CN109125362A - 刺蒺藜提取物在制备抗疲劳药物以及生物制品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制备技术领域，尤其涉及一种刺蒺藜提取物在制备抗疲劳药物以及生物制品中的应用。本发明克服了现有的刺蒺藜的作用效果仅仅局限于利尿、降压、明目药来使用，没有考察其在抗疲劳方面具有的作用，现有抗疲劳药物中容易导致依赖性和成瘾性，副作用较大且有导致毒性的风险，本发明的有益效果在于：通过探索刺蒺藜提取物对实验动物的抗疲劳作用机制，得出刺蒺藜提取物具有良好的抗疲劳作用，该作用可能与提高实验动物代谢能力和增强应激能力有关。本发明为克服传统抗疲劳药物的不良反应及成瘾性、发展新型抗疲劳药物方面提供一个新的思路。

Description

刺蒺藜提取物在制备抗疲劳药物以及生物制品中的应用

技术领域

本发明属于药物制备技术领域，尤其涉及一种刺蒺藜提取物在制备抗疲劳药物以及生物制品中的应用。

背景技术

随着生活节奏的加快，疲劳问题日益受到重视。随着生活和工作压力的加大，亚健康人群呈增多趋势。抗疲劳已成为生活热点之一。对于特殊人群而言，如经常进行较大强度的训练的、长期处于高温高湿缺氧或密闭等恶劣环境的、长期参与军事训练等的人群，他们的疲劳不但得不到及时消除反而持续产生以至于累加，造成极大的损伤。因而找到有效的药物缓解疲劳或及时的消除疲劳对于临床医学的应用有巨大的意义。

疲劳是与在活力和活动能力方面逐渐衰退有关的常用术语。疲劳可分为两种类型，即中枢性疲劳和周围性疲劳。中枢性疲劳的可能由受损的α-脊髓索神经元放电引起的平均光谱频率对肌电图(EMG)降低和肌电信号的幅度减少，通常表现为肌肉活化作用丧失。外周疲劳主要是肌肉减少最大自发收缩(MVC)。受损机制包括钙离子的释放和再摄取，能量衰竭，失电肌球蛋白和肌动蛋白的相互作用和损害等涉及MVC缩减。除了对身体压力的生理上反应，疲劳也是一个重要的疾病迹象如免疫、血液、风湿，心、肾、内分泌疾病。尽管缓解疲劳有多种选择，但如果病人患有上述疾病，以药物为基础的治疗仍然是必要的，而中药因其副作用少而受到欢迎。中药作为膳食补充剂是治疗疲劳的主要药物，如左旋肉碱，肌酸，辅酶Q10，和铁皮石斛。

疲劳的状态目前广泛存在于生活中，然而疲劳的机制并没有系统性研究。如果长时间处于疲劳状态，机体会内分泌失调，免疫力下降甚至发生器质性病变。因此，抗疲劳是当今社会人们保持良好身体状态的保证。由于疲劳产生机制涉及因素多，并且存在不明确性和复杂性，人们更愿意选择中药调理。这就说明开发中药类抗疲劳药物是目前发展趋势。我国的中药历史悠长且资源丰富,近年来对于天然提取药物的抗疲劳作用机制方面不少专家和学者做了大量工作。许多单味中药或者中药复方制剂都有良好的抗疲劳作用，如当归多糖、、紫河车和理气调补汤、益气生津汤等。

抗疲劳化学药物大多数是通过兴奋大脑皮层、提高中枢系统功能活动等来实现抗疲劳。如果大脑皮层处于抑制状态时，这类药物的兴奋作用就更加明显，如咖啡因、苯丙胺、哌甲酯等。但若长期使用此类药物易导致依赖性和成瘾性，副作用较大且有导致毒性的风险。在临床的使用比较局限。而天然药物的抗疲劳作用大多数以滋养气血为主，不良反应小，较易被接受。

蒺藜，也称刺蒺藜、硬蒺藜、白蒺藜，拉丁学名为Tribulus terrestris L.，为蒺藜科(zygophyllaceae)蒺藜属植物，一年生蔓本植物，是一种在许多国家应用较为广泛的植物药。它起源于地中海地区，目前在世界各地广泛分布，主要在温带地区，国内在山东，陕西，河南，河北和四川等地常见。该药在我国有着悠久的历史。最常用的部分是成熟干果。另外，花、茎、根部等部位也能用作药物。

