CN109125327A

CN109125327A - 吉非替尼和小檗碱在制备用于治疗肺癌的药物中的应用

Info

Publication number: CN109125327A
Application number: CN201810859929.8A
Authority: CN
Inventors: 韩守威; 郑芳; 吴晶晶; 唐青
Original assignee: Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2019-01-04

Abstract

本发明公开了吉非替尼和小檗碱在制备用于治疗肺癌的药物中的应用，小檗碱可以增加肺癌细胞对吉非替尼的敏感性，小檗碱和吉非替尼能协同治疗肺癌。

Description

吉非替尼和小檗碱在制备用于治疗肺癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及吉非替尼和小檗碱在制备用于治疗肺癌的药物中的应用。

背景技术

肺癌是当前世界各地最常见的恶性肿瘤之一。根据美国NCHS提供的数据预测，2017年美国预计新增肺与支气管肿瘤患者222,500例(约占新增肿瘤病例28％)，死亡患者155,870例(约占因肿瘤死亡病例的52％)，居所有肿瘤的首位。而据中国2015癌症统计数据显示，肺癌已成为中国最常见的癌症，其死亡率很高。大多数肺癌患者在确诊时已属中晚期，失去了手术治疗的最佳时间；即便对于肺癌早期诊断的患者，手术治疗后的复发率也是很高的。考虑到肺癌的各个阶段，肺癌的5年生存率仅为17.7％；若肺癌诊断为IV期，患者的5年生存率则更是低得多(约为2％)。因此，迫切需要寻找能有效治疗肺癌的药物和方法。

肺癌晚期患者的标准治疗方案多为联合铂类的两药化疗法，但其毒副作用大，有效率、中位生存时间以及5年生存率极低，且患者生活质量差。近十年来，随着分子靶向药物应用研究的发展，以吉非替尼和厄洛替尼为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)逐渐用于临床，并取得了较好的效果。在EGFR基因敏感突变人群中，无论是无进展生存时间(PFS)还是生活质量(QOL)，EGFR-TKIs均要比传统化疗有显著优势。据PIONEER研究显示，51.4％未经选择的亚裔晚期肺腺癌患者伴有EGFR敏感突变，且在不吸烟患者中高达60％。尽管如此，另外还有近一半的EGFR突变阴性或者非敏感突变的患者，他们却不能享受EGFR-TKIs物治疗带来的效果。而即使有EGFR基因敏感突变的这部分人，在接受EGFR-TKIs治疗9～13个月后，终将发生耐药机事件，EGFR-TKIs不再敏感而出现疾病进展。因此，如何延缓并克服EGFR-TKIs耐药性，甚至扩大EGFR-TKIs的适用人群，从而实现疗效最大化已成为目前亟待解决的临床难题。

小檗碱(Berberine，BBR)，又名黄连素，是从黄连、黄柏等中药中提取的一种季胺类化合物，属于异喹啉类生物碱，并存在于多种植物中。小檗碱曾是临床治疗消化道感染性疾病的一线药物，其疗效和安全性均得到普遍认可。药理研究发现，小檗碱具有广谱的抗菌、抗病毒，降血糖、血脂，抗心律失常、心力衰竭等药理作用。近年来，随着分子生物学技术的发展以及对小檗碱及其衍生物的深入研究发现，小檗碱在临床肠道肿瘤的防治方面显示出有较好的疗效。国内外的实验研究证明，小檗碱可通过抑制肺癌细胞的生长、转移和侵袭，促进肺癌细胞的凋亡。

但迄今为止，仍没有关于小檗碱联合EGFR-TKIs靶向药物治疗肺癌的研究，也没有揭示如何克服EGFR-TKIs耐药机制。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供吉非替尼和小檗碱在制备用于治疗肺癌的药物中的应用，本发明将吉非替尼和小檗碱联合应用在肺癌的治疗中，以增加肺癌患者对EGFR-TKIs药物治疗的敏感性，提高肺癌的治疗效果。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：吉非替尼和小檗碱，或其药学上可接受的盐在制备用于治疗肺癌的药物中的应用。

吉非替尼和小檗碱，或其药学上可接受的盐表示为吉非替尼或吉非替尼的药学上可接受的盐，与小檗碱或小檗碱的药学上可接受的盐，进行组合。本发明所述的“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的有机盐和无机盐。药学上可接受的盐在所属领域是为我们所熟知的，包含以下几种：1)药学上可接受的无毒的酸形成的盐，如与氨基基团反应形成的无机酸盐，有机酸盐或通过离子交换法来得到的盐；2)其他药学上可接受的盐，如己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐和苯磺酸盐等；3)通过适当的碱得到的盐，如碱土金属和铵的盐。

作为上述技术方案的改进，所述肺癌为非小细胞肺癌。

另外，本发明还提供一种用于治疗非小细胞肺癌的药物组合物，所述药物组合物包含吉非替尼和小檗碱，或其药学上可接受的盐。

作为上述技术方案的改进，吉非替尼与小檗碱的体积摩尔浓度比为1∶2.5～1∶20。当吉非替尼与小檗碱的体积摩尔浓度比为1∶2.5～1∶20时，联合给药指数CI＜0.7，吉非替尼与小檗碱能协同抑制肺癌细胞的生长。

作为上述技术方案的进一步改进，吉非替尼与小檗碱的体积摩尔浓度比为1∶10。

另外，本发明还提供一种包含所述的药物组合物的药物，所述药物还包含药学上可接受的辅料。

本发明所述辅料至少包含赋形剂、粘合剂、稀释剂、表面活性剂、润湿剂、崩解剂或抗氧化剂中的一种。所述赋形剂包括，但并不限于，离子交换剂、铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白、缓冲物质、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸脂、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-阻断聚合体、羊毛脂、糖、葡萄糖和蔗糖、淀粉、纤维素和它的衍生物、树胶粉、麦芽、明胶和滑石粉。所述粘合剂包括羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、淀粉1500、聚乙烯吡咯烷酮(聚烯吡酮)和共聚烯吡酮。所述稀释剂包括甘露醇、山梨醇、磷酸二氢钙二水合物、微晶纤维素和粉化纤维素。所述表面活性剂可以为阴离子、阳离子或中性表面活性剂，阴离子表面活性剂包括月桂基硫酸钠、十二烷基磺酸钠；阳离子表面活性剂包括苯扎氯铵和烷基三甲基溴化铵；中性表面活性剂包括甘油单油酸脂、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸脂、聚乙烯醇和脱水山梨醇脂。所述润湿剂包括泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物和聚氧乙烯硬脂酸脂。所述崩解剂可以是数种改性淀粉、改性纤维素聚合物或者聚羧酸中的一种，比如交联羟甲基纤维素钠、淀粉乙醇酸钠、波拉克林钾和羟甲基纤维素钙。抗氧化剂选自生育酚、L-抗坏血酸和它的钠或者钙盐等。

作为上述技术方案的改进，所述药物的剂型为片剂、膏剂、散剂、汤剂、丸剂或胶囊剂。

本发明的有益效果在于：本发明提供吉非替尼和小檗碱在制备用于治疗肺癌的药物中的应用，吉非替尼和小檗碱联合能显著抑制荷瘤小鼠体表肿瘤的生长，显著抑制体外肺癌细胞的生长，且显著抑制肺癌细胞的侵袭和迁移，这表明小檗碱可以增加肺癌细胞对吉非替尼的敏感性；尤其当吉非替尼与小檗碱的体积摩尔浓度比为1∶2.5～1∶20时，小檗碱和吉非替尼能协同治疗肺癌。

附图说明

图1显示小檗碱联合吉非替尼在体内对荷瘤小鼠体表肿瘤生长的影响；图1A为各组裸鼠体表肿瘤大小直观图和肿瘤体积大小变化及最终肿瘤重量统计图；图1B为各组裸鼠体表瘤体萤光成像图及萤光值统计图；其中，图中＊表示P＜0.05，存在显著性差异；**表示P＜0.01，存在极其显著性差异，以下相同；

图2显示小檗碱联合吉非替尼对体外肺癌细胞生长的影响；图2A显示小檗碱(BBR，50μM)对不同肺癌细胞的生长影响，其中，相对对照组，小檗碱给药组的细胞活性明显降低，差异具有统计学意义(*p＜0.05)；图2B和2D：小檗碱(BBR)联合吉非替尼(GFTN)处理A549和H1975细胞48h后MTT检测细胞存活情况；图2C和2E显示A549和H1975细胞中联合给药指数CI；

图3显示小檗碱联合吉非替尼对A549和H1975细胞侵袭和转移能力，以及EMT相关基因表达的影响；图3A显示小檗碱给药组(BBR，50μM)、吉非替尼给药组(GFTN，10μM)以及联合给药组(BBR，50μM+GFTN，10μM)中A549和H1975细胞的侵袭能力，其中，联合给药组穿透基质胶的细胞数量最少，侵袭能力较弱；图3B显示小檗碱给药组(BBR，50μM)、吉非替尼给药组(GFTN，10μM)以及联合给药组(BBR，50μM+GFTN，10μM)中H1975细胞的迁移能力，其中，联合给药组细胞划痕的距离明显较宽，转移能力较弱；图3C显示小檗碱给药组(BBR，50μM)、吉非替尼给药组(GFTN，10μM)以及联合给药组(BBR，50μM+GFTN，10μM)中A549和H1975细胞的Snai和E-cadherin表达量，其中GADPH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶表达，作为内参对照。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实验和附图对本发明作进一步说明。

实验1 小檗碱联合吉非替尼在体外对非小细胞肺癌细胞的生长抑制作用

1.1实验材料

实验动物：雌性，BALB/c裸小鼠，SPF级，18～20g；购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：11400700200945；接种细胞：A549-Luc肺腺癌细胞。

1.2造模方法

A549-Luc细胞以1×10⁷个/mL重悬于RIPM1640+2％FBS的培养基中，以0.2mL的剂量，经皮下接种至小鼠右侧前肢腋下近背部皮肤处。约5～7天后，选取肿瘤直径大小为3～5mm²的小鼠进行随机分组(肿瘤的长度以及宽度采用游标卡尺进行测量)，每组10只。

1.3分组及给药

本实验共分四组：1)对照组(Control组)：0.2mL生理盐水(含2％DMSO)腹腔注射+0.2mL生理盐水灌胃；2)小檗碱给药组(BBR组)：小檗碱10mg/kg/day，腹腔注射，每天一次；3)吉非替尼给药组(GFTN)：吉非替尼50mg/kg/day，灌胃，每天一次；4)联合给药组(GFTN+BBR组)：小檗碱+吉非替尼，给药方式和给药剂量同单独处理组。

1.4观测指标

1)研究期间一周测量两次小鼠的体重和肿瘤大小，并记录小鼠精神状态、排便、毛发以及进食情况；

2)给药前一天以及处死小鼠前一天分别使用小动物活体成像仪测量小鼠肿瘤大小及其萤光值；

3)处死小鼠后，剥取小鼠皮下肿瘤，拍照并测量实验组和对照组肿瘤大小和数量；肿瘤组织用PBS清洗后，部分用福尔马林固定，石蜡包埋和切片；部分-80℃冰箱保存。

2实验结果

如图1A所示，与对照组比较，小檗碱给药组和吉非替尼给药组的裸鼠体表移植瘤生长速度明显较慢，肿瘤体积显著减小，存在显著性差异；同时，联合给药组对肿瘤生长的抑制效果也显著优于吉非替尼给药组，差异具有统计学意义(p＜0.05)。

如图1B所示，在裸鼠活体的瘤体萤光值检测结果中，联合组给药组的萤光值和肿瘤体积都明显小于对照组、小檗碱给药组和吉非替尼给药组，且与吉非替尼给药组比较，联合组药组的差异具有统计学意义(P＜0.05)。

3结果分析

以上结果显示，小檗碱能显著抑制荷瘤小鼠体表肿瘤的生长，且联合给药组对小鼠的抑瘤效果明显优于吉非替尼给药组和小檗碱给药组；这表明提示在动物体内，小檗碱能增加肺癌细胞对吉非替尼的敏感性。

实验2 小檗碱联合吉非替尼在体外对非小细胞肺癌细胞的生长抑制作用

1.1细胞和试剂

肺癌细胞系A549、H1975、PC9、H1650细胞，均购自上海中国科学院细胞库；小檗碱购买于成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98％，DMSO溶解，以50mM的浓度储存于-20℃，若短期内使用，可分装一部分储存于4℃备用；吉非替尼购买于Selleck公司，粉末，DMSO溶解，以10mM的浓度储存于-20℃。使用含10％胎牛血清(购于Gibco)的1640培养基(购于Gibco)对上述4种细胞进行培养。

1.2 MTT法检测细胞生长情况

取对数生长期的A549、H1975、PC9和H1650细胞，经胰酶消化后加入完全培养基终止消化，1000rpm离心5min，弃去上清，加入完全培养基制成细胞悬液，调整细胞浓度至5000×10⁴个/ml，以100μL/孔接种至96孔板中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后进行药物处理。

药物处理：吸弃96孔板中原培养基，对照组加入完全培养基(含0.2％DMSO)，药物处理组分别加入新鲜配制含小檗碱和(或)吉非替尼的完全培养基，小檗碱终浓度为25或50μM，吉非替尼使用的梯度终浓度为0、2.5、5、10μM。加药后处理48小时后检测各处理组的吸光值。

MMT法：先将96孔板的培养基吸除，然后每孔加入浓度为5mg/mL的MTT溶液100μL，37℃、5％CO₂培养箱中避光孵育4h。取出，小心吸弃MTT溶液，每孔加入100μL DMSO溶液溶解，振荡10min使结晶物充分溶解。用酶标仪于波长为570nm处检测各孔吸光值，记录分析实验结果。

2实验结果

如图2A所示，小檗碱在体外能抑制多种肺癌细胞的生长，包括A549、H1975、PC9和H1650；如图2B和2D所示，相对吉非替尼给药组和小檗碱给药组，联合给药组对肺癌细胞的生长的抑制作用更加显著，且对EGRF不敏感突变的H1975细胞，该作用更加明显，另外，且随着药量的增加，联合给药组的抑制效果进一步显著；如图2C和2E所示，使用CompuSyn软件计算A549和H1975细胞的联合给药指数(CI)，当吉非替尼与小檗碱的体积摩尔浓度比为1∶2.5～1∶20时，CI值在0.3～0.7范围内，吉非替尼与小檗碱能协同抑制肺癌细胞的生长。

3结果分析

以上结果显示，联合给药组在体外对肺癌细胞生长的抑制作用显著优于吉非替尼给药组和小檗碱组，这表明在体外小檗碱可以增加肺癌细胞对吉非替尼的敏感性；同时，当吉非替尼与小檗碱的体积摩尔浓度比为1∶2.5～1∶20时，CI值在0.3～0.7范围内，吉非替尼与小檗碱能协同抑制肺癌细胞的生长。

实验3 小檗碱联合吉非替尼对肺癌细胞的侵袭和转移能力以及EMT(上皮间质转化)相关基因表达的影响

1.1实验材料

肺癌A549和H1975细胞；药物和分组同上；E-cadherin和Snail；抗体均购自CST公司；Matrigel基底胶购于BD公司；Transwell板购自Corning公司；HCL化学发光液购于Millipore公司。

1.2细胞侵袭实验

A549和H1975细胞无血清饥饿过夜；取Transwell板，每个小室加入60μL用含2％FBS的培养基稀释的matrigel胶包被基底膜，同时用含2％FBS的培养基制备细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL(药物处理组需加入相应浓度的药物混匀)，每个小室加入200μL细胞悬液；培养板内下室加入20％FBS的培养基500μL；37℃细胞恒温培养箱中培养24h后取出，弃上清，用棉签轻轻擦拭小室底部，PBS清洗两次，将小室内胶和细胞去除干净；加入4％多聚甲醛500μL固定10min以上，纯水清洗2次；加入500μL结晶紫染料染色10min，自来水下轻轻充分的洗涤干净；于显微镜下观察，拍照。

1.3细胞划痕实验

取新的6孔板，在其底部用记号笔划两条标记线后，再接种5×10⁵个H1975细胞，待细胞长满80％以上，用无菌枪头比着直尺，尽量垂至于背后的标记线划痕，并用PBS清洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基和相应的药物处理24h后，显微镜下观察、拍照。

1.4 Western Bloting

收集并提取各药物处理24h后细胞蛋白样品，变性；配置10％聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)；取30μg各组变性蛋白上样电泳，恒压80V，30min，后转120V，60min；采用半干转膜仪恒压为20V，转膜60min；5％脱脂牛奶进行封闭半小时；根据抗体说明书，按一定比例稀释一抗后，4℃恒温摇床孵育过夜；回收一抗，TBS-T清洗3次，每次10min孵育二抗，室温摇床1h；TBS-T清洗3次，每次10min；加入HCL化学发光液，于化学成像仪曝光成像。

2实验结果

如图3A和3B所示，Transwell细胞侵袭实验以及划痕实验结果显示，相对吉非替尼给药组以及小檗碱给药组而言，小檗碱联合吉非替尼在体外可更加显著的抑制肺癌细胞的侵袭和迁移能力；如图3C所示，Western Bloting的检测结果发现，相对吉非替尼给药组以及小檗碱给药组而言，联合给药组的细胞内转录因子Sail进行显著的下调和E-cadherin蛋白进行显著的上调，下调的细胞内转录因子Sail和上调的E-cadherin蛋白将抑制肺癌细胞的侵袭和转移。

3结果分析

目前已有研究发现EMT过程的发生与肺癌的靶向治疗耐药密切相关，EMT表型状态决定了肺癌细胞(包括NSCLC非小细胞肺癌)对EGFR-TKIs的敏感性及预后。本发明通过联合小檗碱和吉非替尼用于治疗肺癌，高效的治疗结果表明小檗碱可能通过抑制肺癌细胞EMT过程的发生，增加肺癌细胞对吉非替尼的敏感性，甚至可能逆转肺癌细胞对吉非替尼的耐药性。

最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.吉非替尼和小檗碱，或其药学上可接受的盐在制备用于治疗肺癌的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺癌为非小细胞肺癌。

3.一种用于治疗肺癌的药物组合物，其特征在于，还包含吉非替尼和小檗碱，或其药学上可接受的盐。

4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，吉非替尼与小檗碱的体积摩尔浓度比为1∶2.5～1∶20。

5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，吉非替尼与小檗碱的体积摩尔浓度比为1∶10。

6.一种包含如权利要求3～5任一项所述的药物组合物的药物，其特征在于，还包含药学上可接受的辅料。

7.如权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、膏剂、散剂、汤剂、丸剂或胶囊剂。