CN109085366A - 一种超灵敏检测小鼠IgG的ELISA方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例提供了一种超灵敏检测小鼠IgG的ELISA方法，通过包被缓冲液稀释捕捉到小鼠IgG单克隆抗体，100μl/孔，4℃过夜；小鼠IgG单克隆抗体包被于ELISA板上，100μl/孔，将检测样品和标准品与固相化的捕捉抗体保温，使小鼠IgG与捕捉抗体结合，37℃温育1h；使结合到固相化捕捉抗体上的小鼠IgG与二抗即兔抗小鼠IgG多克隆抗体结合，37℃温育1h；加入检测抗体即羊抗兔IgG‑HRP与兔抗小鼠IgG多克隆抗体结合，37℃温育1h，来检测小鼠IgG。
Description
技术领域
本发明实施例涉及免疫学检测方法技术领域，更具体地，涉及一种超灵敏检测小鼠IgG的ELISA方法。
背景技术
IgG是免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)是血清中含量最多的一种免疫球蛋白，约占血清总免疫球蛋白量的80％，在机体的防御系统中发挥着重要的作用。在科学研究过程中，特别是在一些与免疫系统相关疾病的动物实验研究中，经常要检测大鼠淋巴细胞培养上清液中总IgG的含量。由于细胞培养上清液中的IgG含量较低，有时一毫升上清液中只有几十纳克，甚至几纳克，常规商品试剂盒很难检测得到。所以建立一种特异，灵敏的检测大鼠淋巴细胞培养上清液中总IgG含量的方法是十分必要的。
发明内容
本发明实施例提供了一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的一种超灵敏检测小鼠IgG的ELISA方法。
本发明实施例提供了一种超灵敏检测小鼠IgG的ELISA方法，包括：
通过包被缓冲液稀释捕捉到小鼠IgG单克隆抗体，100μl/孔，4℃过夜；
小鼠IgG单克隆抗体包被于ELISA板上，100μl/孔，将检测样品和标准品与固相化的捕捉抗体保温，使小鼠IgG与捕捉抗体结合，37℃温育1h；使结合到固相化捕捉抗体上的小鼠IgG与二抗即兔抗小鼠IgG多克隆抗体结合，37℃温育1h；加入检测抗体即羊抗兔IgG-HRP与兔抗小鼠IgG多克隆抗体结合，37℃温育1h，来检测小鼠IgG。
作为优选的，通过包被缓冲液稀释捕捉到小鼠IgG单克隆抗体前，还包括：
获取小鼠脾脏，用生理盐水清洗干净后将脾脏放入200目尼龙网中剪碎，放在培养皿中，加10mL EZ-sepMouse 1X小鼠淋巴细胞分离液，用20mL玻璃注射器的活塞进行研磨；
收集分离液至离心管中，加入1mL1640培养液覆盖，常温800g离心30min；吸出悬浮在1640培养液和EZ-Sep分离液之间的淋巴细胞层中的淋巴细胞悬液，加入10mL 1640培养基洗涤，250g离心10min；
倾倒上清液，加1640培养液10mL重新悬浮淋巴细胞，细胞计数；根据细胞计数结果，将细胞悬液以1mL胎牛血清、100μL双抗、需要量的PWM和1640培养液混合成10mL，使最终细胞浓度为5×105/mL；
用不同浓度的PWM与淋巴细胞共培养，分为PWM25μg/mL组，PWM5μg/mL组，PWM1μg/mL组，PWM0.2μg/mL组和Blank组，植入24孔板，每孔1mL，加盖，置37℃，5％CO2培养箱中，湿润环境培养7天；
培养结束，将培养板内细胞培养液吸入1.5mL离心管中，1000g离心10min，取无细胞上清液，-20℃保存备测。
作为优选的，包被缓冲液为柠檬酸缓冲液，每升柠檬酸溶液含0.386g二水磷酸二氢钠、1.93g十二水磷酸氢二钠和8.2g柠檬酸。
作为优选的，来检测小鼠IgG，具体包括：
洗板，每孔加入TMB底物溶液100μL，室温避光显色30min后，每孔加入2mol/LH2SO450μL终止反应；用酶标仪在450nm处检测OD值；
绘制标准曲线，通过标准曲线计算样品浓度。
本发明实施例提供的一种超灵敏检测小鼠IgG的ELISA方法，成本较低，且灵敏度高于市场上销售的小鼠IgG含量检测ELISA试剂盒，检测范围在0.25-16ng/mL之间。在检测淋巴细胞培养上清液中的总IgG含量有其独特的优势，不失为一种精确、方便、可靠的方法。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种超灵敏检测小鼠IgG的ELISA方法，包括：
通过包被缓冲液稀释捕捉到小鼠IgG单克隆抗体，100μl/孔，4℃过夜；
小鼠IgG单克隆抗体包被于ELISA板上，100μl/孔，将检测样品和标准品与固相化的捕捉抗体保温，使小鼠IgG与捕捉抗体结合，37℃温育1h；使结合到固相化捕捉抗体上的小鼠IgG与二抗即兔抗小鼠IgG多克隆抗体结合，37℃温育1h；加入检测抗体即羊抗兔IgG-HRP与兔抗小鼠IgG多克隆抗体结合，37℃温育1h，来检测小鼠IgG。