已知刺蒺藜有一定的强壮作用和抗衰老作用。蒺藜皂甙有使机体强壮的作用，并且可以抑制机体衰老过程中的某些退化性变化(张涛,杨晶,孙少敏等.刺蒺藜对衰老小鼠红细胞SOD活性和MDA含量的影响.[D]佳木斯大学:2001)。根据有关实验：蒺藜皂甙能使衰老小鼠(因d-半乳糖所致衰老的小鼠模型)的脾、胸腺以及机体的重量明显增加，显著降低胆固醇及血糖水平，小鼠(衰老)脾内色素颗粒减少，并且脾内色素颗粒聚集程度有明显改善趋势；大鼠的游泳时间显著延长。对大鼠的肾上腺皮质功能而言，有着双相调节作用。蒺藜皂甙可以增加幼年小鼠肝、胸腺的重量,使小鼠的耐高温和抗寒能力得到提高；对即将羽化的果蝇的生长发育有良好的促进作用，延长果蝇的寿命(曹惠玲,陈浩宏,许士凯.蒺藜及其有效成分的药理与临床研究进展[J].中成药:2001(08).)。但是目前临床上，主要是把刺蒺藜作为利尿、降压、明目药来使用，对其抗疲劳的作用却没有系统的研究。

发明内容

本发明是为了克服现有技术中刺蒺藜的作用效果仅仅局限于利尿、降压、明目药来使用，没有考察其在抗疲劳方面具有的作用，现有抗疲劳药物中容易导致依赖性和成瘾性，副作用较大且有导致毒性的风险，提供了一种能够克服传统抗疲劳药物的不良反应及成瘾性的一种刺蒺藜提取物在制备抗疲劳药物以及生物制品中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

刺蒺藜提取物在制备抗疲劳药物中的应用。

作为优选，所述的刺蒺藜提取物的应用方式为制剂，该制剂包括所述刺蒺藜提取物和药学上可接受的辅料。

作为优选，药学上可接受的辅料选自稀释剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、包衣材料、胶囊材料和成膜材料中的至少一种。

刺蒺藜提取物在制备生物制品中的应用。

作为优选，所述的刺蒺藜提取物为选自水提物、无水乙醇提取物、乙醇水溶液提取物、水蒸气蒸馏挥发油或超临界萃取提取物。

本发明的有益效果是：本发明通过探索刺蒺藜提取物对实验动物的抗疲劳作用机制，得出刺蒺藜提取物具有良好的抗疲劳作用。该作用可能与提高实验动物代谢能力和增强应激能力有关。本发明可能为克服传统抗疲劳药物的不良反应及成瘾性、发展新型抗疲劳药物方面提供一个新的思路。

附图说明

图1是本发明刺蒺藜提取物的红外图谱。

图2是本发明的的单糖标准谱图。

图3为刺蒺藜提取物的单糖检测高效液相图。

图4为刺蒺藜提取物对离体蟾蜍腓肠肌收缩持续时间的影响。

图5为刺蒺藜提取物对小鼠体重的影响图。

图6为刺蒺藜对小鼠游泳时间的影响图。

图7为小鼠的脾指数(mg/g)。

图8为小鼠的肝指数(mg/g)。

图9为刺蒺藜提取物对小鼠SOD影响。

图10为刺蒺藜提取物对小鼠GSH-Px的影响。

图11为刺蒺藜提取物对小鼠CAT的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例与附图对本发明做进一步的解释。

实施例1

刺蒺藜提取物对骨骼肌疲劳作用的影响研究

溶液配制：任氏液的配制：称取6.5g NaCl、0.14g KCl、0.2g NaHCO₃和0.01g NaH₂P0₄分别溶解在适量蒸馏水中，混合后加入蒸馏水至980mL。另取0.12g CaCL₂溶解于20mL蒸馏水中，将CaCl₂溶液逐滴加入至上述溶液，边滴边搅拌，以防产生不溶性的Ca₃(PO₄)₂沉淀。2gC₆H₁₂O₆应在临用前加入，不宜久置。

