CN114854704A - 一种用于制备奥利司他中间体的生物酶及其应用 - Google Patents
一种用于制备奥利司他中间体的生物酶及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114854704A CN114854704A CN202110078799.6A CN202110078799A CN114854704A CN 114854704 A CN114854704 A CN 114854704A CN 202110078799 A CN202110078799 A CN 202110078799A CN 114854704 A CN114854704 A CN 114854704A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reaction system
- seq
- enzyme
- ala
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物制药技术领域，具体公开了一种用于制备奥利司他中间体的生物酶及其应用。本发明提供的生物酶为短链醇脱氢酶，作用于底物β‑羟基十四烷酸酯，以合成高手性ee值(ee＞99％)的奥利司他中间体(R)‑β‑羟基十四烷酸酯，本发明通过对生物酶进行基因工程改造，提高了生物酶的催化效率和稳定性，进而提高底物的转化率和产物产率，降低生产成本，提高酶催化合成奥利司他中间体的经济实用性，本发明的生物酶更适合应用于奥利司他中间体的工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，特别是涉及一种用于制备奥利司他中间体的生物酶及其应用。
背景技术
奥利司他(Orlistat)是第一个上市的非中枢神经作用的减肥药物，也是一种非处方减肥药物。奥利司他直接作用于胃肠道内胃脂肪酶和胰脂肪酶活性部位，使之失活而不能将食物中的脂肪水解，从而抑制人体对脂肪尤其是甘油三酯的吸收，减少热量摄取。奥利司他靶点特异性好，抑制脂肪吸收效果显著，经口服给药，肠道不易吸收，对身体副作用小、安全性好，已被市场广为接受。随着超重乃至肥胖人口增多，奥利司他的市场需求越来越大，因此，有必要进一步提高奥利司他及其中间物的合成效率，降低生产过程中的环境污染。
(R)-β-羟基十四烷酸酯是合成药物奥利司他的重要中间体，该中间体的光学纯度对于奥利司他的制备极为关键。因此，开发一种能高效制备光学纯(R)-β-羟基十四烷酸酯的方法具有重要的应用前景。
中国发明专利CN109022473A提供了一种酶法制备奥利司他中间体(R)-β-羟基十四烷酸酯的方法，该发明利用短链醇脱氢酶催化法制备高手性ee值(ee＞99％)的奥利司他中间体(R)-3-羟基-十四烷酸甲酯，能减少生产成本及对环境的污染。
其中，(R)-β-羟基十四烷酸酯生物催化反应路线为：
R＝CH3或C2H5。
中国发明专利CN111154736A也公开了一种用于制备奥利司他中间体(R)-β-羟基十四烷酸酯的方法，该方法为生物酶法，其生物酶为酮还原酶JR3789，来源于Singulisphaera acidiphila，NCBI数据库中的编码为WP_015245403.1，属于短链脱氢酶家族，大小为249个氨基酸。
对于奥利司他中间体的制备，上述发明提供的生物酶催化方法均体现出条件温和、环境友好、产物纯度高等优势。这表明生物酶(短链醇脱氢酶)催化对于(R)-β-羟基十四烷酸酯的制备具有重要意义。因此，在上述现有技术的基础上，本发明旨在开发一种以β-羰基十四烷酸酯为底物、且催化活性和稳定性更好的新的生物酶(短链醇脱氢酶)，进一步提高底物的转化率和产物产率，降低生产成本。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于制备奥利司他中间体的生物酶及其应用，本发明提供的生物酶为系列短链醇脱氢酶，作用于底物β-羟基十四烷酸酯，以合成高手性ee值(ee＞99％)的奥利司他中间体(R)-β-羟基十四烷酸酯，本发明通过对生物酶进行基因工程改造，提高了所述生物酶的催化效率和稳定性，进一步提高底物的转化率和产物产率，降低生产成本，提高酶催化合成奥利司他中间体的经济实用性。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种用于制备奥利司他中间体的生物酶，所述奥利司他中间体为(R)-β-羟基十四烷酸酯，其结构式如I所示，所述生物酶作用的底物为β-羰基十四烷酸酯，其结构式如II所示；所述生物酶为短链醇脱氢酶，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和/或与SEQ ID NO.1同源性大于90％的序列所示；和/或，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2和/或与SEQ ID NO.2同源性大于90％的序列所示；和/或，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3和/或与SEQID NO.3同源性大于90％的序列所示；
其中，R＝CH3和/或C2H5。
本发明提供的生物酶属于短链醇脱氢酶，其氨基酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3及其同源性大于90％的序列中的至少一种。其中，SEQ ID NO.1来源于Paracoccus pantotrophus的短链醇脱氢酶(GenBank：EU427522.1，protein_id为ACB78182.1)。
氨基酸序列SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.1仅1个氨基酸不同，具体的，仅在SEQ IDNO.1的第245位的丝氨酸突变为半胱氨酸(S245C)。相较于SEQ ID NO.1，该突变提高了蛋白质的稳定性，催化活性也得到提高，尤其在催化底物β-羰基十四烷酸乙酯时，SEQ ID NO.2体现出比SEQ ID NO.1更高的催化活性。
氨基酸序列SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.1仅2个氨基酸不同，具体的，在SEQ IDNO.1的第245位的丝氨酸突变为半胱氨酸(S245C)，在第186位半胱氨酸突变为丝氨酸(C186S)。相较于SEQ ID NO.1，该突变进一步提高了生物酶的稳定性，可溶性蛋白产量更高，由此制备的酶粉、酶蛋白或固定化酶可长期保存，在反应体系可保持活性达24小时以上，未显著衰减。