作为优选的，通过包被缓冲液稀释捕捉到小鼠IgG单克隆抗体前，还包括：
获取小鼠脾脏，用生理盐水清洗干净后将脾脏放入200目尼龙网中剪碎，放在培养皿中，加10mL EZ-sepMouse 1X小鼠淋巴细胞分离液，用20mL玻璃注射器的活塞进行研磨；
收集分离液至离心管中，加入1mL1640培养液覆盖，常温800g离心30min；吸出悬浮在1640培养液和EZ-Sep分离液之间的淋巴细胞层中的淋巴细胞悬液，加入10mL 1640培养基洗涤，250g离心10min；
倾倒上清液，加1640培养液10mL重新悬浮淋巴细胞，细胞计数；根据细胞计数结果，将细胞悬液以1mL胎牛血清、100μL双抗、需要量的PWM和1640培养液混合成10mL，使最终细胞浓度为5×105/mL；
用不同浓度的PWM与淋巴细胞共培养，分为PWM25μg/mL组，PWM5μg/mL组，PWM1μg/mL组，PWM0.2μg/mL组和Blank组，植入24孔板，每孔1mL，加盖，置37℃，5％CO2培养箱中，湿润环境培养7天；
培养结束，将培养板内细胞培养液吸入1.5mL离心管中，1000g离心10min，取无细胞上清液，-20℃保存备测。
作为优选的，包被缓冲液为柠檬酸缓冲液，每升柠檬酸溶液含0.386g二水磷酸二氢钠、1.93g十二水磷酸氢二钠和8.2g柠檬酸。
作为优选的，来检测小鼠IgG，具体包括：
洗板，每孔加入TMB底物溶液100μL，室温避光显色30min后，每孔加入2mol/LH2SO450μL终止反应；用酶标仪在450nm处检测OD值；
绘制标准曲线，通过标准曲线计算样品浓度。
本发明实施例提供的一种超灵敏检测小鼠IgG的ELISA方法，成本较低，且灵敏度高于市场上销售的小鼠IgG含量检测ELISA试剂盒，检测范围在0.25-16ng/mL之间。在检测淋巴细胞培养上清液中的总IgG含量有其独特的优势，不失为一种精确、方便、可靠的方法。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (4)
1.一种超灵敏检测小鼠IgG的ELISA方法，其特征在于，包括：
通过包被缓冲液稀释捕捉到小鼠IgG单克隆抗体，100μl/孔，4℃过夜；
小鼠IgG单克隆抗体包被于ELISA板上，100μl/孔，将检测样品和标准品与固相化的捕捉抗体保温，使小鼠IgG与捕捉抗体结合，37℃温育1h；使结合到固相化捕捉抗体上的小鼠IgG与二抗即兔抗小鼠IgG多克隆抗体结合，37℃温育1h；加入检测抗体即羊抗兔IgG-HRP与兔抗小鼠IgG多克隆抗体结合，37℃温育1h，来检测小鼠IgG。
2.根据权利要求1所述的超灵敏检测小鼠IgG的ELISA方法，其特征在于，通过包被缓冲液稀释捕捉到小鼠IgG单克隆抗体前，还包括：
获取小鼠脾脏，用生理盐水清洗干净后将脾脏放入200目尼龙网中剪碎，放在培养皿中，加10mL EZ-sepMouse 1X小鼠淋巴细胞分离液，用20mL玻璃注射器的活塞进行研磨；
收集分离液至离心管中，加入1mL1640培养液覆盖，常温800g离心30min；吸出悬浮在1640培养液和EZ-Sep分离液之间的淋巴细胞层中的淋巴细胞悬液，加入10mL 1640培养基洗涤，250g离心10min；
倾倒上清液，加1640培养液10mL重新悬浮淋巴细胞，细胞计数；根据细胞计数结果，将细胞悬液以1mL胎牛血清、100μL双抗、需要量的PWM和1640培养液混合成10mL，使最终细胞浓度为5×105/mL；
用不同浓度的PWM与淋巴细胞共培养，分为PWM25μg/mL组，PWM5μg/mL组，PWM1μg/mL组，PWM0.2μg/mL组和Blank组，植入24孔板，每孔1mL，加盖，置37℃，5％CO2培养箱中，湿润环境培养7天；
培养结束，将培养板内细胞培养液吸入1.5mL离心管中，1000g离心10min，取无细胞上清液，-20℃保存备测。
3.根据权利要求1所述的超灵敏检测小鼠IgG的ELISA方法，其特征在于，包被缓冲液为柠檬酸缓冲液，每升柠檬酸溶液含0.386g二水磷酸二氢钠、1.93g十二水磷酸氢二钠和8.2g柠檬酸。
4.根据权利要求1所述的超灵敏检测小鼠IgG的ELISA方法，其特征在于，来检测小鼠IgG，具体包括：
洗板，每孔加入TMB底物溶液100μL，室温避光显色30min后，每孔加入2mol/L H2SO450μL终止反应；用酶标仪在450nm处检测OD值；
绘制标准曲线，通过标准曲线计算样品浓度。
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