CN109097344A - 一种海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents

一种海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及脱氢酶突变体技术领域，具体涉及一种海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体及其应用，所述海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体以海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶NA‑ADH的氨基酸序列为模板，经定点突变技术获得海洋源短链醇脱氢酶突变体，经表达载体重组后转入表达菌株BL21(DE3)中得到含重组短链醇脱氢酶的菌体，然后以β‑羰基十四烷酸酯为底物，经生物酶催化制备(R)‑β‑羟基十四烷酸酯，所得(R)‑β‑羟基十四烷酸酯的手性ee值可以达到99以上，底物转化率达到95％以上，并且制备条件温和，工艺路径简洁。

Description

一种海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及脱氢酶突变体技术领域，具体涉及一种海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体及其应用。
背景技术
奥利司他是一种强效和长效的特异性胃肠道脂肪酶抑制剂，通过直接阻断人体对食物中脂肪的吸收使摄入的热能和脂肪小于消耗的脂肪，从而通过减少体内脂肪达到减重目的，而且奥利司他的有效成分不进入血液循环，不作用于中枢神经，因此副作用较少，不会出现头晕、心慌、失眠、口干等情况，是目前全球唯一的OTC减肥药和最畅销的减肥产品。奥利司他的结构式为：
通过分析可知，(R)-β-羟基十四烷酸酯是合成奥利司他的重要原料。目前制备(R)-β-羟基十四烷酸酯的方法主要是通过手性催化试通过催化还原制成，但是该方法存在反应条件较为苛刻，所得产物的手性ee值较低等不足。
中国专利CN2008100847648，申请日期2008年3月21日，专利名称钌－手性双膦配体络合物及制备方法以及在β－羰基十四烷酸甲酯的催化氢化反应中的应用公开了由手性催化剂[(R)-Ru(MeOBIPHEP)Cl2]2·Et3N不对称催化β-羰基十四烷酸酯制备(R)-β-羟基十四烷酸酯的方法，但需要使反应压力达到60kg/cm2才可达到较高手性ee值，反应条件较严苛。
海洋中存在丰富的微生物资源，是人们寻找和发现重要生物活性物质的重要来源。目前人们已经从海洋细菌、海洋微藻、海洋动物等中分离出众多的具有催化活性的生物物质，用于催化合成化合物。因此，从海洋资源中寻找制备(R)-β-羟基十四烷酸酯的催化活性物质具有重大的潜力和机会。
发明内容
针对目前(R)-β-羟基十四烷酸酯多采用手性催化剂制备的手性ee值较低，反应条件较为苛刻的问题，本发明的目的在于提供一种海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体，可通过生物酶路径制备(R)-β-羟基十四烷酸酯，所得(R)-β-羟基十四烷酸酯的手性ee值可以达到99以上，并且制备条件温和，工艺简洁。
本发明提供如下的技术方案：
一种海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体，所述海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体经以海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶NA-ADH的氨基酸序列为模板，利用定点突变技术构建而成。
本发明所用的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶NA-ADH的氨基酸序列为：
Met Pro Leu Glu Met Thr Ile Ala Leu Asn Asn Val Val Ala Val Val Thr GlyAla Ala Gly Gly Ile Gly Arg Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Ala Ala Asn Ala IleVal Ile Ala Thr Asp Met Ala Pro Ser Ala Asp Val Glu Gly Ala Asp His Tyr LeuGln His Asp Val Thr Ser Glu Ala Gly Trp Lys Ala Val Ala Ala Leu Ala Gln GluLys Tyr Gly Arg Val Asp Ala Leu Val His Asn Ala Gly Ile Ser Ile Val Thr LysPhe Glu Asp Thr Pro Leu Ser Asp Phe His Arg Val Asn Thr Val Asn Val Asp SerIle Ile Ile Gly Thr Gln Val Leu Leu Pro Leu Leu Lys Glu Gly Gly Lys Ala ArgAla Gly Gly Ala Ser Val Val Asn Phe Ser Ser Val Gly Gly Leu Arg Gly Ala AlaPhe Asn Ala Ala Tyr Cys Thr Ser Lys Ala Ala Val Lys Met Leu Ser Lys Cys LeuGly Ala Glu Phe Ala Ala Leu Gly Tyr Asn Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro GlyGly Ile Asp Thr Pro Met Leu Gly Ser Ile Met Asp Lys Tyr Val Glu Leu Gly AlaAla Pro Ser Arg Glu Val Ala Gln Ala Ala Met Glu Met Arg His Pro Leu Gly ArgMet Gly Arg Pro Ala Glu Met Gly Gly Gly Val Val Tyr Leu Cys Ser Asp Ala AlaSer Phe Val Thr Cys Thr Glu Phe Val Met Asp Gly Gly Phe Ser Gln Val。发明人经过研究发现，以该海洋新鞘脂菌(Novosphingobium aromaticivorans)短链醇脱氢酶NA-ADH的原始基因氨基酸序列为模板，利用定点突变技术获得的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体具有催化制备(R)-β-羟基十四烷酸酯的生物活性。