进一步，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和/或与SEQ ID NO.1同源性为99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％的序列所示；和/或，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2和/或与SEQ ID NO.2同源性为99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％的序列所示；和/或，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3和/或与SEQ ID NO.3同源性为99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％的序列所示。
进一步，所述生物酶为酶蛋白、酶粉、酶液、固定化酶或固定化细菌。
生物酶蛋白表达可以在原核细胞表达或真核细胞表达，包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、黑曲霉。根据生物酶蛋白的氨基酸序列来获得所对应的DNA编码序列，而通过基因工程手段进行蛋白表达、纯化等技术手段为本领域技术人员所熟知的，本发明在此就不再作过多的赘述。
本发明第二方面提供一种含有如第一方面所述的生物酶的反应体系，所述反应体系还包括：底物、辅酶，所述底物为β-羰基十四烷酸酯，其结构式如II所示；所述辅酶为还原型辅酶I NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADH)或还原型辅酶II NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADPH)，和或，所述辅酶为氧化型NAD+或NADP+，和或，所述辅酶为能产生NADPH和/或NADH的酶。
进一步，所述反应体系中，所述生物酶与底物的摩尔比可以为任意比例，例如1∶1-100000；优选地，所述反应体系中，所述生物酶与底物的摩尔比为1∶1000-50000，具体可以为为1∶50000，1∶20000，1∶10000，1∶5000，1∶2000，1∶1000。
进一步，所述反应体系还包括葡萄糖脱氢酶和葡萄糖。葡萄糖为葡萄糖脱氢酶的底物，生物酶在催化底物时，葡萄糖脱氢酶与短链醇脱氢酶协同反应，通过葡萄糖脱氢酶来实现NAD+与NADH或NADP+与NADPH之间的循环转化，来提高辅酶的利用效率。
进一步，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步，所述反应体系中，所述底物与葡萄糖脱氢酶的摩尔比为1∶1.1-2。
进一步，所述反应体系还包括醇；优选地，所述醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、辛醇、戊醇、己醇、庚醇、乙二醇、丙三醇、异丙醇、丙二醇。在本发明的另一个具体的实施例中，所述反应体系中也可以不添加葡萄糖脱氢酶及其底物葡萄糖，添加醇，本发明所述的短链醇脱氢酶自身也可实现NAD+与NADH之间的循环转化，来提高辅酶的利用效率；此时，醇即作为氢供体，也是助溶剂。
进一步，所述反应体系的PH值在6-8之间；优选地，所述反应体系的PH值在7.0-7.5之间；更优选地，采用碳酸氢钠水溶液或氢氧化钠水溶液作为所述反应体系的PH调节剂。本发明中，可通过PH控制器来维持反应体系PH的稳定，维持反应体系相对稳定的PH值的方法为本领域技术人员所熟知的，本发明在此就不再作过多的赘述。
进一步，通过添加缓冲液来维持所述反应体系的PH值；优选地，所述缓冲液为PBS或Tris-HCl。
进一步，所述反应体系还包括用于增加底物溶解性的助溶剂；优选地，所述助溶剂包括但不限于二甲基亚砜、乙醇、丙酮、正己烷、环己烷、甲苯、乙酸乙酯、叔丁醇、异丙醇。在所述反应体系中，通过添加助溶剂增加所述底物的溶解性。
进一步，所述反应体系中，所述辅酶的浓度为0.1-0.5g/L。本发明第三方面提供如第一方面所述的生物酶和/或如第二方面所述的反应体系在制备奥利司他中间体上的应用。
本发明还可以通过甲酸脱氢酶来实现NAD+与NADH之间的循环转化，甲酸脱氢酶的底物是甲酸或甲酸钠。甲酸脱氢酶可以将甲酸氧化为CO2，同时将NAD+还原为NADH。由于甲酸在甲酸脱氢酶作用下转化为CO2，CO2可直接从反应体系中分离出去，使反应接近于不可逆过程。在一个具体的实施例中，甲酸脱氢酶及其底物实现NAD+与NADH之间的循环转化，该方法是本领域技术人员熟知的。甲酸脱氢酶的底物比葡萄糖脱氢酶的底物成本更低，有利于提高反应的原子经济性。
本发明第四方面提供一种采用如第二方面所述的反应体系制备奥利司他中间体的方法，所述方法包括如下步骤：将所述反应体系混合均匀后进行搅拌反应，反应结束后，将反应体系中的酶灭活，然后经萃取、合并有机相、浓缩得到所述奥利司他中间体。
进一步，所述反应体系的反应温度为28-40℃；优选地，所述反应体系的反应温度为30-35℃。其中，反应温度为35℃时，可提高反应速度，但SEQ ID NO.1表达的酶的稳定性变差；反应温度为30℃时，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3表达的酶的稳定性均较好。
进一步，所述反应体系的反应时间为12-24小时；优选地，所述反应体系的反应时间为16-18小时；更优选地，所述反应体系的反应时间为16小时。
进一步，反应结束后，将反应体系升温至80℃，或者80℃以上，保温20分钟及以上，使酶灭活。
进一步，萃取时使用的萃取剂包括但不限于乙醇、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、水、盐酸、醋酸、蚁酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、二甲基亚砜、异丙醇。
如上所述，本发明的用于制备奥利司他中间体的生物酶及其应用，具有以下有益效果：
本发明提供的生物酶为短链醇脱氢酶，作用于底物β-羟基十四烷酸酯，以合成高手性ee值(ee＞99％)的奥利司他中间体(R)-β-羟基十四烷酸酯，本发明通过对生物酶进行基因工程改造，提高了所述生物酶的催化效率和稳定性，从而进一步提高底物的转化率和产物产率，降低生产成本，提高酶催化合成奥利司他中间体的经济实用性。
本发明选择的短链醇脱氢酶均具有优良的生物学特性和工业实用性，采用本发明的生物酶催化制备奥利司他中间体，制备条件温和，对设备要求简单，没有重金属污染，工业废料少，绿色合成，环境友好，非常适合工业化生产。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明提供了一种用于制备奥利司他中间体的生物酶，所述奥利司他中间体为(R)-β-羟基十四烷酸酯，其结构式如I所示，所述生物酶作用的底物为β-羰基十四烷酸酯，其结构式如II所示；所述生物酶为短链醇脱氢酶，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQID NO.1和/或与SEQ ID NO.1同源性大于90％的序列所示；和/或，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2和/或与SEQ ID NO.2同源性大于90％的序列所示；和/或，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3和/或与SEQ ID NO.3同源性大于90％的序列所示。
