是为了避免未杂交的样本残留在阵列芯片上，进而影响阵列芯片扫描结果。之后将芯片放入illumina公司iScan芯片扫描仪进行扫描。操作方法可参考illumina公司iScan扫描仪说明书。
7、数据分析：所产生的数据由GenomeStudio软件(illumine，San Diego，CA，USA)的基因分型模块分析，201208840108_R03C01 1 0 0 2 2 A A C T G A C C T T C C G AG A C C，阵列芯片结果为阳性，后经超声检查验证，该孕妇TTTS-Ⅲ期。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，应当指出的是，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改造，这些都属于本发明的保护范围，因此，本发明专利的保护范围以所附权利要求为准。
序列表
<120> 一种体外评估胎儿双胎输血综合征发生的SNP阵列芯片
<141> 2017-06-18
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ggaaagcaga gacccacaga caccagcatg gggtcataaa tataaagcct 50
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
aaaggcttga gagggcttgg aagatgattc tatgtcaaac aaatcaatgc 50
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
attcaataac agataagcaa ttcttcccat tctcagagct cttgttacag 50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
aaggaaaggt gggagtagtg aaaagctaat actgagtacc tagtacatac 50
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
cccccaaaaa aatataccca catccgaatc ctggccagct atgaaggtga 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
tcaccagaat cagagacagc ccagcatttc tccaatctcc agcaattctc 50
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
aatttagtgg ttgctgtagg gaatatgcac cttaaaatta gcaccgtaca 50
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
cacacagctg gggagcggca gcattggttg ggacctgtgt tggatttgca 50
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
ccttcagata atgcctgcag aaacgtgcat gctccaagca ctctagaaat 50
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
cactaccatg ggcaggactt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
tgactctcca gggctgatct 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
catgggcagg actttgtgta 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
ctgagcagtt ctgccattga 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
tgctgtgcaa ctgatttgtt c 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
tcacatgctc acacaacatg a 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
aaattcatgc tgtgcaactg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
ttgagagggc ttggaagatg 20
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
cttgtcccca gctgaaaaac 20
<210> 19
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
tggaatggac atcgagtgag 20
<210> 20
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
gcccttatca tcccactgaa 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
gccaccctga aatcttctga 20
<210> 22
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
tagggagctc cttggagtga 20
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
gtgcggtgca cgtatgtact 20
<210> 24
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 24
acttgcaatg ggctgagagt 20
<210> 25
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
atgttggcca gaatggtctc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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aggtgtgagc cacttgtgtg 20
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<212> DNA
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gtgctggaga tgccagtgta 20
<210> 29
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
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<210> 30
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<213> Homo sapiens
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cccagagaat tgctggagat 20
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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agcccttgcc ctatctgtct 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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cggctaggac ttccaatcaa 20
<210> 33
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<213> Homo sapiens
<400> 33
cacgcccagc tagtttttgt 20
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 34
cggctaggac ttccaatcaa 20
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 35
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<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 36
ttgggacctg tgttggattt 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 37
gatgggattc caggtgtgag 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 38
gctcagcccc tacctaggac 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 39
cccagtctgt ggcttgtctt 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 40
aaggtcagag cctgcagaac 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 41
tctgagagtg accccaggag 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 42
cagagcctgc agaacacaga 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 43
cccaggagct ttgagtgtgt 20
Claims (9)
1.一种体外评估胎儿双胎输血综合征发生的SNP阵列芯片，其特征在于，所述阵列芯片含有针对人体染色体2号、5号、6号、7号、8号、9号和19号染色体上，9个相关基因SNP位点的9条探针序列，所述探针序列SEQ ID No：1-9。
2.一种体外评估胎儿双胎输血综合征发生的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒由权利要求1所述的阵列芯片和相关基因的引物对组成，所述引物对为SEQ ID No：10-43。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述相关基因的引物对2对。
4.一种权利要求1所述阵列芯片的制备方法，其特征在于，所述阵列芯片按照探针序列进行DNA合成方法合成为寡核苷酸探针，进行3’和/或5’端羟基化修饰，使用芯片合成设备将制备好的寡核苷酸探针点样至以硝酸纤维素膜或经氨基修饰后的玻璃为介质的阵列基层，最终制成阵列芯片。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述5’或3‘端羟基化修饰方法采用阵列芯片原位合成方法.。
6.一种权利要求1所述的阵列芯片或权利要求2所述的检测试剂盒进行胎儿双胎输血综合征发生体外评估的应用，其特征在于，所述应用由以下步骤组成：
1)样本准备：获取孕妇样本，根据基因提取方法获取样本基因组,使用的限制性内切酶进行消化；2)PCR扩增：将获取的样本基因组使用所述引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；之后需进行PCR扩增产物的纯化，得到纯化后的PCR扩增产物；
3)PCR产物的定量：使用分光光度计对纯化后的PCR扩增产物进行定量，定量方法可按照分光光度计操作指南进行；
4)PCR产物的片段化：对PCR产物进行片段化，以适应芯片探针的长度确保最佳的杂交效果，得到PCR片段化产物；
5)杂交：将步骤4)的PCR片段化产物与所述阵列芯片进行杂交；
6)洗涤、扫描：将杂交后的阵列芯片洗涤，去除未杂交的样本残留；再使用链霉亲和素偶联染料与生物素化抗链霉亲和素抗体两者的复合体对阵列进行染色，而后进行芯片扫描仪的扫描，得到杂交数据；
7)数据分析：所产生的杂交数据由配套软件的基因分型模块进行分析，并判读结果。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述孕妇样本为羊水、脐血或绒毛膜穿刺样本。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增产物的纯化为磁珠纯化。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PCR片段化产物为：25-125bp。
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| US20110150775A1 (en) * | 2008-06-01 | 2011-06-23 | Tufts Medical Center, Inc. | Genomic approaches to fetal treatment and diagnosis |
| CN106460070A (zh) * | 2014-04-21 | 2017-02-22 | 纳特拉公司 | 检测染色体片段中的突变和倍性 |
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