刺蒺藜提取物溶液配制：将适量刺蒺藜提取物溶解于任氏液中，制成浓度分别为0.1mg/mL,0.5mg/mL和2.5mg/mL的混合物溶液。

刺蒺藜提取物的一般分析：红外检测对环境要求严格，为保证结果的准确性，需确认已无水分、环境中二氧化碳等杂质气体的干扰。本文刺蒺藜提取物的红外分析采用最常用的KBr压片法：将1mg样品和100mg KBr混合，顺着一个方向充分研磨至颗粒尺寸小于2.5μm以下，在红外灯下烘烤半小时确保充分干燥，加入模具中加压得到压片，预热仪器后，用红外光谱仪在400-4000cm^-1的频率范围内进行红外测定，重复测定三次，得到平均红外图谱，其如图1所示。

单糖组成分析：提取物在100℃下用时6h水解成2mL 3M TFA来释放单糖，用40L的0.5M 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)和40L的0.3M NaOH在70℃下衍生2小时。用HPLC系统和RP-C18柱(4.6mm×250mm，5μm，Venusil，USA)进行PMP衍生物的分析以达到分离单糖的目的。

HPLC条件如下：柱温25℃，250nm处测紫外吸光度，流动相为0.02M醋酸钠，流速为1mL/min。

实验分组：电刺激实验随机将蟾蜍分为对照、低、中、高浓度四组：用药浓度分别为0mg/mL，0.1mg/mL,0.5mg/mL和2.5mg/mL，每组6只蟾蜍，将同一只蟾蜍的2条蛙腿的腓肠肌分别作为实验组(刺蒺藜提取物溶液)和对照组(任氏液)。

标本制作：捣毁蟾蜍脑部和脊髓，去腿部外皮后，用蛙钉固定蟾蜍于蛙板，保留大腿部坐骨神经，并在神经下穿线备用，游离腓肠肌，并在腓肠肌的跟腱下方穿线结扎腿腱，用组织剪靠近结扎线远端剪断跟腱(统一蟾蜍肚皮向上时的左腿为对照组，右腿为实验组)，分别浸泡在任氏液和刺蒺藜提取物溶液中15min。

电刺激记录：将系在腓肠肌跟腱一侧的棉线连接至张力换能器，连线松紧适宜，保持一定的负荷力，张力换能器的输出端同RM6240生物信号采集处理系统的一通道相连。设定实验的刺激参数：连续单刺激，强度：10V；波宽：0.3ms。将电极轻触腓肠肌肌腹，开始刺激，波形较稳定后开始记录腓肠肌的收缩曲线，记录收缩幅度下降至最大收缩幅度90％时的时间(t_0.9)，下降至50％时的时间(t_0.5)和下降至10％时的时间(t_0.1)，以s为单位，数据用的形式表示，用配对数据t检验，相较实验组与对照组间的差异。用SPSS19.0统计软件处理数据。

测定疲劳相关的生化参数：收缩实验后，剪取各组等量部分腓肠肌组织，用KCl溶液清洗后，再加入KCl溶液配成含量为10％的匀浆，在冰浴中研磨10min后，置于冷冻离心机中离心15min，取出，吸取上清液，冷冻，后交由南京建成生物工程研究所进行肌乳酸和丙二醛含量检测，整理数据。

刺蒺藜提取物对骨骼肌疲劳作用的结果如下：

蒺藜提取物红外结构：如图1所示，第一峰区：3500-3200cm^-1有一较宽的谱带，推测为N-H或O-H的伸缩振动，可能与刺蒺藜提取物中甾醇、生物碱类物质结构相关；3100-2800cm^-1范围内有多条谱带，为C—H或芳烃的伸缩振动或者是两者同时存在叠加形成的，芳烃结构可能对应提取物中黄酮类化合物成分。第二峰区：2400-2204cm^-1有三条谱带，可能是炔烃或重氮盐及累积双键的伸缩振动；1850-1350cm^-1范围内的多条谱带为羰基或苯环的伸缩振动，可能对应提取物中黄酮类化合物成分；1200-1000cm^-1范围内有谱带强度很大，是糖苷的伸缩振动。