其中，R＝CH3和/或C2H5。
本发明选择的短链醇脱氢酶均具有优良的生物学特性和工业实用性。为进一步地提高酶本发明所述方法的催化效率或提高酶的稳定性或改善工业实用性，本发明对生物酶的基因工程改良过程如下：
本发明提供的生物酶属于短链醇脱氢酶，其氨基酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.2及其同源性大于90％的序列中的至少一种。其中，SEQ ID NO.1来源于Paracoccus pantotrophus的短链醇脱氢酶(GenBank：EU427522.1，protein_id为ACB78182.1)。
氨基酸序列SEQ ID NO.1：
(其中下划线标注的地方为突变位点。)
氨基酸序列SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.1仅1个氨基酸不同，具体的，仅在SEQ IDNO.1的第245位的丝氨酸突变为半胱氨酸(S245C)。相较于SEQ ID NO.1，该突变提高了蛋白质的稳定性，催化活性也得到提高，尤其在催化底物β-羰基十四烷酸乙酯时，SEQ ID NO.2体现出比SEQ ID NO.1更高的催化活性。
(其中下划线标注的地方为突变位点。)
氨基酸序列SEQ ID NO.2：
氨基酸序列SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.1仅2个氨基酸不同，具体的，在SEQ IDNO.1的第245位的丝氨酸突变为半胱氨酸(S245C)，在第186位半胱氨酸突变为丝氨酸(C186S)。相较于SEQ ID NO.1，该突变进一步地提高了生物酶的稳定性，可溶性蛋白产量更高，由此制备的酶粉、酶蛋白或固定化酶可长期保存，在反应体系可保持活性达24小时以上，未显著衰减。
氨基酸序列SEQ ID NO.3：
(其中下划线标注的地方为突变位点。)
进一步地，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和/或与SEQ ID NO.1同源性为99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％的序列所示；和/或，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2和/或与SEQ ID NO.2同源性为99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％的序列所示；和/或，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3和/或与SEQ ID NO.3同源性为99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％的序列所示。
除了上述突变方式外，本发明的短链醇脱氢酶的氨基酸序列还可以SEQ ID NO.2氨基酸序列为模板，经定点突变构建而成。
例如，在SEQ ID NO.2氨基酸序列上将任意一个半胱氨酸或为非半胱氨酸突变为其他氨基酸，突变位置为SEQ ID NO.2氨基酸序列的第181位氨基酸(C181)或第186位氨基酸(C186)；更优选地，突变为丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸。
进一步地，本发明中的生物酶具体可为酶蛋白、酶粉、酶液、固定化酶或固定化细菌。
生物酶蛋白表达可以在原核细胞表达或真核细胞表达，包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、黑曲霉。根据生物酶蛋白的氨基酸序列来获得所对应的DNA编码序列，而通过基因工程手段进行蛋白表达、纯化等技术手段为本领域技术人员所熟知的，本发明在此就不再作过多的赘述。
本发明提供一种含有上述生物酶的反应体系，用于制备奥利司他中间体，所述反应体系还包括：底物、辅酶、葡萄糖脱氢酶和葡萄糖，所述底物为β-羰基十四烷酸酯，其结构式如II所示；所述辅酶为还原型辅酶I NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADH)或还原型辅酶II NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADPH)，和或，所述辅酶为氧化型NAD+或NADP+，和或，所述辅酶为能产生NADPH和/或NADH的酶。在该反应体系中，葡萄糖为葡萄糖脱氢酶的底物，生物酶在催化底物时，葡萄糖脱氢酶与短链醇脱氢酶协同反应，通过葡萄糖脱氢酶来实现NAD+与NADH或NADP+与NADPH之间的循环转化，来提高辅酶的利用效率。
在本发明的另一个具体的实施例中，所述反应体系中也可以不添加葡萄糖脱氢酶及其底物葡萄糖，本发明所述的短链醇脱氢酶自身也可实现NAD+与NADH之间的循环转化，来提高辅酶的利用效率。即本发明的包括：如上所述的生物酶(即短链醇脱氢酶)、底物、辅酶和醇；具体的，醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、辛醇、戊醇、己醇、庚醇、乙二醇、丙三醇、异丙醇、丙二醇。在该反应体系中，醇即作为氢供体，也是助溶剂。短链醇脱氢酶直接以醇为氢供体，使氧化型辅酶NAD+还原为NADH。例如，以β-羰基十四烷酸甲酯为反应底物，异丙醇为氢供体，在辅酶的参与下，生成(R)-β-羟基十四烷酸甲酯。醇的初始浓度一般为在2％-10％(v/v)之间，或者为5％(v/v)，或者低于5％(v/v)，为4％(v/v)、3％(v/v)、2％(v/v)。醇的含量会随反应进行时间逐步降低，可以通过补加醇的方式提高其在反应体系中的浓度。
进一步地，所述反应体系中，所述生物酶与底物的摩尔比可以为任意比例，例如1∶1-1∶100000；优选地，所述反应体系中，所述生物酶与底物的摩尔比为1∶1000-50000，具体可以为1∶50000，1∶20000，1∶10000，1∶5000，1∶2000，1∶1000。
进一步地，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
氨基酸序列SEQ ID NO.4：
进一步地，所述反应体系中，所述底物与葡萄糖脱氢酶的摩尔比为1∶1.1-2。
进一步地，所述反应体系的PH值在6-8之间；优选地，所述反应体系的PH值在7.0-7.5之间；更优选地，采用碳酸氢钠水溶液或氢氧化钠水溶液作为所述反应体系的PH调节剂。本发明中，可通过PH控制器来维持反应体系PH的稳定，维持反应体系相对稳定的PH值的方法为本领域技术人员所熟知的，本发明在此就不再作过多的赘述。
进一步地，通过添加缓冲液来维持所述反应体系的PH值；优选地，所述缓冲液为PBS或Tris-HCl。
