CN109082426A - 利用CRISPR-Cas9构建的斑马鱼cip2a基因突变体及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用CRISPR‑Cas9构建斑马鱼cip2a基因突变体以及使用该方法构建的斑马鱼cip2a基因突变体。其中包括了cip2a基因座上Cas9‑gRNA靶位点的设计，Cas9mRNA和cip2a‑gRNA的合成，以及体内显微注射和后续遗传筛选。该靶位点的序列位于cip2a基因第二个外显子上；同时设计一对包含靶位点的引物，通过PCR进行靶位点突变的验证。该验证方式同样适用于后续遗传筛选。本发明所述的利用CRISPR‑Cas9技术构建的cip2a斑马鱼突变体表现出高突变率，且突变造成了Cip2a蛋白翻译的提前终止。此外，本发明所述的cip2a基因突变斑马鱼仅通过连续的两代筛选就得到了。本发明获得了2种突变类型的cip2a突变体斑马鱼系。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种利用CRISPR-Cas9构建斑马鱼cip2a基因突变体的方法以及使用该方法构建的斑马鱼cip2a基因突变体。
背景技术
蛋白质磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A PP2A)是一种重要的肿瘤抑制因子，而抑制其表达可促进人类癌细胞的各种恶性特征。在癌症中，一组PP2A的阻遏蛋白抑制了PP2A的表达。其中，cip2a(Cancerous Inhibitor of Protein Phosphatase 2A)是一种重要的PP2A内源癌性抑制剂，它由基因KIAA1524编码。cip2a能抑制细胞内蛋白磷酸酶PP2A对c-MYC蛋白的去磷酸化作用，从而稳定c-MYC蛋白表达水平，促进细胞转化和体内肿瘤的生长。还能通过抑制PP2A来激活几种关键的癌症驱动因子(Akt，MYC，E2F1等)的活性，并促进大多数癌症类型的恶性表型。此外，cip2a在许多肿瘤中都呈现出高水平的表达，而在多种良性组织细胞中表达量都很低。值得注意的是，在十几种不同癌症类型患者中，cip2a蛋白的高表达都预测了较低的生存率。因此，cip2a在癌症治疗的预后和功能相关性等方面有着重要的意义。
斑马鱼是一种用于研究脊椎动物胚胎学和发育遗传学的模式生物，基于其快速迭代的优势，可以很好地用于癌症肿瘤学的研究。在斑马鱼中cip2a基因被称作蛋白磷酸酶2A细胞增殖调节抑制剂(cell proliferation regulating inhibitor of proteinphosphatase 2A，cip2a)。目前在斑马鱼中对于cip2a基因功能的研究仍是缺失的，本专利通过CRSPR-Cas9建立了斑马鱼cip2a的突变体，为进一步研究cip2a的功能提供了材料基础。
CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR是指规律成簇的间隔短回文重复序列(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)，最早是由日本科学家Ishino在大肠杆菌中发现。Cas则指的是CRISPR相关蛋白，一般定位于CRISPR位点附近，是一个有多种亚型多肽的蛋白家族，而Cas9是应用最为广泛的一个亚型。2013年1月，Woong YHwang等首次将该技术应用于斑马鱼基因编辑中。通过外源导入靶向基因组的gRNA和Cas9mRNA，gRNA即可引导Cas9蛋白切割基因组靶点附近的DNA双链，进而引发细胞的错配修复，从而造成基因突变。
发明内容
本发明目的在于构建了斑马鱼cip2a基因的突变体。
为实现上述构建斑马鱼cip2a基因突变体的目的，本发明提供的技术方案是：
1.根据cip2a基因序列设计Cas9靶位点；
2.确认靶位点在斑马鱼基因组中的特异性；
3.显微共注射cip2a-gRNA和Cas9 mRNA到斑马鱼胚胎，并验证突变效率；
4.饲养F0胚胎至性成熟，和野生型外交，检测F1胚胎突变类型；
5.饲养F1胚胎至1月龄，鉴定突变类型，相同突变类型集中饲养；
6.相同突变类型F1成鱼自交，得到F2胚胎，生长到1月龄鉴定纯合子；
7.得到2种突变类型的纯合F2成鱼，自交获得稳定遗传的突变体后代。
借助本发明，至少可以达到以下有益效果：
1.获得cip2a基因纯合突变体；
2.为研究cip2a基因功能提供材料；
3.该基因突变体可用于癌症的治疗及预后的功能性研究。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合符图详细说明如下。