刺蒺藜提取物单糖成分：对刺蒺藜提取物进行高效液相检测，得到图3，可观察到当洗脱进行到40-50min时，出现一个最大吸收峰，且接近顶峰，说明该物质含量较高，与图2的常见单糖标准谱图对比，可知该峰对应的是单糖葡萄糖(Glc)，说明刺蒺藜提取物中有较高含量的葡萄糖。

刺蒺藜提取物对在体肌肉疲劳的影响：对在体腓肠肌电刺激至疲劳，记录曲线收缩下降到不同幅度所需的不同时间。数据如表1和图4所示，蟾蜍的在体腓肠肌在连续单刺激中收缩下降分别达到最大收缩幅度90％、50％、10％时，0.1mg/mL,0.5mg/mL和2.5mg/mL三个浓度的刺蒺藜提取物组所用时间均显著比对照组长，并且刺蒺藜提取物延缓肌肉疲劳的时间呈较明显的剂量依赖性。这表明，刺蒺藜提取物具有延缓骨骼肌疲劳的作用，且存在剂量依赖性。

表1刺蒺藜提取物对离体蟾蜍腓肠肌收缩持续时间的影响

组别	t<sub>0.9</sub>/s	t<sub>0.5</sub>/s	t<sub>0.1</sub>/s
				对照组	115.52±9.14<sup>A</sup>	263.61±12.85<sup>A</sup>	1457.82±91.57<sup>A</sup>
低浓度组(0.1mg/mL)	231.22±11.25<sup>B</sup>	415.34±14.87<sup>B</sup>	1852.61±151.02<sup>B</sup>
				中浓度组(0.5mg/mL)	293.24±14.25<sup>C</sup>	492.42±18.64<sup>C</sup>	2135.56±143.54<sup>C</sup>
高浓度组(2.5mg/mL)	315.64±9.73<sup>D</sup>	571.60±20.35<sup>D</sup>	2965.93±162.54<sup>D</sup>

注：不同大写字母表示同一竖列与对照组之间比较差异显著(P<0.05)。

刺蒺藜提取物对生化参数的影响：如表2所示，生化检测蟾蜍腓肠肌标本肌乳酸和MDA含量结果显示，给药组这两项含量均显著少于对照组，且用药浓度越高，肌乳酸和MDA含量越低。这说明刺蒺藜提取物对降低腓肠肌中肌乳酸和MDA有直接作用。

表2刺蒺藜提取物对蟾蜍腓肠肌标本肌乳酸及肌MDA含量的影响

组别	肌乳酸(mmol/g组织)	MDA(nmol/mg组织)
			对照组	22.56	10.86
低浓度组(0.1mg/mL)	20.45	9.24
			中浓度组(0.5mg/mL)	18.91	8.79
高浓度组(2.5mg/mL)	16.37	7.98

实施例2

刺蒺藜提取物对小鼠抗疲劳作用的研究

实验药材：

刺蒺藜提取物(西安金绿生物工程技术有限公司)；

SOD试剂盒、GSH试剂盒、CAT试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

实验动物：小鼠48只(浙江省实验动物中心提供，许可证号SCXK(浙)2014—0001)，体重28—35g。实验开始前，先在SPF动物实验室，室温环境下标准饲料喂养一周适应环境，设定湿度为40～70％，换气频率为10～20次/小时保持室温(21±5)℃。随机分为四组，每组12只，其中一组为空白对照组，另外三组按照剂量分为低、中、高三组实验组。

刺蒺藜提取物溶液的配制：剂量分别设置为600，200，65mg/kg(即：6，2，0.65mg/10g)，剂量设计依据如下：若成人(体重60kg)临床按2g/d(PO.)，那么中剂量设为临床用量的6倍即200mg/kg，高、低剂量分别设为600、65mg/kg。因此将刺蒺藜提取物按照低、中、高剂量分别称取0.0325g，0.1g，0.3g溶解于10ml无菌水中。小鼠的灌胃体积为20mL/kg。用涡旋振荡器进行适当溶解后，再用超声波进一步溶解。另取10ml无菌水作为对照组。

小鼠灌胃给药：将随机分组的小鼠分别灌胃三周。小鼠分为2批，分别进行小鼠力竭游泳试验与脏器指数计算及生化指标检测。试验小鼠被随机分为4组，分别为刺蒺藜提取物高剂量组(600mg/kg)、刺蒺藜提取物中剂量组(200mg/kg)、刺蒺藜提取物低剂量组(65mg/kg)及空白对照组，每组12只。第1批为每组各6只小鼠，第2批为余下的小鼠。刺蒺藜提取物以无菌水配制，每日灌胃给药1次，连续灌胃3周后测小鼠的各项指标。同时对照组给予10mL无菌水。

小鼠力竭游泳模型建立：参照童敏等人的方法，并根据实验的具体情况稍作修改。在最后一次灌胃之后，第一批小鼠们被允许休息30分钟。然后，将小鼠分别放入烧杯(模拟游泳池)，立即强迫小鼠游泳，记录当老鼠10S内不能上升到水面呼吸时的时间。这段时间，就被认为是小鼠的游泳时间。

小鼠脏器指数和生理生化指标变化：取第2批小鼠，通过摘除眼球收集血液约1ml用于测定生理生化指标(SOD、GSH-PX、CAT)。然后，处死小鼠进行彻底尸检。观察是否病变存在，是否有任何内脏器官的异常，如心脏、肝脏、肾脏。处死小鼠后取肝脏、脾脏，滤纸吸干残留血液，用天平称重并记录，结合当日小鼠的体重得到肝指数及脾指数。

数据分析与统计：用IBM SPSS Statistics 24对小鼠体重、力竭游泳时间、脏器指数、酶谱等生化指标进行方差分析和t检验，结果以平均值±标准差(x±s)来表示。如果对照组与实验组之间有显著差异，即P<0.05，则数据有实验意义，即刺蒺藜有抗疲劳作用。

结果与分析如下：

用刺蒺藜提取物对小鼠灌胃三周内对小鼠体重与行为特征的影响，如表3、图5所示。

小鼠体重的变化反映了刺蒺藜提取物对健康状况的影响，即有无毒副作用。由表3和图5可得，灌胃期间小鼠的体重变化情况。可以明显得到，灌胃期间，小鼠体重无显著差异，说明无统计学意义(P>0.05)。同时观察小鼠的每日行为特征，未见明显的一般行为异常，无因药物致死的现象。表明刺蒺藜提取物对小鼠体重变化无明显影响，即该提取物对小鼠无明显的毒副作用，不影响其正常生长。

表3：刺蒺藜提取物对小鼠体重的影响

值为每组12只小鼠平均值，差异无统计学意义。

刺蒺藜提取物对小鼠游泳时间的影响：小鼠进行耗竭实验后，刺蒺藜对小鼠10S内不能上升到水面的时间影响记录如表4、图6所示。

从小鼠的游泳时间来看，实验组都比对照组强迫游泳时间长，并且有剂量依赖性，有显著差异。开始游泳到疲惫的时间与疲劳程度成反比，小鼠游泳时间可以直接反映小鼠运动耐力水平。游泳时间的延长是最有效的抗疲劳作用指标。可以得出，在一定剂量范围内，剂量越大，刺蒺藜提取物的抗疲劳作用越显著。

表4：刺蒺藜对小鼠游泳时间的影响

组别	数量/只	剂量(mg/kg)	小鼠平均游泳时间/min
				对照组	6	0	12.83±3.3
低剂量组	6	65	28.74±3.9**
				中剂量组	6	200	40.82±4.2*
高剂量组	6	600	61.78±4.0**

值表示每组6只小鼠平均值，差异无统计学意义。*表示与对照组比较，P<0.05**表示与对照组比较，P<0.01。

小鼠脏器指数的变化：小鼠经解剖后对肝脏、脾脏进行称重，从而通过公式计算出肝指数和脾指数。结合当日体重，刺蒺藜提取物对小鼠脏器指数的影响如表5。小鼠的脾指数如图7，小鼠的肝指数如图8。

肝指数的测定公式为：

脾指数的测定公式为：

由结果知，小鼠的肝重有不同程度变化，但差别无统计学意义P>0.05，无显著差异，但从图中依然可以看出肝指数存在一个恢复的过程。小鼠的脾指数低剂量P>0.05，无显著差异，中剂量和高剂量组P<0.05，有显著差异即有统计学意义，说明中剂量和高剂量实验组脾指数增大，且有剂量依赖性。淋巴细胞增殖的程度决定了脾指数的高低，因此可根据脾指数大致估计小鼠免疫功能的强弱。脾指数增大说明免疫功能增强。

表5：刺蒺藜提取物对小鼠脏器指数的影响

	对照组	低剂量组	中剂量组	高剂量组
					小鼠体重(g)	31.8±2.7	34.1±2.0	32.4±1.7	30.6±2.1
肝脏质量(g)	1.901±0.47	1.738±0.39	1.447±0.44	1.678±0.60
					肝指数(mg/g)	59.78±14.77	50.97±11.44	44.66±13.58	54.84±9.60
脾脏质量(g)	0.111±0.04	0.138±0.09	0.140±0.03*	0.159±0.08*
					脾指数(mg/g)	3.49±1.25	4.05±2.64	4.32±0.93*	5.2±2.61*

值表示每组6只小鼠的数据，差异无统计学意义，*表示与对照组比较，P<0.05。

小鼠生理生化指标变化：取血清进行生化检测，得到的小鼠的生理生化指标，如表6，和图9，图10，图11。由表可得，与对照组相比，实验组小鼠的SOD值低剂量组无显著差异，中、高剂量有显著差异，且有剂量依赖性，剂量越高指数越大。同理，与对照组相比，实验组小鼠的GSH-Px值低剂量组无显著差异，而中、高剂量有显著差异，并有剂量依赖性，剂量越高指数越大。就CAT指数来看，实验组和对照组相比存在显著差异，并呈剂量依赖性，剂量越大，酶指数越大。

表6：刺蒺藜对小鼠生理生化指标的影响

	SOD/(U/mL)	GSH-Px/U	CAT/(U/mL)
				对照组	173.88±5.57	14.36±2.15	3.51±0.38
低剂量组	180.58±1.32	17.45±0.88	5.32±0.05*
				中剂量组	189.48±1.18*	20.60±1.29*	6.51±0.24*
高剂量组	207.93±2.52*	23.60±2.35*	6.93±2.27*

注：值表示每组6只小鼠的数据，差异无统计学意义。*表示与对照组比较，P<0.05，有显著差异。SOD：超氧化物歧化酶。GSH-Px：谷胱甘肽过氧化物酶。CAT：过氧化氢酶。

在本实验中，通过观察和耗竭实验及生化检测，研究刺蒺藜的急性毒性和抗疲劳能力，评估该药作为一种天然药物抗疲劳的潜力。中药延缓衰老的主要方式包括通过外源性补充抗氧化物质，或促进内源性抗氧化物质在机体内产生。综上所述，刺蒺藜是一味安全而有效的天然药物。

刺蒺藜存在如此多的药理作用，未来在临床一定会发挥重要作用。通过本实验可以为今后刺蒺藜用于抗疲劳提供理论基础。如今疲劳问题日益受到关注，如何有效利用药物达到抗疲劳效果也是未来发展方向之一，对于抗疲劳药物的研究具有临床意义，更是发展趋势。

Claims (6)

1.刺蒺藜提取物在制备抗疲劳药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的刺蒺藜提取物在制备抗疲劳药物中的应用，其特征在于，所述的刺蒺藜提取物的应用方式为制剂，该制剂包括所述刺蒺藜提取物和药学上可接受的辅料。

3.根据权利要求2所述的所述的刺蒺藜提取物在制备抗疲劳药物中的应用，其特征在于，药学上可接受的辅料选自稀释剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、包衣材料、胶囊材料和成膜材料中的至少一种。

4.根据权利要求1或2或3所述的刺蒺藜提取物在制备抗疲劳药物中的应用，所述的刺蒺藜提取物为选自水提物、无水乙醇提取物、乙醇水溶液提取物、水蒸气蒸馏挥发油或超临界萃取提取物。

5.刺蒺藜提取物在制备生物制品中的应用。

6.根据权利要求5所述的刺蒺藜提取物在制备生物制品中的应用，其特征在于，所述的刺蒺藜提取物为选自水提物、无水乙醇提取物、乙醇水溶液提取物、水蒸气蒸馏挥发油或超临界萃取提取物。