进一步地，在所述反应体系中，通过添加助溶剂增加所述底物的溶解性，所述助溶剂包括但不限于二甲基亚砜、乙醇、丙酮、正己烷、环己烷、甲苯、乙酸乙酯、叔丁醇、异丙醇。
进一步地，所述反应体系中，所述辅酶的浓度为0.1-0.5g/L。
本发明中，采用上述反应体系制备奥利司他中间体的方法为：将所述反应体系混合均匀后进行搅拌反应，反应结束后，将反应体系中的酶灭活，然后经萃取、合并有机相、浓缩得到所述奥利司他中间体。
进一步地，所述反应体系的反应温度为28-40℃；优选地，所述反应体系的反应温度为30-35℃。其中，反应温度为35℃时，可提高反应速度，但对部分酶的稳定性会有一定的影响。
进一步地，所述反应体系的反应时间为12-24小时；优选地，所述反应体系的反应时间为16-20小时；更优选地，所述反应体系的反应时间为16小时。
进一步地，反应结束后，将反应体系升温至80℃及以上，使酶灭活。
进一步地，萃取时使用的萃取剂包括但不限于乙醇、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、水、盐酸、醋酸、蚁酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、二甲基亚砜、异丙醇。
本发明中所述的生物酶(SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3)及葡糖糖脱氢酶(SEQ ID NO.4)均由安徽环球基因科技有限公司公司合成基因，并表达蛋白。
以下实施例中，HPLC检测条件：OD-H色谱柱；流动相为正己烷∶异丙醇＝98∶2；流速1.0mL/min，检测仪器规格参数为：Agilent DAD1 C，Sig＝210，4Ref＝360，100。
下面通过具体的实施例来对本发明的内容进行进一步说明。
实施例1
1、将生物酶(SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3)及葡糖糖脱氢酶(SEQ IDNO.4)的氨基酸序列分别转换成DNA序列，并进行密码子优化，获得的基因序列进行全合成，并克隆到表达质粒载体PET-22b(+)中。
2、将含酶基因的质粒转化BLtrxB21(DE3)感受态细胞，涂板后37℃倒置培养过夜。
选取单克隆于5管LB培养液，37℃培养至菌体OD600为0.6-0.8，分别加入IPTG至终浓度为0.2mM、0.4nM、0.5nM、0.7nM、1mM，分别在37℃和15℃，220rpm培养4h和16h，诱导融合蛋白表达，各条件取培养液制样进行SDS-PAGE分析；同时，各条件菌液离心收集菌体，破碎(buffer：Tris-NaCl pH8.0)，上清沉淀分别制样，进行SDS-PAGE分析。获得最佳菌株，并确认最佳IPTG诱导浓度和蛋白表达温度。
3、取表达最优克隆菌株，37℃扩大培养1L至OD600＝0.6～0.8，37℃诱导4h后收菌；离心收菌，用浓度为0.1M、pH为7.0的磷酸盐缓冲液重悬菌体，菌体与磷酸缓冲溶液的固液比为2g/1mL，重悬菌体，超声破碎；再离心去除沉淀，所得液体即为含重组酶的酶液。酶液可用于后续实施例的酶催化用途。
4、将部分酶液进一步纯化，以得到活性更稳定的酶蛋白，破碎后的上清酶液进行Ni柱亲和层析纯化，所用纯化条件为：
平衡缓冲液：“Tris-NaCl-8M”buffer，pH8.0；
清洗缓冲液：“Tris-NaCl-8M”buffer，pH8.0含50mM imidazole；
洗脱缓冲液：“Tris-NaCl-8M”buffer，pH8.0 with 500mM imidazole。
5、结果显示：
(1)、37℃条件下利用0.5mM IPTG诱导表达，目的蛋白在相应条件下均有表达。
(2)、通过温度(37℃与15℃)和IPTG浓度(终浓度为0.2mM和1.0mM)的不同条件进行诱导，超声波破碎，结果显示，目的蛋白可溶。
(3)、通过37℃、0.2mM IPTG诱导进行放大培养，上清过Ni柱纯化后未得到目的蛋白，细胞破碎液过Ni柱纯化后得到目的蛋白。蛋白溶解在20mM Tris-HCl，pH 7.2中无沉淀。经SDS-PAGE分析，蛋白纯度均大于90％。
(4)、根据紫外分光光度计波长280nm检测，SEQ ID NO.3基因的表达产量在细胞破碎液中最高，总得率约比SEQ ID NO.1基因的表达产量提高约30％；SEQ ID NO.2基因的表达产量在细胞破碎液中最低，约为SEQ ID NO.1基因的90％。
实施例2
将底物β-羰基十四烷酸乙酯0.25ml、葡萄糖0.25g置于100mL的三角玻璃摇瓶中，再加入25mL的浓度0.1M、pH为7.5的PBS缓冲液，再加入1mg NAD+、0.025ml葡萄糖脱氢酶酶液(氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示)，以及0.1ml短链醇脱氢酶酶液，置于磁力搅拌器中搅拌均匀。将摇瓶置于恒温培养摇床中，转速200转/分钟，温度30℃，过夜反应16小时，用HPLC检测产物转化率。短链脱氢酶酶液分别选自氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3，分别命名为ADH1、ADH2、ADH3。
经HPLC检测，两种短链脱氢酶酶液均能转化底物，其中ADH1转化率为94.1％，ADH2转化率为97.5％，ADH3转化率为97.7％。
实施例3
将底物β-羰基十四烷酸乙酯0.25ml、葡萄糖0.25g置于100mL的三角玻璃摇瓶中，再加入25mL的浓度0.1M、pH为7.5的PBS缓冲液，再加入1mg NAD+、0.025ml葡萄糖脱氢酶酶液(氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示)，以及0.1ml短链醇脱氢酶酶液，置于磁力搅拌器中搅拌均匀。将摇瓶置于恒温培养摇床中，转速200转/分钟，温度35℃，过夜反应16小时，用HPLC检测产物转化率。短链脱氢酶酶液分别选自氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3，分别命名为ADH1、ADH2、ADH3。
经HPLC检测，两种短链脱氢酶酶液均能转化底物，其中ADH1转化率为91.6％，ADH2转化率为97.7％，ADH3转化率为98.5％。
实施例4
将底物β一羰基十四烷酸乙酯50g加入到2L反应器中，再将500mL含有5ml重组葡萄糖脱氢酶菌体破碎液(氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，采用实施例1的方法制得)、50g葡萄糖、0.05g NAD+、5ml重组短链醇脱氢酶菌体破碎液(氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，采用实施例1的方法制得)的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)加入该反应器中，利用pH自动控制系统和1M Na2CO3溶液控制酶反应的pH值为7.5左右，搅拌桨转速200转/分钟。30℃反应20小时，反应已终止，约2小时未消耗Na2CO3溶液。经HPLC检测反应液，未明显测出底物峰，底物转化率接近100％。