作为本发明的优选，所述海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体为NA-ADH的第145位甘氨酸突变为丙氨酸得到的NA-ADH-M1、NA-ADH的第199位异亮氨酸突变为亮氨酸得到的NA-ADH-M2和NA-ADH的第145位甘氨酸突变为丙氨酸且第199位异亮氨酸突变为亮氨酸得到的NA-ADH-M3中的一种。
海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体NA-ADH-M1的氨基酸序列：
Met Pro Leu Glu Met Thr Ile Ala Leu Asn Asn Val Val Ala Val Val Thr GlyAla Ala Gly Gly Ile Gly Arg Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Ala Ala Asn Ala IleVal Ile Ala Thr Asp Met Ala Pro Ser Ala Asp Val Glu Gly Ala Asp His Tyr LeuGln His Asp Val Thr Ser Glu Ala Gly Trp Lys Ala Val Ala Ala Leu Ala Gln GluLys Tyr Gly Arg Val Asp Ala Leu Val His Asn Ala Gly Ile Ser Ile Val Thr LysPhe Glu Asp Thr Pro Leu Ser Asp Phe His Arg Val Asn Thr Val Asn Val Asp SerIle Ile Ile Gly Thr Gln Val Leu Leu Pro Leu Leu Lys Glu Gly Gly Lys Ala ArgAla Gly Gly Ala Ser Val Val Asn Phe Ser Ser Val Ala Gly Leu Arg Gly Ala AlaPhe Asn Ala Ala Tyr Cys Thr Ser Lys Ala Ala Val Lys Met Leu Ser Lys Cys LeuGly Ala Glu Phe Ala Ala Leu Gly Tyr Asn Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro GlyGly Ile Asp Thr Pro Met Leu Gly Ser Ile Met Asp Lys Tyr Val Glu Leu Gly AlaAla Pro Ser Arg Glu Val Ala Gln Ala Ala Met Glu Met Arg His Pro Ile Gly ArgMet Gly Arg Pro Ala Glu Met Gly Gly Gly Val Val Tyr Leu Cys Ser Asp Ala AlaSer Phe Val Thr Cys Thr Glu Phe Val Met Asp Gly Gly Phe Ser Gln Val。
海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体NA-ADH-M2的氨基酸序列：
Met Pro Leu Glu Met Thr Ile Ala Leu Asn Asn Val Val Ala Val Val Thr GlyAla Ala Gly Gly Ile Gly Arg Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Ala Ala Asn Ala IleVal Ile Ala Thr Asp Met Ala Pro Ser Ala Asp Val Glu Gly Ala Asp His Tyr LeuGln His Asp Val Thr Ser Glu Ala Gly Trp Lys Ala Val Ala Ala Leu Ala Gln GluLys Tyr Gly Arg Val Asp Ala Leu Val His Asn Ala Gly Ile Ser Ile Val Thr LysPhe Glu Asp Thr Pro Leu Ser Asp Phe His Arg Val Asn Thr Val Asn Val Asp SerIle Ile Ile Gly Thr Gln Val Leu Leu Pro Leu Leu Lys Glu Gly Gly Lys Ala ArgAla Gly Gly Ala Ser Val Val Asn Phe Ser Ser Val Gly Gly Leu Arg Gly Ala AlaPhe Asn Ala Ala Tyr Cys Thr Ser Lys Ala Ala Val Lys Met Leu Ser Lys Cys LeuGly Ala Glu Phe Ala Ala Leu Gly Tyr Asn Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro GlyGly Ile Asp Thr Pro Met Leu Gly Ser Leu Met Asp Lys Tyr Val Glu Leu Gly AlaAla Pro Ser Arg Glu Val Ala Gln Ala Ala Met Glu Met Arg His Pro Ile Gly ArgMet Gly Arg Pro Ala Glu Met Gly Gly Gly Val Val Tyr Leu Cys Ser Asp Ala AlaSer Phe Val Thr Cys Thr Glu Phe Val Met Asp Gly Gly Phe Ser Gln Val。
海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体NA-ADH-M3：
Met Pro Leu Glu Met Thr Ile Ala Leu Asn Asn Val Val Ala Val Val Thr GlyAla Ala Gly Gly Ile Gly Arg Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Ala Ala Asn Ala IleVal Ile Ala Thr Asp Met Ala Pro Ser Ala Asp Val Glu Gly Ala Asp His Tyr LeuGln His Asp Val Thr Ser Glu Ala Gly Trp Lys Ala Val Ala Ala Leu Ala Gln GluLys Tyr Gly Arg Val Asp Ala Leu Val His Asn Ala Gly Ile Ser Ile Val Thr LysPhe Glu Asp Thr Pro Leu Ser Asp Phe His Arg Val Asn Thr Val Asn Val Asp SerIle Ile Ile Gly Thr Gln Val Leu Leu Pro Leu Leu Lys Glu Gly Gly Lys Ala ArgAla Gly Gly Ala Ser Val Val Asn Phe Ser Ser Val Ala Gly Leu Arg Gly Ala AlaPhe Asn Ala Ala Tyr Cys Thr Ser Lys Ala Ala Val Lys Met Leu Ser Lys Cys LeuGly Ala Glu Phe Ala Ala Leu Gly Tyr Asn Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro GlyGly Ile Asp Thr Pro Met Leu Gly Ser Leu Met Asp Lys Tyr Val Glu Leu Gly AlaAla Pro Ser Arg Glu Val Ala Gln Ala Ala Met Glu Met Arg His Pro Ile Gly ArgMet Gly Arg Pro Ala Glu Met Gly Gly Gly Val Val Tyr Leu Cys Ser Asp Ala AlaSer Phe Val Thr Cys Thr Glu Phe Val Met Asp Gly Gly Phe Ser Gln Val。
海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体NA-ADH-M1由NA-ADH的第145位甘氨酸突变为丙氨酸得到，海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体NA-ADH-M2由NA-ADH的第199位异亮氨酸突变为亮氨酸得到，海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体NA-ADH-M3由NA-ADH的第145位甘氨酸突变为丙氨酸和第199位异亮氨酸突变为亮氨酸得到。经发明人验证，以温度为30℃、pH值为7的反应条件下突变体每分钟消耗1μmol NADH所需要的酶量表示酶活性，三种海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体的酶活性比较高，其中NA-ADH-M3的酶活最高为25U/mL，NA-ADH-M2为15U/mL，NA-ADH-M1为12U/mL，均高于NA-ADH的5U/mL。
作为本发明的优选，所述海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体为NA-ADH的第145位甘氨酸突变为丙氨酸且第199位异亮氨酸突变为亮氨酸得到的NA-ADH-M3。
上述海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体在制备(R)-β-羟基十四烷酸酯中的应用。
作为本发明方法的优选，上述海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体在制备(R)-β-羟基十四烷酸酯中的应用包括以下步骤：
(1)在海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体的全基因两端引入NdeI和XhoI酶切位点，然后连接到pET26b(+)上，获得海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体的重组表达载体；
(2)将重组表达载体经热激转化法转到表达菌株BL21(DE3)中，培养菌株得菌株培养液；
(3)将菌株培养液离心处理后收集菌体，然后加入0.1mol/L的磷酸盐缓冲液后超声破碎得到含重组短链醇脱氢酶突变体菌体破碎液；
(4)向含有β-羰基十四烷酸酯底物的反应器中加入含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液的反应液，控制pH值为6.8～7.3、温度为30～37℃，反应至底物消耗完全得(R)-β-羟基十四烷酸酯。
作为本发明方法的优选，步骤(2)中菌株培养方法如下：挑取单菌落接入到含卡那霉素的LB培养液中振荡培养，将1mL的培养液加入到含卡那霉素的80～120mL TB培养基中振荡培养至培养基的OD600为3.0，向培养基中添加异丙基硫代半乳糖苷至浓度为0.1mmol/L，然后将培养基置于25℃诱导培养12～24h。
作为本发明方法的优选，步骤(3)中离心速度为5000g，离心时间10～20min。
作为本发明方法的优选，步骤(4)中含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液的反应液中各组份分别为：0.1g/L的NAD+、30g/L的含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液、10g/L的含重组葡萄糖脱氢酶菌体破碎液、100g/L的葡萄糖的0.1mol/L磷酸盐缓冲液；底物的添加量为3～6g底物/100mL反应液。
作为本发明方法的优选，所述(R)-β-羟基十四烷酸酯的结构式为：
其中，分子结构式中的R表示1至8个碳原子的饱和烷基，(R)表示具有手性。
本发明的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体制备(R)-β-羟基十四烷酸酯的过程如下：
将海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体两端经NdeI和Xhol酶切位点连接到pET26b(+)上形成重组表达载体，然后转入表达菌株BL21(DE3)中进行表达得到含重组短链醇脱氢酶的菌体，然后将该菌体破碎后参与到(R)-β-羟基十四烷酸酯的制备反应体系中，以β-羰基十四烷酸酯为底物，通过生物酶催化反应得到的(R)-β-羟基十四烷酸酯的手性ee值在99以上，底物β-羰基十四烷酸酯的转化率达到95％以上，而且反应条件温和，工艺路径简洁。
本发明的有益效果如下：
本发明以海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶NA-ADH的氨基酸序列为模板，经定点突变试剂盒处理得到海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体，经表达载体重组后转入表达菌株BL21(DE3)中得到含重组短链醇脱氢酶的菌体，然后以β-羰基十四烷酸酯为底物，经生物酶催化制备(R)-β-羟基十四烷酸酯，所得(R)-β-羟基十四烷酸酯的手性ee值可以达到99以上，底物转化率达到95％以上，并且制备条件温和，工艺路径简洁。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体，经海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶NA-ADH的氨基酸序列为模板，依据定点突变技术构建而成。
实施例1
一种海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体，为经以海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶NA-ADH的氨基酸序列为模板，依据定点突变技术将NA-ADH中的第145位甘氨酸突变为丙氨酸构建而成的NA-ADH-M1。
实施例2
一种海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体，为经以海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶NA-ADH的氨基酸序列为模板，依据定点突变技术将NA-ADH中的第199位异亮氨酸突变为亮氨酸构建获得的NA-ADH-M2。
实施例3
一种海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体，为经以海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶NA-ADH的氨基酸序列为模板，依据定点突变技术将NA-ADH中的第145位甘氨酸突变为丙氨酸且第199位异亮氨酸突变为亮氨酸而获得的NA-ADH-M3。
由上述海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶NA-ADH得到的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体在制备(R)-β-羟基十四烷酸酯中的应用，其中(R)-β-羟基十四烷酸酯的结构式为：
分子结构式中的R表示1至8个碳原子的饱和烷基，(R)表示具有手性。以(R)-β-羟基十四烷酸甲酯和(R)-β-羟基十四烷酸乙酯的制备为例，其他饱和烷基的酸酯均可采用相同的方法制备。
实施例4
海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体NA-ADH-M1在制备(R)-β-羟基十四烷酸甲酯中的应用，包括以下步骤：
(1)在海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体NA-ADH-M1的全基因两端引入NdeI和XhoI酶切位点，然后连接到pET26b(+)上，获得海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体的重组表达载体pET26b NA-ADH-M1；
(2)将重组表达载体经热激转化法转到表达菌株BL21(DE3)中，然后挑取单菌落接入到含卡那霉素的LB培养液中30℃振荡培养12h，将1mL的培养液加入到含卡那霉素的80mL TB培养基中30℃振荡培养至培养基的OD600为3.0，向培养基中添加异丙基硫代半乳糖苷至浓度为0.1mmol/L，然后将培养基置于25℃诱导培养12h得菌株培养液；
(3)将菌株培养液5000g离心处理10min后收集菌体，然后加入0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH值7.0)后超声破碎得到含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液；
(4)向含有β-羰基十四烷酸甲酯底物的反应器中加入含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液的反应液，其中含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液的反应液中各组份分别为：0.1g/L的NAD+、30g/L的含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液、10g/L的含重组葡萄糖脱氢酶菌体破碎液、100g/L的葡萄糖的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，底物的添加量为3g底物/100mL反应液，然后控制pH值为6.8、温度为30℃，反应至底物消耗完全得(R)-β-羟基十四烷酸甲酯，所得(R)-β-羟基十四烷酸甲酯的手性ee值为99.13％，底物的转化率为95.71％。
实施例5
海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体NA-ADH-M2在制备(R)-β-羟基十四烷酸乙酯中的应用，包括以下步骤：
(1)在海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体NA-ADH-M2的全基因两端引入NdeI和XhoI酶切位点，然后连接到pET26b(+)上，获得海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体的重组表达载体pET26b NA-ADH-M2；
(2)将重组表达载体经热激转化法转到表达菌株BL21(DE3)中，然后挑取单菌落接入到含卡那霉素的LB培养液中35℃振荡培养18h，将1mL的培养液加入到含卡那霉素的120mL TB培养基中35℃振荡培养至培养基的OD600为3.0，向培养基中添加异丙基硫代半乳糖苷至浓度为0.1mmol/L，然后将培养基置于25℃诱导培养16h得菌株培养液；
(3)将菌株培养液5000g离心处理20min后收集菌体，然后加入0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH值7.0)后超声破碎得到含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液；
(4)向含有β-羰基十四烷酸乙酯底物的反应器中加入含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液的反应液，其中含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液的反应液中各组份分别为：0.1g/L的NAD+、30g/L的含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液、10g/L的含重组葡萄糖脱氢酶菌体破碎液、100g/L的葡萄糖的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，底物的添加量为6g底物/100mL反应液，然后控制pH值为7.3、温度为35℃，反应至底物消耗完全得(R)-β-羟基十四烷酸乙酯，所得(R)-β-羟基十四烷酸乙酯的手性ee值为99.24％，底物转化率为96.01％。
实施例6
海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体NA-ADH-M3在制备(R)-β-羟基十四烷酸甲酯中的应用，包括以下步骤：
(1)在海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体NA-ADH-M3的全基因两端引入NdeI和XhoI酶切位点，然后连接到pET26b(+)上，获得海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体的重组表达载体pET26bNA-ADH-M3；
(2)将重组表达载体经热激转化法转到表达菌株BL21(DE3)中，然后挑取单菌落接入到含卡那霉素的LB培养液中37℃振荡培养24h，将1mL的培养液加入到含卡那霉素的100mL TB培养基中37℃振荡培养至培养基的OD600为3.0，向培养基中添加异丙基硫代半乳糖苷至浓度为0.1mmol/L，然后将培养基置于25℃诱导培养24h得菌株培养液；
(3)将菌株培养液5000g离心处理10min后收集菌体，然后加入0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH值7.0)后超声破碎得到含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液；
(4)向含有β-羰基十四烷酸甲酯底物的反应器中加入含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液的反应液，其中含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液的反应液中各组份分别为：0.1g/L的NAD+、30g/L的含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液、10g/L的含重组葡萄糖脱氢酶菌体破碎液、100g/L的葡萄糖的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，底物的添加量为5g底物/100mL反应液，然后控制pH值为7.0、温度为37℃，反应至底物消耗完全得(R)-β-羟基十四烷酸甲酯，所得(R)-β-羟基十四烷酸甲酯的手性ee值为99.42％，底物转化率为96.22％。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体及其应用
<130> JWE182918
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 263
<212> PRT
<213> 海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶NA-ADH(A short-chain alcohol dehydrogenasefrom Novosphingobium aromaticivorans NA-ADH)
<400> 1
Met Pro Leu Gly Met Thr Ile Ala Leu Ala Ala Val Val Ala Val Val
1 5 10 15
Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Ala Gly Leu Val Leu Ala Met Leu
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Ile Val Ile Ala Thr Ala Met Ala Pro Ser Ala Ala
35 40 45
Val Gly Gly Ala Ala His Thr Leu Gly His Ala Val Thr Ser Gly Ala
50 55 60
Gly Thr Leu Ala Val Ala Ala Leu Ala Gly Gly Leu Thr Gly Ala Val
65 70 75 80
Ala Ala Leu Val His Ala Ala Gly Ile Ser Ile Val Thr Leu Pro Gly
85 90 95
Ala Thr Pro Leu Ser Ala Pro His Ala Val Ala Thr Val Ala Val Ala
100 105 110
Ser Ile Ile Ile Gly Thr Gly Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu Gly Gly
115 120 125
Gly Leu Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ser Val Val Ala Pro Ser Ser Val
130 135 140
Gly Gly Leu Ala Gly Ala Ala Pro Ala Ala Ala Thr Cys Thr Ser Leu
145 150 155 160
Ala Ala Val Leu Met Leu Ser Leu Cys Leu Gly Ala Gly Pro Ala Ala
165 170 175
Leu Gly Thr Ala Ile Ala Val Ala Ser Val His Pro Gly Gly Ile Ala
180 185 190
Thr Pro Met Leu Gly Ser Ile Met Ala Leu Thr Val Gly Leu Gly Ala
195 200 205
Ala Pro Ser Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Met Gly Met Ala His Pro
210 215 220
Leu Gly Ala Met Gly Ala Pro Ala Gly Met Gly Gly Gly Val Val Thr
225 230 235 240
Leu Cys Ser Ala Ala Ala Ser Pro Val Thr Cys Thr Gly Pro Val Met
245 250 255
Ala Gly Gly Pro Ser Gly Val
260
<210> 2
<211> 263
<212> PRT
<213> 海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体NA-ADH-M1(Mutant of a short-chainalcohol dehydrogenase from Novosphingobium aromaticivorans NA-ADH-M1)
<400> 2
Met Pro Leu Gly Met Thr Ile Ala Leu Ala Ala Val Val Ala Val Val
1 5 10 15
Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Ala Gly Leu Val Leu Ala Met Leu
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Ile Val Ile Ala Thr Ala Met Ala Pro Ser Ala Ala
35 40 45
Val Gly Gly Ala Ala His Thr Leu Gly His Ala Val Thr Ser Gly Ala
50 55 60
Gly Thr Leu Ala Val Ala Ala Leu Ala Gly Gly Leu Thr Gly Ala Val
65 70 75 80
Ala Ala Leu Val His Ala Ala Gly Ile Ser Ile Val Thr Leu Pro Gly
85 90 95
Ala Thr Pro Leu Ser Ala Pro His Ala Val Ala Thr Val Ala Val Ala
100 105 110
Ser Ile Ile Ile Gly Thr Gly Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu Gly Gly
115 120 125
Gly Leu Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ser Val Val Ala Pro Ser Ser Val
130 135 140
Ala Gly Leu Ala Gly Ala Ala Pro Ala Ala Ala Thr Cys Thr Ser Leu
145 150 155 160
Ala Ala Val Leu Met Leu Ser Leu Cys Leu Gly Ala Gly Pro Ala Ala
165 170 175
Leu Gly Thr Ala Ile Ala Val Ala Ser Val His Pro Gly Gly Ile Ala
180 185 190
Thr Pro Met Leu Gly Ser Ile Met Ala Leu Thr Val Gly Leu Gly Ala
195 200 205
Ala Pro Ser Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Met Gly Met Ala His Pro
210 215 220
Ile Gly Ala Met Gly Ala Pro Ala Gly Met Gly Gly Gly Val Val Thr
225 230 235 240
Leu Cys Ser Ala Ala Ala Ser Pro Val Thr Cys Thr Gly Pro Val Met
245 250 255
Ala Gly Gly Pro Ser Gly Val
260
<210> 3
<211> 263
<212> PRT
<213> 海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体NA-ADH-M2(Mutant of a short-chainalcohol dehydrogenase from Novosphingobium aromaticivorans NA-ADH-M2)
<400> 3
Met Pro Leu Gly Met Thr Ile Ala Leu Ala Ala Val Val Ala Val Val
1 5 10 15
Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Ala Gly Leu Val Leu Ala Met Leu
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Ile Val Ile Ala Thr Ala Met Ala Pro Ser Ala Ala
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ala Ala Leu Val His Ala Ala Gly Ile Ser Ile Val Thr Leu Pro Gly
85 90 95
Ala Thr Pro Leu Ser Ala Pro His Ala Val Ala Thr Val Ala Val Ala
100 105 110
Ser Ile Ile Ile Gly Thr Gly Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu Gly Gly
115 120 125
Gly Leu Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ser Val Val Ala Pro Ser Ser Val
130 135 140
Gly Gly Leu Ala Gly Ala Ala Pro Ala Ala Ala Thr Cys Thr Ser Leu
145 150 155 160
Ala Ala Val Leu Met Leu Ser Leu Cys Leu Gly Ala Gly Pro Ala Ala
165 170 175
Leu Gly Thr Ala Ile Ala Val Ala Ser Val His Pro Gly Gly Ile Ala
180 185 190
Thr Pro Met Leu Gly Ser Leu Met Ala Leu Thr Val Gly Leu Gly Ala
195 200 205
Ala Pro Ser Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Met Gly Met Ala His Pro
210 215 220
Ile Gly Ala Met Gly Ala Pro Ala Gly Met Gly Gly Gly Val Val Thr
225 230 235 240
Leu Cys Ser Ala Ala Ala Ser Pro Val Thr Cys Thr Gly Pro Val Met
245 250 255
Ala Gly Gly Pro Ser Gly Val
260
<210> 4
<211> 263
<212> PRT
<213> 海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体NA-ADH-M3(Mutant of a short-chainalcohol dehydrogenase from Novosphingobium aromaticivorans NA-ADH-M3)
<400> 4
Met Pro Leu Gly Met Thr Ile Ala Leu Ala Ala Val Val Ala Val Val
1 5 10 15
Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Ala Gly Leu Val Leu Ala Met Leu
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Ile Val Ile Ala Thr Ala Met Ala Pro Ser Ala Ala
35 40 45
Val Gly Gly Ala Ala His Thr Leu Gly His Ala Val Thr Ser Gly Ala
50 55 60
Gly Thr Leu Ala Val Ala Ala Leu Ala Gly Gly Leu Thr Gly Ala Val
65 70 75 80
Ala Ala Leu Val His Ala Ala Gly Ile Ser Ile Val Thr Leu Pro Gly
85 90 95
Ala Thr Pro Leu Ser Ala Pro His Ala Val Ala Thr Val Ala Val Ala
100 105 110
Ser Ile Ile Ile Gly Thr Gly Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu Gly Gly
115 120 125
Gly Leu Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ser Val Val Ala Pro Ser Ser Val
130 135 140
Ala Gly Leu Ala Gly Ala Ala Pro Ala Ala Ala Thr Cys Thr Ser Leu
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Ala Pro Ser Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Met Gly Met Ala His Pro
210 215 220
Ile Gly Ala Met Gly Ala Pro Ala Gly Met Gly Gly Gly Val Val Thr
225 230 235 240
Leu Cys Ser Ala Ala Ala Ser Pro Val Thr Cys Thr Gly Pro Val Met
245 250 255
Ala Gly Gly Pro Ser Gly Val
260

Claims (9)

1.一种海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体经以海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶NA-ADH的氨基酸序列为模板，利用定点突变技术构建而成。
2.根据权利要求1所述的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体为NA-ADH的第145位甘氨酸突变为丙氨酸得到的NA-ADH-M1、NA-ADH的第199位异亮氨酸突变为亮氨酸得到的NA-ADH-M2和NA-ADH的第145位甘氨酸突变为丙氨酸且第199位异亮氨酸突变为亮氨酸得到的NA-ADH-M3中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体为NA-ADH的第145位甘氨酸突变为丙氨酸且第199位异亮氨酸突变为亮氨酸得到的NA-ADH-M3。
4.如权利要求1至3任一所述的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体在制备(R)-β-羟基十四烷酸酯中的应用。
5.根据权利要求4所述的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体在制备(R)-β-羟基十四烷酸酯中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体的全基因两端引入NdeI和XhoI酶切位点，然后连接到pET26b(+)上，获得海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体的重组表达载体；
(2)将重组表达载体经热激转化法转到表达菌株BL21(DE3)中，培养菌株得菌株培养液；
(3)将菌株培养液离心处理后收集菌体，然后加入0.1mol/L的磷酸盐缓冲液后超声破碎得到含重组短链醇脱氢酶突变体菌体破碎液；
(4)向含有β-羰基十四烷酸酯底物的反应器中加入含重组短链醇脱氢酶突变体菌体破碎液的反应液，控制pH值为6.8～7.3、温度为30～37℃，反应至底物消耗完全得(R)-β-羟基十四烷酸酯。
6.根据权利要求5所述的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体在制备(R)-β-羟基十四烷酸酯中的应用，其特征在于，步骤(2)中菌株培养方法如下：挑取单菌落接入到含卡那霉素的LB培养液中振荡培养，将1mL的培养液加入到含卡那霉素的80～120mL TB培养基中振荡培养至培养基的OD600为3.0，向培养基中添加异丙基硫代半乳糖苷至浓度为0.1mmol/L，然后将培养基置于25℃诱导培养12～24h。
7.根据权利要求5所述的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体在制备(R)-β-羟基十四烷酸酯中的应用，其特征在于，步骤(3)中离心速度为5000g，离心时间10～20min。
8.根据权利要求5所述的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体在制备(R)-β-羟基十四烷酸酯中的应用，其特征在于，步骤(4)中含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液的反应液中各组份分别为：0.1g/L的NAD+、30g/L的含重组短链醇脱氢酶突变体菌体破碎液、10g/L的含重组葡萄糖脱氢酶菌体破碎液、100g/L的葡萄糖的0.1mol/L磷酸盐缓冲液；底物的添加量为3～6g底物/100mL反应液。
9.根据权利要求5至8任一所述的海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体在制备(R)-β-羟基十四烷酸酯中的应用，其特征在于，所述(R)-β-羟基十四烷酸酯的结构式为：
其中，R表示1至8个碳原子的饱和烷基。
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