附图说明
图1为cip2a基因突变体构建示意图。图示cip2a突变体构建示意图，显示了cip2a基因座21个外显子，设计Cas9靶位点位于第2个外显子上，绿色竖线指示翻译起始密码子ATG，蓝色竖线指示终止密码子TGA；中间显示了靶位点突变类型，分别为缺失几个碱基和缺失碱基；下图显示预测的氨基酸长度，野生型氨基酸为896个，突变体的Cip2a蛋白翻译都提前终止，缺失7个碱基和4个碱基突变类型对应氨基酸分别为426个和258个。
图2为cip2a-gRNA的电泳条带结果图。图示cip2a-gRNA的电泳条带结果，条带单一，且符合预期大小，约123bp。
图3为斑马鱼cip2a基因第二个外显子序列。本发明构建突变体所设计的Cas9靶位点位于此外显子上。
图4为cip2a基因Cas9靶序列。图示本本发明构建突变体所设计的Cas9靶位点序列。
图5为cip2a突变位点PCR鉴定序列。图示本发明构建突变体所设计的PCR鉴定序列，序列长度为123bp。
图6为cip2a基因鉴定引物P1序列。图示本发明构建突变体所设计的PCR鉴定上游引物。
图7为cip2a基因鉴定引物P2序列。图示本发明构建突变体所设计的PCR鉴定下游引物。
图8为cip2a基因gRNA合成引物P3序列。图示本发明构建突变体所设计gRNA合成上游引物。
图9为cip2a基因序列。图示本发明构建突变体的基因序列，其中蓝色序列为蛋白编码序列，位于外显子上；灰色序列为内含子序列；褐色序列为外显子非翻译区。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明具体实施方式作进一步详细的描述。以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。
实施例1
本发明一较佳实施例提供一种利用CRISPR-Cas9构建斑马鱼cip2a基因突变体的方法，具体包括以下步骤：
1.首先，设计cip2a基因Cas9靶位点，方法如下：
A.从Ensemble网站上获取cip2a的蛋白编码序列(CDS)，如附图9所示；
B.运用http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx网站设计靶位点，打开网站，输入cip2a蛋白编码序列；
C.设定靶位点长度为20个碱基，靶点3’端的3个碱基构成PAM区，序列为NGG(N为任意碱基)，输出靶位点序列；
D.cip2a基因的Cas9靶位点序列为：5’-CCAGTCACGCACTGACCGGGACC-3’，为反义链靶点，位于第2个外显子，如附图3-4所示。
2.进一步的，所述的确认cip2a-Cas9靶位点的方法如下：
A.在Ensemble网站上比对靶位点序列，比对结果显示靶点是cip2a基因的单一位点；
B.在靶位点上下游设计引物，5’端引物为，5’-GAGTGCTGTTCTCGGGTCAG-3’，如附图6所示，3’端引物为，5’-ATACCAAATTGTGCCAGCAG-3’，如附图7所示，产物大小为123个碱基对，从野生型斑马鱼基因组中PCR扩增这段序列，其中应包含靶点序列，如附图5所示，PCR程序为：95℃预变性5min，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸10sec，40循环。PCR扩增产物2％琼脂糖凝胶电泳，大小符合预期；
C.将PCR产物进行测序，测序结果和预测靶点序列一致。
3.进一步的，制备cip2a-gRNA，具体步骤如下：
A.根据靶位点设计gRNA体外转录模板的上游引物，命名为P3，序列为，5’-GATCACTAATACGACTCACTATAGGTCCCGGTCAGTGCGTGACGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’，如附图8所示，下游引物使用pT7-gRNA质粒上的通用引物，命名为P4。
B.用P3和P4引物对，以体外转录载体pT7-gRNA质粒为模板，使用高保真酶PCR扩增得到cip2a-gRNA体外转录模板，PCR体系为：模板1微升，高保真缓冲液25微升，dNTPs 12微升，高保真酶1微升，引物各1微升，双蒸水补齐至50微升。PCR条件为：98℃预变性3min，98℃变性30sec，60℃退火30sec，68℃延伸30sec，40循环。取1微升PCR产物电泳，结果确认为单一条带(123bp),回收PCR产物，用酚-氯仿法纯化后得到转录模板。
C.用T7转录试剂盒体外转录cip2a-gRNA，反应体系为：模板1微克，NTP 4微升，缓冲液2微升，T7酶1微升，DEPC水补至20微升。反应条件为37℃，1h；然后加入1微升DNA酶(TURBO DNase)，37℃，15min以去除DNA模板。取1微升转录产物电泳，产物大小约100bp左右，如附图2所示，符合预期，用酚-氯仿法纯化回收得到gRNA。
D.酚-氯仿法纯化方法为：将回收产物用DEPC水补齐至200微升，按体积比1:1加入酚-氯仿，振荡混匀后12,000g离心10min，取上清液于新的去RNA酶1.5毫升离心管中，再加入2.5倍体积的异丙醇，颠倒混匀后置于-80℃，静置30min以上后取出，12,000g离心15min，去掉上清液，留下白色沉淀即为gRNA，加入200微升75％的乙醇清洗gRNA，随后除去乙醇，将离心管开盖置于超净工作台数分钟，晾干gRNA后加入30微升DEPC水溶解，将得到的gRNA溶液保存置-80℃备用。
4.进一步的，制备Cas9 mRNA，具体步骤如下：
A.用限制性内切酶线性化pSP6-spCas9载体，取0.5微升酶切产物电泳，确认线性化完全后回收，并进行纯化处理。
B.用SP6体外转录试剂盒转录线性化载体，转录体系为：10微升2x NTP/CAP，2微升10x缓冲液，2微升SP6转录酶，1微克载体，DEPC水补齐至20微升。反应条件为，37℃,2h，随即加入1微升DNA酶，去除DNA模板。纯化回收得到Cas9 mRNA，取0.5微升产物电泳，1％琼脂糖凝胶，产物大小约2,000bp。
C.Cas9 mRNA添加ployA序列，体系为：回收的mRNA，5微升10mM ATP,5微升10x缓冲液，1微升E.coli Poly(A)聚合酶，DEPC水补至50微升。反应条件为，37℃,1h。纯化回收得到Cas9 mRNA-ployA，取0.5微升产物电泳，1％琼脂糖凝胶，产物大小约2,000bp。
5.进一步的，所述的制备RNA实验中，各部分实验所用耗材和试剂都是去RNA酶的，实验中未明确表明温度的，产物和试剂应保持在4℃以下，避免RNA受热降解。
6.进一步的，所述的制备F0斑马鱼并检测cip2a基因靶点突变效率，通过显微注射和PCR测序来完成，其具体方法如下：
A.预先配置注射体系，包括Cas9 mRNA和cip2a-gRNA，加入1/10体积酚红，作为指示剂，注射到单细胞期胚胎中，注射约200枚胚胎，注射剂量为Cas9 mRNA 300pg，gRNA 50-100pg。
B.取注射后第2天发育正常的胚胎10枚，碱裂解法提取基因组DNA：将胚胎置于PCR管中，加入100微升50mM NaOH溶液，PCR仪加热到95℃，30min裂解胚胎，取出后振荡均匀，加入1/10体积pH8.0的Tris-HCl中和NaOH。
C.用引物P1和P2扩增基因组DNA，将PCR产物通过TA克隆连接至T载体上，测序检测突变类型，结果显示有两种突变类型，分别为缺失7个碱基和4个碱基，如附图1所示。将突变效率较高的F0胚胎饲养起来，用于后续检测筛选可遗传的突变。
7.进一步的，所述的检测F0斑马鱼生殖遗传的方法如下：
A.取性成熟的F0成鱼和野生型成鱼外交，得到F1胚胎，随机挑选5-10个胚胎混合提取基因组DNA。
B.用PCR扩增靶位点片段，PCR产物通过TA克隆测序，确定其突变类型。表明F0斑马鱼cip2a基因突变可以遗传，随后饲养可遗传突变的F1，以备后续筛选。
8.进一步的，所述的确认F1斑马鱼cip2a基因突变类型，方法如下：
A.F1长到1-2月龄，剪取尾鳍，提取基因组DNA。
B.通过PCR分析和TA克隆测序，进一步确认F1斑马鱼cip2a基因突变类型，筛选得到2种突变类型的F1斑马鱼，命名为MT-1和MT-2，相同突变类型的F1可以混合饲养。
9.进一步的，所述的筛选F2斑马鱼cip2a基因纯合突变体，具体方法是：将相同突变的F1成鱼进行自交，得到F2胚胎，饲养至1-2月龄，通过剪尾鳍，提基因组，PCR，测序确认F2斑马鱼纯合突变。得到相同突变的纯合子后，通过自交即可获得大量纯合突变后代，即建立起了可稳定遗传的cip2a基因突变体。
实施例2
本发明一较佳实施例提供一种利用CRISPR-Cas9构建的斑马鱼cip2a基因突变体,其具体特征在于：
1.所述的cip2a基因突变体包含两个品系，具有不同的突变类型；
2.所述的cip2a基因突变体，其突变类型分别为缺失7个碱基和4个碱基；
3.所述的cip2a基因突变体，突变缺失碱基位于靶位点附近；
4.所述的cip2a基因突变体，其突变序列如附图1所示；
5.所述的cip2a基因突变体，其蛋白翻译提前终止，野生型cip2a蛋白有896个氨基酸，而突变体中，缺失7个碱基和4个碱基分别对应了426个氨基酸和258个氨基酸。
6.所述的cip2a基因突变体，为进一步研究cip2a的功能提供了材料基础，有助于在癌症治疗的预后和功能相关性等方面发挥作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方法，并不用于限制本发明，应当指出，对于本发明领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
本发明由国家自然科学基金(青年科学基金项目——81502500)、江苏省自然科学基金(青年科学基金项目——BK20150293)及苏州市民生科技(医疗卫生应用基础研究项目——SYS2018074)提供资助。
Claims (9)
1.一种利用CRISPR-Cas9技术构建斑马鱼cip2a基因突变体的方法，其特征在于，所述突变体构建包括如下步骤：
(1)在cip2a基因上选择Cas9靶位点；
(2)分析确认cip2a-Cas9靶位点；
(3)制备Cas9mRNA和cip2a-gRNA；
(4)制备F0斑马鱼并检测cip2a基因靶点突变效率；
(5)检测F0斑马鱼的生殖遗传；
(6)确认F1斑马鱼cip2a基因突变类型；
(7)筛选F2斑马鱼cip2a基因纯合突变体。
2.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9技术构建斑马鱼cip2a基因突变体的方法，其特征在于，所述的cip2a基因Cas9靶位点设计方法如下：
(1)从Ensemble网站上获取cip2a的蛋白编码序列(CDS)；
(2)运用ZiFiT Targeter Version 4.2网站设计靶位点，打开网站，输入cip2a蛋白编码序列；
(3)设定靶位点长度为20个碱基，靶点3’端的3个碱基构成PAM区，序列为NGG(N为任意碱基)，输出靶位点序列；
(4)cip2a基因的Cas9靶位点序列为：
5’-CCAGTCACGCACTGACCGGGACC-3’，为反义链靶点，位于第2个外显子。
3.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9构建斑马鱼cip2a基因突变体的方法，其特征在于，所述的确认cip2a-Cas9靶位点的方法如下：
(1)在Ensemble网站上比对靶位点序列，比对结果显示靶点是cip2a基因的单一位点；
(2)在靶位点上下游设计引物
5’端引物为，5’-GAGTGCTGTTCTCGGGTCAG-3’，命名为P1，
3’端引物为，5’-ATACCAAATTGTGCCAGCAG-3’，命名为P2，
产物大小为123个碱基对，从野生型斑马鱼基因组中PCR扩增这段序列，其中应包含靶点序列，扩增产物电泳大小符合预期；
(3)将PCR产物进行测序，测序结果和预测靶点序列一致。
4.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9技术构建斑马鱼cip2a基因突变体的方法，其特征在于，所述的制备cip2a-gRNA和Cas9mRNA的方法如下：
(1)制备cip2a-gRNA，具体步骤如下：
A.根据靶位点设计gRNA转录模板的上游引物，命名为P3，序列为，5’-GATCACTAATACGACTCACTATAGGTCCCGGTCAGTGCGTGACGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’，下游引物使用pT7-gRNA质粒上的通用引物，命名为P4；
B.用P3和P4引物对，以体外转录载体pT7-gRNA质粒为模板，使用高保真酶PCR扩增得到cip2a-gRNA体外转录模板，PCR体系为：模板1微升，高保真缓冲液25微升，dNTPs12微升，高保真酶1微升，引物各1微升，双蒸水补齐至50微升；PCR条件为：98℃预变性3min，98℃变性30sec，60℃退火30sec，68℃延伸30sec，40循环；取1微升PCR产物电泳，结果确认为单一条带(123bp)，回收PCR产物，用酚-氯仿法纯化后得到转录模板；
C.用T7转录试剂盒体外转录cip2a-gRNA，反应体系为：模板1微克，NTP 4微升，缓冲液2微升，T7酶1微升，DEPC水补至20微升；反应条件为37℃，1h；然后加入1微升DNA酶(TURBODNase)，37℃，15min以去除DNA模板；取1微升转录产物电泳，产物大小约100bp左右，符合预期，用酚-氯仿法纯化回收得到gRNA；
D.酚-氯仿法纯化方法为：将回收产物用DEPC水补齐至200微升，按体积比1:1加入酚-氯仿，振荡混匀后12,000g离心10min，取上清液于新的去RNA酶1.5毫升离心管中，再加入2.5倍体积的异丙醇，颠倒混匀后置于-80℃，静置30min以上后取出，12,000g离心15min，去掉上清液，留下白色沉淀即为gRNA，加入200微升75％的乙醇清洗gRNA，随后除去乙醇，将离心管开盖置于超净工作台数分钟，晾干gRNA后加入30微升DEPC水溶解，将得到的gRNA溶液保存置-80℃备用；
(2)制备Cas9mRNA，具体步骤如下：
A.用限制性内切酶线性化pSP6-spCas9载体，取0.5微升酶切产物电泳，确认线性化完全后回收，并进行纯化处理；
B.用SP6体外转录试剂盒转录线性化载体，转录体系为：10微升2xNTP/CAP，2微升10x缓冲液，2微升SP6转录酶，1微克载体，DEPC水补齐至20微升；反应条件为，37℃，2h，随即加入1微升DNA酶，去除DNA模板；纯化回收得到Cas9mRNA，取0.5微升产物电泳，1％琼脂糖凝胶，产物大小约2,000bp；
C.Cas9mRNA添加ployA序列，体系为：回收的mRNA，5微升10mMATP,5微升10x缓冲液，1微升E.coli Poly(A)聚合酶，DEPC水补至50微升；反应条件为，37℃,1h；纯化回收得到Cas9mRNA-ployA，取0.5微升产物电泳，1％琼脂糖凝胶，产物大小约2,000bp；
(3)各部分实验所用耗材和试剂都是去RNA酶的，实验中未明确表明温度的，产物和试剂应保持在4℃以下，避免RNA受热降解。
5.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9技术构建斑马鱼cip2a基因突变体的方法，其特征在于，所述的制备F0斑马鱼并检测cip2a基因靶点突变效率，通过显微注射和PCR测序来完成，其具体方法如下：
(1)预先配置注射体系，包括Cas9mRNA和cip2a-gRNA，加入1/10体积酚红，作为指示剂，注射到单细胞期胚胎中，注射约200枚胚胎，注射剂量为Cas9mRNA 300pg，gRNA 50-100pg；
(2)取注射后第2天发育正常的胚胎10枚，碱裂解法提取基因组DNA：将胚胎置于PCR管中，加入100微升50mM NaOH溶液，PCR仪加热到95℃，30min裂解胚胎，取出后振荡均匀，加入1/10体积pH8.0的Tris-HCl中和NaOH；
(3)用引物P1和P2扩增基因组DNA，将PCR产物通过TA克隆连接至T载体上，测序检测突变类型；将突变效率较高的F0胚胎饲养起来，用于后续检测筛选可遗传的突变。
6.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9技术构建的斑马鱼cip2a基因突变体的方法，其特征在于，所述的检测F0斑马鱼生殖遗传的方法如下：
(1)取性成熟的F0成鱼和野生型成鱼外交，得到F1胚胎，随机挑选5-10个胚胎混合提取基因组DNA；
(2)用PCR扩增靶位点片段，PCR产物通过TA克隆测序，确定其突变类型；表明F0斑马鱼cip2a基因突变可以遗传，随后饲养可遗传突变的F1，以备后续筛选。
7.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9技术构建斑马鱼cip2a基因突变体的方法，其特征在于，所述的确认F1斑马鱼cip2a基因突变类型，方法如下：
(1)F1长到1-2月龄，剪取尾鳍，提取基因组DNA；
(2)通过PCR分析和TA克隆测序，进一步确认F1斑马鱼cip2a基因突变类型，筛选得到2种突变类型的F1斑马鱼，命名为Allele-1和Alele-2，相同突变类型的F1可以混合饲养。
8.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9技术构建斑马鱼cip2a基因突变体的方法，其特征在于，所述的筛选F2斑马鱼cip2a基因纯合突变体，具体方法是，将相同突变的F1成鱼进行自交，得到F2胚胎，饲养至1-2月龄，通过剪尾鳍，提基因组，PCR，测序确认F2斑马鱼纯合突变；得到相同突变的纯合子后，通过自交即可获得大量纯合突变后代，即建立起了可稳定遗传的cip2a基因突变体。
9.一种斑马鱼cip2a基因突变体，其特征在于，所述斑马鱼cip2a基因突变体是使用权利要求1-8中任意一项的方法构建的。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20181225 |