反应结束后，将反应体系升温至80℃维持20分钟以使酶灭活，然后将反应液倒入大烧瓶中，冷水浴至25±5℃，加入等体积的乙酸乙酯萃取有机相，水相再次加入等体积的乙酸乙酯萃取有机相。合并有机相浓缩得产物48.65g，收率大于97％，产物手性ee值大于99％。
实施例5
将底物β-羰基十四烷酸乙酯50g加入到2L反应器中，再将500mL含有5ml重组葡萄糖脱氢酶菌体破碎液(氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，采用实施例1的方法制得)、50g葡萄糖、0.05g NAD+、5ml重组短链醇脱氢酶菌体破碎液(氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，采用实施例1的方法制得)的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)加入该反应器中，利用pH自动控制系统和1M Na2CO3溶液控制酶反应的pH值为7.5左右，搅拌桨转速200转/分钟。35℃反应16小时，反应已终止，约2小时未消耗Na2CO3溶液。经HPLC检测反应液，未明显测出底物峰，底物转化率接近100％。
反应结束后，将反应体系升温至80℃维持20分钟以使酶灭活，然后将反应液倒入大烧瓶中，冷水浴至25±5℃，加入等体积的乙酸乙酯萃取有机相，水相再次加入等体积的乙酸乙酯萃取有机相。合并有机相浓缩得产物48.15g，得率96.3％。产物手性ee值大于99％。
实施例6
将底物β-羰基十四烷酸甲酯50g加入到2L反应器中，再将500mL含0.05g NAD+、5ml重组短链醇脱氢酶菌体破碎液(氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，采用实施例1的方法制得)、25ml异丙醇的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)加入该反应器中，利用pH自动控制系统和1MNa2CO3溶液控制酶反应的pH值为7.5左右，搅拌桨转速200转/分钟。35℃反应24小时，反应已终止，约2小时未消耗Na2CO3溶液。经HPLC检测反应液，底物转化率约为94％。
反应结束后，将反应体系升温至80℃维持20分钟以使酶灭活，然后将反应液倒入大烧瓶中，冷水浴至25±5℃，加入等体积的乙酸乙酯萃取有机相，水相再次加入等体积的乙酸乙酯萃取有机相。合并有机相浓缩得产物45.2g，得率90.4％。产物手性ee值大于96％。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 合肥立方制药股份有限公司
<120> 一种用于制备奥利司他中间体的生物酶及其应用
<130> PHFXC209735-HZ
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 262
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 1
<400> 1
Met Ser Asn Ser Val Glu Gly Arg Val Val Ile Val Thr Gly Ala Gly
1 5 10 15
Arg Gly Ile Gly Arg Ser Ile Ala Glu Gly Leu Ala Gln Ala Gly Ala
20 25 30
Arg Val Val Ile Ala Asp Ile Ala Ala Asp Thr Ala Glu Thr Thr Ala
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Glu Ala Gly Gly Gln Ala Ile Gly Leu Ala Val Asp
50 55 60
Val Thr Asp Arg Ala Ser Thr Arg Ala Leu Ile Ala Arg Thr Val Ala
65 70 75 80
Glu His Gly Arg Leu Asp Ala Met Phe Asn Asn Ala Gly Ile Ala Gln
85 90 95
Val Lys Pro Phe Asn Asp Ile Thr Glu Asp Asp Trp His Arg Val Met
100 105 110
Asp Val Asn Ala Met Gly Val Leu Ile Gly Ile Gln Glu Ala Ala Arg
115 120 125
Gln Phe Ile Ala Gln Gly Gly Gly Gly Lys Ile Val Asn Thr Ala Ser
130 135 140
Ile Ala Gly Lys Gln Gly Tyr Glu Pro Leu Ala His Tyr Ser Ala Ser
145 150 155 160
Lys Phe Ala Val Val Ala Leu Thr Gln Ala Ala Ala Arg Ala Phe Gly
165 170 175
Lys His Gly Ile Cys Val Asn Ala Ile Cys Pro Gly Val Val Ala Thr
180 185 190
Asp Met Trp Lys Leu Ile Asp Lys Gly Phe Lys Asp Glu Gly Leu Thr
195 200 205
Ser Arg Asp Asn Glu Ala Phe Glu Gly Phe Ser Ala Asp Ile Leu Leu
210 215 220
Gly Arg Pro Ser Arg Pro Glu Asp Leu Ala Gly Val Ser Ile Phe Leu
225 230 235 240
Ala Ser Ala Gly Ser Asp Tyr Met Thr Gly Gln Ser Leu Val Val Asp
245 250 255
Gly Gly Met Val Leu Leu
260
<210> 2
<211> 262
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 2
<400> 2
Met Ser Asn Ser Val Glu Gly Arg Val Val Ile Val Thr Gly Ala Gly
1 5 10 15
Arg Gly Ile Gly Arg Ser Ile Ala Glu Gly Leu Ala Gln Ala Gly Ala
20 25 30
Arg Val Val Ile Ala Asp Ile Ala Ala Asp Thr Ala Glu Thr Thr Ala
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Glu Ala Gly Gly Gln Ala Ile Gly Leu Ala Val Asp
