CN109097496A - 一种用于核酸检测的尿液样本前处理浓缩液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于核酸检测的尿液样本前处理浓缩液，是由浓度0.3M‑3M的NaCl，浓度20%‑60%的硫酸铵溶液，浓度10%‑50%的PEG混合液配制而成，其NaCl、硫酸铵溶液和PEG混合液的配制比例为1.75~17.5:20~60:10~50之质量比。本发明的浓缩液组分中采用的PEG为水溶性非离子型聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，可减少病毒之间的距离，使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起发生共沉淀作用，病毒的相对浓度得以提高，达到沉淀浓缩的目的。由于PEG具有各种不同的分子量，本发明使用不同比例高分子量和高浓度的PEG进行配制，沉淀效率最高。同时本发明在PEG溶液中添加了NaCl和饱和硫酸铵溶液以促进病毒沉淀效果，增强了尿液样本中病毒核酸检测的灵敏度。

Description

一种用于核酸检测的尿液样本前处理浓缩液
技术领域
本发明涉及临床医学检验技术，尤其是涉及一种用于核酸检测的尿液样本前处理浓缩液。
背景技术
尿液检验因其获取简便、收集无创和可提供大量生理变化发展进程的信息而被临床广泛运用。随着医学检验技术的迅速发展，临床分子检测采用尿液样本的项目也随之增多，例如对人巨细胞病毒（HCMV）核酸的检测。有文献证明，在新生儿出生后一周内检测尿液中HCMV是诊断宫内HCMV感染的标准方法。HCMV在肾小球和肾小管上皮细胞内复制，经尿液排出，因此可在尿液中检测HCMV-DNA，但是肾小管为间歇排出HCMV病毒颗粒，排出的尿液中含有的HCMV病毒相对来说量较少，使得临床检测HCMV病毒载量灵敏度不高。由于传统尿液处理方法基本为直接离心取沉淀，加之试剂检测能力有限，很大程度上会导致假阴性结果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于核酸检测的尿液样本前处理浓缩液，采用该浓缩液对尿液样本进行前处理，能增强病毒检测的灵敏度，降低假阴性结果发生率。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的用于核酸检测的尿液样本前处理浓缩液，是由浓度0.3M-3M的NaCl，浓度20%-60%的硫酸铵溶液，浓度10%-50%的PEG混合液配制而成，所述NaCl、硫酸铵溶液和PEG混合液的配制比例为：1.75~17.5:20~60:10~50之质量比。
实际配制时，所述NaCl、硫酸铵溶液和PEG混合液的配制比例为6:35:30之质量比。
所述NaCl的浓度为1M，所述硫酸铵溶液的浓度为35%，所述PEG混合液的浓度为30%。
所述PEG混合液是由PEG6000和PEG8000按4:1之体积比配制而成。
使用时，取1ml尿液和等体积本发明配制的浓缩液涡旋混匀后，12000rpm，离心5min，弃上清；然后在沉淀中加入600 ul生理盐水，涡旋混匀后即可进行后续的核酸病毒检测。
本发明的优点在于：浓缩液组分中采用的PEG（聚乙二醇）为水溶性非离子型聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，可减少病毒之间的距离，使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起发生共沉淀作用，病毒的相对浓度得以提高，达到沉淀浓缩的目的。由于PEG具有各种不同的分子量，本发明使用不同比例高分子量和高浓度的PEG进行配制，沉淀效率最高。同时本发明在PEG溶液中添加了NaCl和饱和硫酸铵溶液以促进病毒沉淀效果，增强了尿液样本中病毒核酸检测的灵敏度。
试验证明，临床对尿液样本检测病毒核酸过程中，由于使用本发明配制的浓缩液，能有效提高样本的检测灵敏度。如配合磁珠法核酸提取试剂和荧光PCR扩增检测技术来检测人巨细胞病毒(HCMV）时，在常规尿液样本前处理过程中，添加尿液浓缩液步骤，最低可检测出HCMV病毒颗粒34.5IU；特异性好，根据临床样本验证结果阴阳性符合率都为100%。所以，本发明的配制的浓缩液对于临床尿液样本检测病毒核酸具有较高的实用价值，适于推广应用。
附图说明
图1是直接离心法和使用本发明浓缩液处理样本的浓缩法的灵敏度对比。
图2是使用本发明浓缩液处理样本的最低检出限。
具体实施方式
实施例1 配制用于核酸检测的尿液样本前处理浓缩液
其组分为：NaCl，浓度为1M；硫酸铵溶液，浓度为35%；PEG混合液（PEG6000:PEG8000=4:1v/v）,浓度为30%；三者之间的配制比例为：NaCl:硫酸铵: PEG混合液=6:35:30 m/m。
实施例2 检测
1、取临床收集阳性HCMV尿液样本，使用实施例1配制的浓缩液处理尿液样本，与常规尿液前处理方法-直接离心法进行平行对比，处理后的样本同时配合专属磁珠法提取试剂和荧光PCR检测试剂进行检测，具体方法为：
1.1本发明方法：取1ml尿液样本和等体积实施例1配制的浓缩液涡旋混匀后，12000rpm，离心5min，弃上清；然后在沉淀中加入600 ul生理盐水，涡旋混匀后备用。
1.2 直接离心法：取1ml尿液样本，12000rpm，离心5min，弃上清；然后在沉淀中加入600 ul生理盐水，涡旋混匀后备用。
1.3 将以上两种方法处理后的样本同时配合磁珠法提取试剂进行核酸提取，提取后核酸产物用荧光PCR检测试剂扩增检测鉴定提取结果，如附图1所示：采用本发明方法--尿液浓缩法比直接离心法的灵敏度更高。
2、取量值溯源为WHO的HCMV阳性临床样本，取正常人尿液为稀释基质，将HCMV阳性临床样本稀释至34.5IU，稀释后的20例样本使用实施例1配制的浓缩液按1.1节的方法进行前处理，处理后的样本同时配合专属磁珠法提取试剂和荧光PCR检测试剂进行检测。
提取后核酸产物用荧光PCR检测试剂扩增检测鉴定提取结果，如图2所示：检测的20例HCMV 34.5IU尿液样本，结果显示全部检出。
3、取57例HCMV临床样本（阳性48例、阴性9例），使用实施例1配制的浓缩液处理尿液样本，处理后的样本同时配合专属磁珠法提取试剂和荧光PCR检测试剂进行检测。
提取核酸产物用荧光PCR检测试剂扩增检测鉴定提取结果，如下表所示：
结论：采用本发明浓缩液处理后的57例HCMV临床尿液样本，与临床结果对比，阴性检出率100%，阳性检出率100%。

Claims (4)

1.一种用于核酸检测的尿液样本前处理浓缩液，其特征在于：是由浓度0.3M-3M的NaCl，浓度20%-60%的硫酸铵溶液，浓度10%-50%的PEG混合液配制而成，所述NaCl、硫酸铵溶液和PEG混合液的配制比例为：1.75~17.5:20~60:10~50之质量比。
2.根据权利要求1所述的用于核酸检测的尿液样本前处理浓缩液，其特征在于： 所述NaCl、硫酸铵溶液和PEG混合液的配制比例为6:35:30之质量比。
3.根据权利要求1或2所述的用于核酸检测的尿液样本前处理浓缩液，其特征在于：所述NaCl的浓度为1M，所述硫酸铵溶液的浓度为35%，所述PEG混合液的浓度为30%。
4.根据权利要求1或2所述的用于核酸检测的尿液样本前处理浓缩液，其特征在于：所述PEG混合液是由PEG6000和PEG8000按4:1之体积比配制而成。
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