50 55 60
Val Thr Asp Arg Ala Ser Thr Arg Ala Leu Ile Ala Arg Thr Val Ala
65 70 75 80
Glu His Gly Arg Leu Asp Ala Met Phe Asn Asn Ala Gly Ile Ala Gln
85 90 95
Val Lys Pro Phe Asn Asp Ile Thr Glu Asp Asp Trp His Arg Val Met
100 105 110
Asp Val Asn Ala Met Gly Val Leu Ile Gly Ile Gln Glu Ala Ala Arg
115 120 125
Gln Phe Ile Ala Gln Gly Gly Gly Gly Lys Ile Val Asn Thr Ala Ser
130 135 140
Ile Ala Gly Lys Gln Gly Tyr Glu Pro Leu Ala His Tyr Ser Ala Ser
145 150 155 160
Lys Phe Ala Val Val Ala Leu Thr Gln Ala Ala Ala Arg Ala Phe Gly
165 170 175
Lys His Gly Ile Cys Val Asn Ala Ile Cys Pro Gly Val Val Ala Thr
180 185 190
Asp Met Trp Lys Leu Ile Asp Lys Gly Phe Lys Asp Glu Gly Leu Thr
195 200 205
Ser Arg Asp Asn Glu Ala Phe Glu Gly Phe Ser Ala Asp Ile Leu Leu
210 215 220
Gly Arg Pro Ser Arg Pro Glu Asp Leu Ala Gly Val Ser Ile Phe Leu
225 230 235 240
Ala Ser Ala Gly Cys Asp Tyr Met Thr Gly Gln Ser Leu Val Val Asp
245 250 255
Gly Gly Met Val Leu Leu
260
<210> 3
<211> 262
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 3
<400> 3
Met Ser Asn Ser Val Glu Gly Arg Val Val Ile Val Thr Gly Ala Gly
1 5 10 15
Arg Gly Ile Gly Arg Ser Ile Ala Glu Gly Leu Ala Gln Ala Gly Ala
20 25 30
Arg Val Val Ile Ala Asp Ile Ala Ala Asp Thr Ala Glu Thr Thr Ala
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Glu Ala Gly Gly Gln Ala Ile Gly Leu Ala Val Asp
50 55 60
Val Thr Asp Arg Ala Ser Thr Arg Ala Leu Ile Ala Arg Thr Val Ala
65 70 75 80
Glu His Gly Arg Leu Asp Ala Met Phe Asn Asn Ala Gly Ile Ala Gln
85 90 95
Val Lys Pro Phe Asn Asp Ile Thr Glu Asp Asp Trp His Arg Val Met
100 105 110
Asp Val Asn Ala Met Gly Val Leu Ile Gly Ile Gln Glu Ala Ala Arg
115 120 125
Gln Phe Ile Ala Gln Gly Gly Gly Gly Lys Ile Val Asn Thr Ala Ser
130 135 140
Ile Ala Gly Lys Gln Gly Tyr Glu Pro Leu Ala His Tyr Ser Ala Ser
145 150 155 160
Lys Phe Ala Val Val Ala Leu Thr Gln Ala Ala Ala Arg Ala Phe Gly
165 170 175
Lys His Gly Ile Cys Val Asn Ala Ile Ser Pro Gly Val Val Ala Thr
180 185 190
Asp Met Trp Lys Leu Ile Asp Lys Gly Phe Lys Asp Glu Gly Leu Thr
195 200 205
Ser Arg Asp Asn Glu Ala Phe Glu Gly Phe Ser Ala Asp Ile Leu Leu
210 215 220
Gly Arg Pro Ser Arg Pro Glu Asp Leu Ala Gly Val Ser Ile Phe Leu
225 230 235 240
Ala Ser Ala Gly Cys Asp Tyr Met Thr Gly Gln Ser Leu Val Val Asp
245 250 255
Gly Gly Met Val Leu Leu
260
<210> 4
<211> 261
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 4
<400> 4
Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala
1 5 10 15
Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala
20 25 30
Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu Val
35 40 45
Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln Gly
50 55 60
Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Ile
65 70 75 80
Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu
85 90 95
Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys Val
100 105 110
Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile
115 120 125
Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser
130 135 140
Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala
145 150 155 160
Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr
165 170 175
Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala Asp
195 200 205
Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile
210 215 220
Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val Thr
225 230 235 240
Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser Phe
245 250 255
Gln Ala Gly Arg Gly
260
Claims (10)
1.一种用于制备奥利司他中间体的生物酶，所述奥利司他中间体为(R)-β-羟基十四烷酸酯，其结构式如I所示，所述生物酶作用的底物为β-羰基十四烷酸酯，其结构式如II所示；其特征在于，所述生物酶为短链醇脱氢酶，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和/或与SEQ ID NO.1同源性大于90％的序列所示；
和/或，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2和/或与SEQ ID NO.2同源性大于90％的序列所示；
和/或，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3和/或与SEQ ID NO.3同源性大于90％的序列所示；
其中，R＝CH3和/或C2H5。
2.根据权利要求1所述的生物酶，其特征在于：所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQID NO.1和/或与SEQ ID NO.1同源性为99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％的序列所示；和/或，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2和/或与SEQ IDNO.2同源性为99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％的序列所示；和/或，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3和/或与SEQ ID NO.3同源性为99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％的序列所示。
3.根据权利要求1所述的生物酶，其特征在于：所述生物酶为酶蛋白、酶粉、酶液、固定化酶或固定化细菌。
4.含有权利要求1-3任一项所述的生物酶的反应体系，其特征在于：所述反应体系还包括：底物、辅酶，所述底物为β-羰基十四烷酸酯，其结构式如II所示；所述辅酶为还原型辅酶I NADH或还原型辅酶II NADPH，和/或，所述辅酶为氧化型NAD+或NADP+，和/或，所述辅酶为能产生NADPH和/或NADH的酶。
5.根据权利要求4所述的反应体系，其特征在于：所述反应体系还包括葡萄糖脱氢酶和葡萄糖，或者，所述反应体系还包括醇；
和/或，所述反应体系的PH值在6-8之间；
和/或，所述反应体系还包括用于增加底物溶解性的助溶剂；
和/或，所述反应体系中，所述辅酶的浓度为0.1-0.5g/L。
6.根据权利要求5所述的用于制备奥利司他中间体的生物酶及其应用，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
和/或，所述反应体系中，所述底物与葡萄糖脱氢酶的摩尔比为1∶1.1-2；
和/或，所述反应体系的PH值在7.0-7.5之间；
和/或，采用碳酸氢钠水溶液或氢氧化钠水溶液作为所述反应体系的PH调节剂；
和/或，所述缓冲液为PBS或Tris-HCl；
和/或，所述醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、辛醇、戊醇、己醇、庚醇、乙二醇、丙三醇、异丙醇、丙二醇中的至少一种。
和/或，所述助溶剂选自二甲基亚砜、乙醇、丙酮、正己烷、环己烷、甲苯、乙酸乙酯、叔丁醇、异丙醇中的至少一种。
7.如权利要求1-3任一项所述的生物酶和/或如权利要求4-6任一项所述的反应体系在制备奥利司他中间体上的应用。
8.一种采用如权利要求4-6任一项所述的反应体系制备奥利司他中间体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将所述反应体系混合均匀后进行搅拌反应，反应结束后，将反应体系中的酶灭活，然后经萃取、合并有机相、浓缩得到所述奥利司他中间体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述反应体系的反应温度为28-40℃；
和/或，所述反应体系的反应时间为12-24小时；
和/或，反应结束后，将反应体系升温至80℃或者80℃以上，使酶灭活；
和/或，取时使用的萃取剂选自乙醇、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、水、盐酸、醋酸、蚁酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、二甲基亚砜、异丙醇中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述反应体系的反应温度为30-35℃；
和/或，所述反应体系的反应时间为12-24小时。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110078799.6A CN114854704B (zh) | 2021-01-20 | 2021-01-20 | 一种用于制备奥利司他中间体的生物酶及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110078799.6A CN114854704B (zh) | 2021-01-20 | 2021-01-20 | 一种用于制备奥利司他中间体的生物酶及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114854704A true CN114854704A (zh) | 2022-08-05 |
| CN114854704B CN114854704B (zh) | 2023-10-10 |
Family
ID=82622790
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110078799.6A Active CN114854704B (zh) | 2021-01-20 | 2021-01-20 | 一种用于制备奥利司他中间体的生物酶及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114854704B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150275245A1 (en) * | 2011-12-22 | 2015-10-01 | Evonik Industries Ag | Biotechnological production of alcohols and derivatives thereof |
| CN109022473A (zh) * | 2018-08-13 | 2018-12-18 | 浙江海洋大学 | 一种酶法制备奥利司他中间体的方法 |
| CN109097344A (zh) * | 2018-08-07 | 2018-12-28 | 浙江海洋大学 | 一种海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体及其应用 |
| CN111154736A (zh) * | 2020-01-07 | 2020-05-15 | 重庆植恩药业有限公司 | 用于制备奥利司他中间体的方法 |
-
2021
- 2021-01-20 CN CN202110078799.6A patent/CN114854704B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150275245A1 (en) * | 2011-12-22 | 2015-10-01 | Evonik Industries Ag | Biotechnological production of alcohols and derivatives thereof |
| CN109097344A (zh) * | 2018-08-07 | 2018-12-28 | 浙江海洋大学 | 一种海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体及其应用 |
| CN109022473A (zh) * | 2018-08-13 | 2018-12-18 | 浙江海洋大学 | 一种酶法制备奥利司他中间体的方法 |
| CN111154736A (zh) * | 2020-01-07 | 2020-05-15 | 重庆植恩药业有限公司 | 用于制备奥利司他中间体的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114854704B (zh) | 2023-10-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108546691B (zh) | 7β-羟基甾醇脱氢酶突变体及其在制备熊脱氧胆酸中的应用 | |
| CN109055327B (zh) | 醛酮还原酶突变体及其应用 | |
| CN108018278B (zh) | 一种催化效率提高的d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体 | |
| CN115011616B (zh) | 一种乙醛脱氢酶基因rkaldh及其应用 | |
| WO2019209105A2 (en) | NAD+ DEPENDENT 7β-HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASE | |
| CN112301013A (zh) | 复合酶及其在制备麦角硫因中的应用 | |
| CN111235123B (zh) | 一种醇溶液高浓度耐受的羰基还原酶及其应用 | |
| CN112175918B (zh) | 7α-羟基类固醇脱氢酶突变体St-2-2 △C10及其应用 | |
| CN111996176B (zh) | 羰基还原酶突变体及其应用 | |
| CN112662709A (zh) | 一种双酶偶联合成(r)-香茅醇的方法 | |
| CN109022515B (zh) | 一种6-o-去甲罂粟碱的生物催化制备方法 | |
| CN113293152B (zh) | 短链脱氢酶突变体及其用途 | |
| CN112322596B (zh) | 7α-羟基类固醇脱氢酶突变体J-1-1 △C6及其应用 | |
| CN113817693A (zh) | 一种短链羰基还原酶PpYSDR突变体、编码基因、重组表达载体、基因工程菌及应用 | |
| CN110592035B (zh) | 一种羰基还原酶的突变体、重组表达载体及其在生产手性醇中的应用 | |
| CN111454918B (zh) | 一种烯醇还原酶突变体及其在制备(r)-香茅醛中的应用 | |
| CN114854704B (zh) | 一种用于制备奥利司他中间体的生物酶及其应用 | |
| CN114507650B (zh) | 亮氨酸脱氢酶突变体及其在合成(s)-邻氯苯甘氨酸中的应用 | |
| CN115433721B (zh) | 一种羰基还原酶突变体及其应用 | |
| CN116376950A (zh) | 一种核酸构建体、细胞和四氢姜黄素的制备方法及应用 | |
| CN114686451B (zh) | 胺脱氢酶突变体及其在制备(s)-5-甲基-2-吡咯烷酮中的应用 | |
| CN113151131B (zh) | 一种产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基及其应用 | |
| KR20040064238A (ko) | 옥시도리덕타제 | |
| CN109182286B (zh) | 一种改进的氰基还原酶及其在合成3-氯吡嗪-2甲胺中的应用 | |
| CN109097315B (zh) | 一种高产脂肽的基因工程菌及其构建方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20230823 Address after: 230000 South side of Changshong Road, Hefei Circular Economy Demonstration Park, Feidong County, Hefei City, Anhui Province Applicant after: Hefei Dayu Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: No. 669 Changjiang West Road, Hefei City, Anhui Province, 230088 Applicant before: HEFEI LIFEON PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |