CN109069470B - 特定苯并二氢呋喃类木脂素于抑制乳癌细胞转移之用途 - Google Patents

Abstract

一种抑制肿瘤转移的方法，其中向有需要的个体施予一有效量的式(I)化合物。本发明还公开了一种治疗癌症的方法，其中向有需要的个体施予一有效量的化学治疗药剂以及一有效量的式(I)化合物。本发明另公开一种用于抑制肿瘤转移以及治疗癌症的药物组合物，每种组合物含有式(I)化合物。

Description

特定苯并二氢呋喃类木脂素于抑制乳癌细胞转移之用途

背景

乳癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，且是癌症死亡率的第二个主因。目前治疗乳癌的方式仍以切除恶性肿瘤为主，然而，癌症转移到身体其他部位是造成死亡主要的原因。

肿瘤细胞由原发及次发部位的的微环境(microenvironment)调控，以促进肿瘤的成长和移转。目前要预防或是抑制肿瘤细胞从微环境移转到目标组织仍是一个挑战。肿瘤微环境即是由所谓可促进癌细胞移转与耐药性的肿瘤基质或移转前/移转的壁龛。

肿瘤相关基质细胞产生肿瘤抑制因子，像是核苷酸二磷酸激酶A(nucleosidediphosphate kinase A)、KAI1(kangai 1)和介白素25(IL-25)。肿瘤抑制因子可以抑制乳癌的发育或是移转。目前已有许多研究致力于识别可促进肿瘤抑制因子表达的分子介质(molecular agents)，例如IL-25，从而表现抑制肿瘤转移的治疗效果。

故有需要发展一种藉由诱导肿瘤抑制因子生成以抑制乳腺肿瘤移转的新方法。

摘要

本发明是关于一种苯并二氢呋喃类木脂素于治疗肿瘤转移之用途。意外地，苯并二氢呋喃类木脂素促进抗癌因子，例如IL-25的分泌，并有效地抑制肿瘤转移。

从一方面来说，本发明系一种抑制肿瘤转移的方法，该方法包含向有需要的个体施予一定量的式(I)化合物：

(I)

其中R₁,R₂,以及R₃各自为H、C₁-C₆烷基或–C(O)R₄；R₄为C₁-C₆烷基、C₃-C₈环烷基、C₂-C₈杂环烷基、C₆-C₁₄芳基或C₁-C₁₃杂芳基；以及

是一个单键或双键，其中该定量能有效诱导肿瘤细胞分泌一抗癌因子，该抗癌因子为IL-25、p53；Kangai 1或核苷酸二磷酸激酶A(nucleoside diphosphate kinase A)。

本文中之用语「烷基(alkyl)」是指包含1-20(例如1-10以及1-6)个碳原子的直炼或支链的烃基群。实例包括甲基(methyl)、乙基(ethyl)、正丙基(n-propyl)、异丙基(i-propyl)、正丁基(n-butyl)、异丁基(i-butyl)以及第三丁基(t-butyl)。

本文中之用语「环烷基(cycloalkyl)」是指具有3至12个碳的饱和以及部分不饱和的单环、双环、三环或四环烃基群。实例包括环丙基(cyclopropyl)、环丁基(cyclobutyl)、环戊基(cyclopentyl)、环戊烯基(cyclopentenyl)、环己基(cyclohexyl)、环己烯基(cyclohexenyl)、环庚基(cycloheptyl)和环辛基(cyclooctyl)。

本文中之用语「杂环烷基(heterocycloalkyl)」是指具有一个或多个杂原子(例如O，N，P和S)的非芳族5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环体系。实例包括哌嗪基(piperazinyl)、咪唑烷基(imidazolidinyl)、氮杂环庚烷基(azepanyl)、吡咯烷基(pyrrolidinyl)、二氢噻二唑基(dihydrothiadiazolyl)、二烷基(dioxanyl)、吗啉基(morpholinyl)、四氢呋喃基(tetrahydropuranyl)以及四氢呋喃基(tetrahydrofuranyl)。

本文中之用语「芳基(aryl)」是指6碳单环、10碳双环、14-碳三环芳环体系，其中每个环可具有1至5个取代基。芳基群的实例包括苯基(phenyl)、萘基(naphthyl)以及蒽基(anthracenyl)。

本文中之用语「杂芳基(heteroaryl)」是指具有一个或多个杂原子(例如O，N，P和S)的芳族5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环体系。实例包括三唑基(triazolyl)、恶唑基(oxazolyl)、噻二唑基(thiadiazolyl)、四唑基(tetrazolyl)、吡唑基(pyrazolyl)、吡啶基(pyridyl)、呋喃基(furyl)、咪唑基(imidazolyl)、苯并咪唑基(benzimidazolyl)、嘧啶基(pyrimidinyl)、噻吩基(thienyl)、喹啉基(quinolinyl)、吲哚基(indolyl)、噻唑基(thiazolyl)以及苯并噻唑基(benzothiazolyl)。

本文提及的烷基，环烷基，杂环烷基，芳基和杂芳基包括取代以及未取代的部分。取代基的实例包括但不限于：卤素(halo)、羟基(hydroxyl)、氨基(amino)、氰基(cyano)、硝基(nitro)、巯基(mercapto)、烷氧基羰基(alkoxycarbonyl)、酰胺基(amido)、羧基(carboxy)、烷基磺酰基(alkanesulfonyl)、烷基羰基(alkylcarbonyl)、氨基甲酰基(carbamido)、氨基甲酰基(carbamyl)、羧基(carboxyl)、硫脲基(thioureido)、硫氰酸酯基(thiocyanato)、亚磺酰氨基(sulfonamido)、烷基(alkyl)、烯基(alkenyl)、炔基(alkynyl)、烷氧基(alkyloxy)、芳基(aryl)、杂芳基(heteroaryl)、环烷基(cycloalkyl)以及杂环烷基(heterocycloalkyl)，其中烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基环烷基和杂环烷基可进一步被取代。

本文中，用语「化合物」是指上述式(I)的化合物，以及它们的盐与溶合物(如果适用)。盐可以在化合物上阴离子和带正电荷的基团(例如氨基)之间形成。适当的阴离子的实例包括：氯化物(chloride)、溴化物(bromide)、碘化物(iodide)、硫酸盐(sulfate)、硝酸盐(nitrate)、磷酸盐(phosphate)、柠檬酸盐(citrate)、甲磺酸盐(methanesulfonate)、三氟乙酸盐(trifluoroacetate)、乙酸盐(acetate)、苹果酸盐(malate)、甲苯磺酸盐(tosylate)、酒石酸盐(tartrate)、富马酸盐(fumurate)、谷氨酸盐(glutamate)、葡萄醣醛酸盐(glucuronate)、乳酸盐(lactate)、戊二酸盐(glutarate)和马来酸盐(maleate)。盐也可以在阳离子和带负电荷的基团之间形成。适当的阳离子的实例包括：钠离子(sodiumion)、钾离子(potassium ion)、镁离子(magnesium ion)、钙离子(calcium ion)和铵阳离子(ammonium cation)例如四甲基铵离子(tetramethylammonium ion)。盐还包括含有四级氮原子(quaternary nitrogen atoms)的盐。溶合物是指在活性化合物及药学上可接受的溶剂之间形成的复合物。药学上可接受的溶剂的实例包括：水、乙醇(ethanol)、异丙醇(isopropanol)、乙酸乙酯(ethyl acetate)、乙酸(acetic acid)和乙醇胺(ethanolamine)。

本发明的另一方面是提供一种治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的个体施予一第一剂量的化学治疗药剂用于抑制癌症生长，以及一第二剂量的式(I)化合物，其中第一剂量能有效抑制癌症生长并且第二剂量能有效抑制癌症转移。

本发明的范围内进一步包含一种用于抑制肿瘤转移的药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体和式(I)的化合物。

本发明的范围内还包含一种用于治疗癌症的药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体，用于抑制癌症生长的化学治疗药剂和式(I)化合物。

本发明还涉及前述段落中所描述之一种组合物在制备用于治疗癌症之药物的用途。

用于口服给药的组合物可以是任何口服可接受的剂型，包括胶囊、片剂、乳剂以及悬浮水溶液、分散液及溶液。片剂的情况下，常用的载体包含乳糖以及玉米淀粉。通常还会加入润滑剂，例如硬脂酸镁(magnesium stearate)。对于胶囊形式的口服给药，可用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当悬浮水溶液或乳剂以口服给药时，活性成分可以悬浮或溶解在乳化剂或悬浮剂组合的油相中。如果需要，可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。口服固体剂型可以透过喷雾干燥技术(spray dried techniques)、热熔挤出技术(hot meltextrusion strategy)、微粒化(micronization)以及纳米铣削技术(nano millingtechnologies)。

鼻用气化喷雾剂(nasal aerosol)或吸入组合物可以根据药物制剂领域熟知的技术制备。例如，这种组合物可以制备成生理食盐水溶液、使用芐醇或其它合适的防腐剂、吸收促进剂以提高生物利用度、碳化氟及/或本领域已知的其它增溶或分散剂。具有活性化合物的组合物也可以栓剂的方式用于直肠给药。

药物组合物中的载体在某种意义上必须是「可接受的」，其与组合物的活性成分兼容(优选为能够稳定活性成分)并且对治疗对象无害。一种或多种增溶剂可用于作为递送活性化合物的药物赋形剂。其他载体的实例包括胶体氧化硅(colloidal silicon oxide)、硬脂酸镁、纤维素(cellulose)、月桂基硫酸钠(sodium lauryl sulfate)以及D&C Yellow#10。

上述化合物或含有这种化合物的药物组合物可以透过口服、肠胃外、吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、口腔或经由植入的储存器给药。本文中之用语「肠胃外(parenteral)」包括：皮下(subcutaneous)、皮内(intracutaneous)、静脉内(intravenous)、肌内(intramuscular)、关节内(intraarticular)、动脉内(intraarterial)、滑膜内(intrasynovial)、胸骨内(intrasternal)、鞘内(intrathecal)、病灶内(intralesional)以及颅内注射或输注(intracranial injection or infusion)技术。

用语「治疗(treating)」是指化合物对个体(subject)之提供或给药，其目的是治愈，减轻，缓解，改变，补救，改善或影响疾病，症状或易感体质。「有效量」是指赋予受试者预期效果所需化合物的量。有效量之变化，如本领域技术人员所认知的，系取决于给药途径、赋形剂用途以及与其它治疗方法(例如使用其它活性剂)共同使用的可能性。

本发明的细节将在下面的描述中阐述。本发明的其他特征、目的及优点，将可从以下附图与若干实施例的详细描述以及附加申请专利范围中显而易见。

图式简单说明

图1为苯并二氢呋喃类木脂素(Q2-3)对乳癌细胞之细胞毒性影响的示意图。

图2为肿瘤切除术后，Q2-3于抑制小鼠4T1乳腺肿瘤细胞转移的结果示意图。

图3为Q2-3于体内或体外之肺纤维母细胞中上调IL-25表达的结果示意图。

图4为给予Q2-3处理以抑制老鼠以及人类的转移性乳腺肿瘤细胞的生长下，IL-25分泌的结果示意图。

图5为于Q2-3对乳腺肿瘤细胞的抗转移作用下，IL-25表达的作用示意图。

图6为Q2-3以及IL-25合并处理对于乳腺肿瘤细胞的抗转移作用之评估结果示意图。

图7为Q2-3以及多烯紫杉醇(docetaxel)合并处理对于乳腺肿瘤细胞的抗转移作用之评估结果示意图。

详细说明

在此具体揭露一种用苯并呋喃类木脂素诱发抗癌因子表现，例如：介白素25(IL-25或IL-17E)于抑制肿瘤转移的方法。

木脂素(Lignans)是植物中广泛存在的天然产物，其具有各种结构以及表现出一系列的生物活性。许多合成的苯并二氢呋喃类木脂素系透过仿生咖啡因及/或阿魏酸甲酯的氧化二聚作用后进行衍生化反应而获得。这些合成的木脂素表现出有力的抗血管生成活性。其中，甲基(E)-3-[2-(3,4-二羟苯基)-7-羟基-3-甲氧羰基-2,3-二氢-1-苯并呋喃-5基]-2-丙烯酸(methyl(E)-3-[2-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,3-dihydro-1-benzofuran-5yl]-prop-2-enoate，后称Q2-3)，对于许多人类癌细胞株表现出明显的抗增生反应，其包含Jurkat、K562以及MCF-7细胞株。研究Q2-3和其他木脂素是否会干扰乳腺肿瘤之转移将可能有用。

据报导，IL-25具有很高的抗癌活性，而对于非恶性细胞(nonmalignant cells)几乎没有或没有影响。例如，参见Furuta等人，Science translational medicine,3,78ra31(2011)。IL-25的凋亡活性由其受体IL-25R的差异表现(differential expression)进行调节，IL-25R在6位预后差的患者肿瘤中有较高的表现，但在非恶性乳房组织中表现较低。这表示目标于IL-25讯号传递路径可为晚期乳癌提供一种新的治疗方法。本发明的方法涉及使用苯并呋喃类木脂素诱导IL-25表现，从而抑制肿瘤转移。

该方法包括向有需要的个体施予一定量的式(I)化合物：

(I)

其中R₁,R₂,以及R₃各自为H、C₁-C₆烷基或–C(O)R₄；R₄为C₁-C₆烷基、C₃-C₈环烷基、C₂-C₈杂环烷基、C₆-C₁₄芳基或C₁-C₁₃杂芳基；

是一个单键或双键，其中该量有效诱导肿瘤细胞分泌抗癌因子，该抗癌因子为IL-25、p53；Kangai 1或核苷酸二磷酸激酶A(nucleosidediphosphate kinase A)。

该化合物可以是以下化合物之一：

本文还详细揭露了一种治疗癌症的方法。该方法包括向有需要的个体施予一第一剂量的化学治疗药剂用于抑制癌症生长，以及一第二剂量的上述式(I)化合物。

所述癌症的实例包括但不限于乳癌、非小细胞肺癌、大肠直肠癌、胰脏癌、卵巢癌、皮肤癌、前列腺癌、脑或神经系统癌症、头颈癌、睾丸癌、肺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、胃肠癌、骨癌、内分泌系统的癌症、淋巴系统的癌症、纤维肉瘤、神经外胚层肿瘤、中皮瘤、表皮样癌以及卡波西氏肉瘤。

化学治疗药剂可以是以下化合物之一：阿西维辛(Acivicin)、阿柔比星(Aclarubicin)、盐酸阿莫达唑(Acodazole Hydrochloride)、阿克罗宁(Acronine)、阿多来新(Adozelesin)、阿列白介素(Aldesleukin)、六甲密胺(Altretamine)、安波霉素(Ambomycin)、阿美蒽醌(Ametantrone Acetate)、氨格鲁米特(Aminoglutethimide)、胺苯吖啶(Amsacrine)、阿那曲唑(Anastrozole)、氨茴霉素(Anthramycin、门冬酰胺酶(Asparaginase)、曲林菌素(Asperlin)、阿扎胞苷(Azacitidine)、阿兹台克(Azetepa)、阿奇霉素(Azotomycin)、巴马司他(Batimastat)、苯佐替派(Benzodepa)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、盐酸比生群(Bisantrene Hydrochloride)、双奈法德(BisnafideDimesylate)、比哲来新(Bizelesin)、贝力沃霉素(Bleomycin Sulfate)、布喹那钠盐(Brequinar Sodium)、溴匹立明(Bropirimine)、白消安(Busulfan)、卡提诺麦(Cactinomyde)、卡芦睾酮(Calusterone)、卡拉塞纳-马恩省(Caracemide)、卡贝替姆(Carbetimer)、卡铂(Carboplatin)、卡莫司汀(Carmustine)、盐酸卡比菌素(CarubicinHydrochloride)、卡哲来新(Carzelesin)、西地芬戈(Cedefingol)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、西罗里霉素(Cirolemycin)、顺铂(Cisplatin)、克拉屈滨(Cladribine)、甲磺酸库理斯聂陀(Crisnatol Mesylate)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、阿糖胞苷(Cytarabine)、达喀尔巴嗪(Dacarbazine)、更生霉素(Dactinomycin)、盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride)、地西他滨(Decitabine)、右奥马铂(Dexormaplatin)、德扎古宁(Dezaguanine)、甲磺酸德扎古宁(Dezaguanine Mesylate)、亚丝醌(Diaziquone)、多西紫杉醇(Docetaxel)、无水多西紫杉醇(Docetaxel Anhydrous)、多柔比星(Doxorubicin)、盐酸多柔比星(Doxorubicin Hydrochloride)、屈洛昔芬(Droloxifene)、柠檬酸屈洛昔芬(Droloxifene Citrate)、丙酸消旋酮(Dromostanolone Propionate)、达佐霉素(Duazomycin)、依达曲沙(Edatrexate)、盐酸埃氟米汀(EflomithineHydrochloride)、依沙芦星(Elsamitrucin)、恩洛铂(Enloplatin)、恩普氨酯(Enpromate)、依匹呱啶(Epipropidine)、盐酸表柔比星(Epirubicin Hydrochloride)、厄布洛唑(Erbulozole)、盐酸依索比星(Esorubicin Hydrochloride)、雌莫司汀(Estramustine)、雌莫司汀磷酸钠(Estramustine Phosphate Sodium)、依他硝(Etanidazole)、依托泊苷(Etoposide)、磷酸依托泊苷(Etoposide Phosphate)、依托派(Etoprine)、盐酸法多罗唑(Fadrozole Hydrochloride)、法扎拉滨(Fazarabine)、芬维a胺(Fenretinide)、氟尿苷(Floxuridine)、磷酸氟达拉滨(Fludarabine Phosphate)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、氟西他滨(Fluorocitabine)、磷喹酮(Fosquidone)、福斯他宁钠(Fostriecin Sodium)、吉西他滨(Gemcitabine)、盐酸吉西他滨(Gemcitabine Hydrochloride)、羟基脲(Hydroxyurea)、盐酸伊达比星(Idarubicin Hydrochloride)、异环磷酰胺(Ifosfamide)、伊莫福新(Ilmofosine)、干扰素α-2a(Interferon Alfa-2a)、干扰素α-2b(Interferon Alfa-2b)、干扰素α-nl(Interferon Alfa-nl)、干扰素α-n3(Interferon Alfa-n3)、干扰素β-Ia(Interferon Beta-Ia)、干扰素γ-Ib(Interferon Gamma-Ib)、异丙铂(Iproplatin)、盐酸利多替康(lrinotecan Hydrochloride)、醋酸兰瑞肽(Lanreotide Acetate)、来曲唑(Letrozole)、醋酸留普罗莱得(Leuprolide Acetate)、盐酸拉罗唑(LiarozoleHydrochloride)、洛美曲康钠(Lometrexol Sodium)、洛莫司汀(Lomustine)、盐酸洛索蒽醌(Losoxantrone Hydrochloride)、马索罗酚(Masoprocol)、美登素(Maytansine)、盐酸三氯乙胺(Mechlorethamine Hydrochloride)、醋酸甲地孕酮(Megestrol Acetate)、醋酸米那司酯(Melengestrol Acetate)、美法仑(Meiphalan)、美诺立尔(Menogaril、巯基嘌呤(Mercaptopurine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、甲氨蝶呤钠(Methotrexate Sodium)、美妥能(Metoprine)、美妥替派(Meturedepa)、米丁度胺(Mitindomide)、米托卡星(Mitocarcin)、米托克罗明(Mitocromin)、米托马星(Mitomalcin)、丝裂霉素(Mitomycin)、米托司培(Mitosper、米托坦(Mitotane)、盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone Hydrochloride)、霉酚酸(Mycophenolic Acid)、诺考达唑(Nocodazole)、诺加霉素(Nogalamycin)、奥马铂(Ormaplatin)、奥昔舒仑(Oxisuran)、紫杉醇(Paclitaxel)、培门冬酶(Pegaspargase)、佩里霉素(Peliomycin)、苯达莫司汀(Pentamustine)、硫酸培洛霉素(Peplomycin Sulfate)、培磷酰胺(Perfosfamide)、呱泊溴烷(Pipobroman)、呱泊舒凡(Piposulfan)、盐酸吡罗沙酮(Piroxantrone Hydrochloride)、普卡霉素(Plicamycin)、普洛美坦(Plomestane)、波默钠(Pommer Sodium)、波福霉素(Porfiromycin)、松龙苯芥(Prednimustine)、盐酸丙卡巴肼(Procarbazine Hydrochloride)、嘌呤霉素(Puromycin)、盐酸紫霉素(PuromycinHydrochloride)、吡唑呋喃(Pyrazofurin)、利波腺苷(Riboprine)、罗谷亚胺(Rogletimide)、沙芬戈(Safingol)、盐酸沙芬戈(Safingol Hydrochloride)、司莫司汀(Semustine)、辛曲秦(Simtrazene)、斯帕福斯酸钠(Sparfosate Sodium)、稀疏霉素(Sparsomycin)、盐酸西酞菁(Spirogermanium Hydrochloride)、螺莫司汀(Spiromustine)、螺铂(Spiroplatin)、链黑菌素(Streptonigrin)、链脲佐菌素(Streptozocin)、磺氯苯脲(Sulofenur)、他利霉素(Talisomycin)、紫杉醇(Taxol、替卡格兰钠(Tecogalan Sodium)、替加氟(Tegafur)、盐酸泰洛沙醌(TeloxantroneHydrochloride)、替莫泊芬(Temoporfin)、替尼泊苷(Teniposide)、替罗昔隆(Teroxirone)、睾内酯(Testolactone)、硝咪硫鸟嘌呤(Thiamiprine)、硫鸟嘌呤(Thioguanine)、噻替派(Thiotepa)、噻唑呋林(Tiazofurin)、替拉扎明(Tirapazamine)、盐酸托泊替康(Topotecan Hydrochloride)、柠檬酸托瑞米芬(Toremifene Citrate)、醋酸曲托龙(Trestolone Acetate)、磷酸曲西立滨(Triciribine Phosphate)、三甲曲沙(Trimetrexate)、三甲曲沙葡糖醛酸脂(Trimetrexate 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B)、洛瑞林(deslorelin)、右异环磷酰胺(dexifosfamide)、右雷佐生(dexrazoxane)、右维拉帕米(dexverapamil)、地口丫醌(diaziquone)、代代宁B(didenminB)、戴度克斯(didox)、二乙基降精素(diethylnorspermine)、二氢-5-氮胞苷(dihydro-5-azacytidine)、9-二氢紫杉醇(dihydrotaxol,9-)、二草霉素(dioxamycin)、二苯基螺莫司汀(diphenyl spiromustine)、二十二烷醇(docosanol)、多拉司琼(dolasetron)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、屈洛昔芬(droloxifene)、屈大麻酚(dronabinol)、杜卡霉素SA(duocarmycin SA)、依布石西(ebselen)、依考莫司汀(ecomustine)、依地福新(edelfosine)、依决洛单抗(edrecolomab)、依氟鸟氨酸(eflomithine)、榄香烯(elemene)、乙嘧替氟(emitefur)、表柔比星(epirubicin)、爱普列特(epristeride)、雌莫司汀类似物(estramustine analogue)、雌激素激动剂(estrogen agonists)、雌激素拮抗剂(estrogenantagonists)、依他硝(etanidazole)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate、依西美坦(exemestane)、法多罗唑(fadrozole)、法扎拉滨(fazarabine)、芬维a胺(fenretinide、非格司亭(filgrastim)、非那雄胺(finasteride)、夫拉平度(flavopiridol)、氟卓斯汀(flezelastine)、氟拉睾酮(fluasterone)、氟达拉滨(fludarabine)、氟化尿核酸盐酸盐(fluorodaunorunicin hydrochloride)、福酚美克(forfenimex)、福美坦(formestane)、福斯曲星(fostriecin)、福莫司汀(fotemustine)、钆泰克萨菲瑞(gadolinium texaphyrin)、硝酸镓(gallium 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interferon)、留普罗莱得+雌激素+孕酮(leuprolide+estrogen+progesterone)、留普瑞林(leuprorelin、左旋咪唑(levamisole、利阿唑(liarozole)、线性多胺类似物(linear polyamine analogue)、亲脂性二糖肽(lipophilic disaccharide peptide)、亲脂性铂化合物(lipophilic platinumcompounds)、赖索林酰胺7(lissoclinamide 7)、洛铂(lobaplatin)、胍乙基磷酸(lombricine)、洛美曲索(lometrexol)、氯尼达明(lonidamine、洛索蒽醌(losoxantrone)、洛伐他汀(lovastatin)、洛索立宾(loxoribine、勒托替康(lurtotecan)、镥泰克萨菲瑞(lutetium texaphyrin)、来索菲林(lysofylline)、裂解肽(lytic peptides)、美坦辛(maitansine)、甘露司他丁A(mannostatinA)、马立马司他(marimastat)、马索罗酚(masoprocol)、马司平(maspin)、基质裂解素抑制剂(matrilysin inhibitors)、基质金属蛋白酶抑制剂(matrix metalloproteinase inhibitors)、美诺立尔(menogaril)、麦尔巴隆(merbarone)、美替瑞林(meterelin)、甲硫氨酸酶(methioninase)、甲氧氯普胺(metoclopramide)、MIF抑制剂(MIF inhibitor)、米非司酮(mifepristone、米替福新(miltefosine)、米立司亭(mirimostim)、不匹配的双链RNA(mismatched double strandedRNA)、米托胍腙(mitoguazone)、二溴卫矛醇(mitolactol)、丝裂霉素类似物(mitomycinanalogues)、米托奈法德(mitonafide)、丝裂素成纤维细胞生长因子-通丝蛋白(mitotoxinfibroblast growth 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inducer)、奥马铂(ormaplatin)、奥沙孕烯酮(osaterone)、奥沙利铂(oxaliplatin)、奥艘诺霉素(oxaunomycin)、紫杉醇类似物(paclitaxel analogues)、紫杉醇衍生物(paclitaxelderivatives)、帕劳胺(palauamine)、棕榈酰根瘤菌素(palmitoylrhizoxin)、帕米酸(pamidronic acid)、人参三醇(panaxytriol)、帕诺米芬(panomifene)、帕托拉唑(parabactin)、帕折普汀(pazelliptine)、培门冬酶(pegaspargase)、培尔德辛(peldesine)、木聚硫钠(pentosan polysulfate sodium)、喷司他丁(pentostatin)、喷卓唑(pentrozole)、全氟溴烷(perflubron)、过磷酰胺(perfosfamide)、紫苏醇(perillylalcohol)、菲那吉诺霉素(phenazinomycin)、苯乙酸(phenylacetate)、磷酸酶抑制剂(phosphatase inhibitors)、溶血链球菌(picibanil)、盐酸毛果芸香碱(pilocarpinehydrochloride)、吡柔比星(pirarubicin)、吡曲克辛(piritrexim)、普雷司亭A(placetinA)、普雷司亭B(placetin B)、纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activatorinhibitor)、铂络合物(platinum complex)、铂化合物(platinum compounds)、铂三胺络合物(platinum-triamine complex)、卟吩醇钠(porfimer sodium)、波福霉素(porfiromycin)、丙基双吖啶酮(propyl bis-acridone)、前列腺素J2(prostaglandinJ2)、蛋白酶体抑制剂(proteasome inhibitors)、基于蛋白A的免疫调节剂(protein A-based immune modulator)、蛋白激酶C抑制剂(protein kinase C inhibitor)、蛋白激酶C抑制剂(protein kinase C inhibitors)、微藻(microalgal)、蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂(protein tyrosine phosphatase inhibitors)、嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂(purinenucleoside phosphorylase inhibitors)、红紫素(purpurins、吡唑吖啶(pyrazoloacridine)、吡哆醛化血红蛋白聚氧乙烯缀合物(pyridoxylated hemoglobinpolyoxyethylene conjugate)、raf拮抗剂(raf antagonists)、雷替曲塞(raltitrexed)、雷莫司琼(ramosetron)、rasfamesyl蛋白转移酶抑制剂(rasfamesyl proteintransferase inhibitors)、ras抑制剂(ras inhibitors)、ras-GAP抑制剂(ras-GAPinhibitor)、去甲基化雷铁立亭(retelliptine demethylated)、铼Re 186乙二膦酸(rhenium Re 186etidronate、根瘤菌素(rhizoxin)、核酶(ribozymes)、RII视黄醛(RIIretinamide)、罗谷亚胺(rogletimide)、罗西图基(rohitukine)、罗莫肽(romurtide、罗喹美克(roquinimex、卢比基农BI(rubiginone BI)、卢巴克西尔(ruboxyl)、沙芬戈(safingol)、圣托平(saintopin、SarCNU)、沙寇非陀A(sarcophytolA)、沙莫司亭(sargramostim)、Sdi I模拟物(Sdi I mimetics)、司莫司汀(semustine)、衰老衍生抑制剂I(senescence derived inhibitor I)、正义寡核苷酸(sense oligonucleotides)、信号转导抑制剂(signal transduction inhibitors)、信号转导调节剂(signal transductionmodulators)、单链抗原结合蛋白(single chain antigen binding protein)、西佐喃(sizofuran)、索布佐生(sobuzoxane)、硼癸酸钠(sodium borocaptate)、苯乙酸钠(sodiumphenylacetate)、索维龙(solverol)、生长调节蛋白结合蛋白(somatomedin bindingprotein)、索纳明(sonermin)、斯帕福斯酸(sparfosic acid)、司皮卡霉素D(spicamycinD)、螺莫司汀(spiromustine)、脾潘亭(splenopentin)、海绵司他丁I(spongistatin I)、角鲨素(squalamine)、干细胞抑制剂(stem cell inhibitor)、干细胞分裂抑制剂(stem-celldivision inhibitors)、司提皮酰胺(stipiamide)、溶基质蛋白酶抑制剂(stromelysininhibitors)、硫诺辛(sulfinosine)、超活性血管活性肠肽拮抗剂(superactivevasoactive intestinal peptide antagonist)、苏拉迪司塔(suradista)、苏拉明(suramin)、苦马豆素(swainsonine)、合成糖胺聚醣(synthetic glycosaminoglycans)、他莫司汀(tallimustine)、他莫昔芬甲碘化物(tamoxifen methiodide)、牛磺莫司汀(tauromustine)、他札罗汀(tazarotene)、替卡格兰钠(tecogalan sodium、替加氟(tegafur)、铁碌拉皮立(tellurapyrylium)、端粒酶抑制剂(telomerase inhibitors)、替莫泊芬(temoporfin)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide、四氯癸氧化物(tetrachlorodecaoxide)、四氮胺(tetrazomine)、沙立步拉司丁(thaliblastine)、沙利度胺(thalidomide)、噻寇拉林(thiocoraline)、血小板生成素(thrombopoietin)、血小板生成素模拟物(thrombopoietin mimetic)、胸腺法新(thymalfasin)、胸腺生成素受体激动剂(thymopoietin receptor agonist)、胸腺曲南(thymotrinan)、促甲状腺激素(thyroidstimulating hormone)、锡乙基血浆素(tin ethyl etiopurpurin)、替拉扎明(tirapazamine、二氯环戍二烯钛(titanocene dichloride)、托泊替康(topotecan)、托森亭(topsentin)、托瑞米芬(toremifene)、全能干细胞因子(totipotent stem cellfactor)、转译抑制剂(translation inhibitors)、维A酸(tretinoin)、三乙酰基尿苷(triacetyluridine)、曲西立滨(triciribine)、三甲曲沙(trimetrexate、曲普瑞林(triptorelin)、托烷司琼(tropisetron)、妥罗雄脲(turosteride)、酪胺酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors)、酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostins)、UBC抑制剂(UBCinhibitors)、乌苯美司(ubenimex)、泌尿生殖窦衍生生长抑制因子(urogenital sinus-derived growth inhibitory factor)、尿激酶受体拮抗剂(urokinase receptorantagonists)、伐普肽(vapreotide)、替丁林B(variolin B)、载体系统(vector system)、红血球基因治疗法(erythrocyte gene therapy)、维拉雷琐(velaresol)、藜芦胺(veramine)、维丁(verdins)、维替泊芬(verteporfin)、长春瑞滨(vinorelbine)、文沙亭(vinxaltine)、维塔克辛(vitaxin)、伏氯唑vorozole)、扎诺特隆(zanoterone)、杰尼铂(zeniplatin)、亚节维(zilascorb)、净司他丁司替美(zinostatinstimalamer)、抗代谢药物(antimetabolites)、铂类药剂(platinum-based agents)、烷基化剂(alkylatingagents)、酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors)、蒽环类抗生素(anthracycline antibiotics)、长春花生物碱(vinca alkaloids)、蛋白酶体抑制剂(proteasome inhibitors)、大环内酯类(macrolides)、以及拓扑异构酶抑制剂(topoisomerase inhibitors)。

本文进一步揭露了一种用于抑制肿瘤转移的药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体以及式(I)的化合物。

本发明还涉及一种用于治疗癌症的药物组合物。该药物组合物包含药学上可接受的载体、用于抑制癌症生长的化学治疗药剂以及式(I)的化合物。

合成式(I)化合物的方法是本领域所熟知的。参见例如R.Larock,ComprehensiveOrganic Transformations(2nd Ed.,VCH Publishers 1999)；P.G.M.Wuts andT.W.Greene,Greene’sProtective Groups in Organic Synthesis(4th Ed.,John Wileyand Sons 2007)；L.Fieser and M.Fieser,Fieser and Fieser’s Reagents for OrganicSynthesis(John Wiley and Sons 1994)；L.Paquette,ed.,Encyclopedia of Reagentsfor Organic Synthesis(2nd ed.,John Wiley and Sons2009)；S.Miyazawa,M.Shinoda,T.Kawahara,N.Watanabe,H.Harada,D.Iida,H.Terauchi,J.Nagakawa,H.Fujisaki,A.Kubota,M.Ueda“Benzimidazole Compound”WO 2006112442；M.R.Mautino,S.Kumar,F.Jaipuri,J.Waldo,T.Kesharwani,M.N.Vahanian,C.J.Link,J.Lalonde,G.Prendergast,A.Muller,W.Malachowski“IDO Inhibitors”WO2009132238；T.Axenrod,J.Sun,K.K.Das,P.R.Dave,F.Forohar,M.Kaselj,N.J.Trivedi,R.D.Gilardi,J.L.Flippen-Anderson“Synthesis and Characterization of 5-Substituted 1,3-DiazacyclohexaneDerivatives”J.Org.Chem.2000,65,1200–1206；C.D.Magnusson,G.G.Haraldsson“Chemoenzymatic Synthesis of Symmetrically Structured TriacylglycerolsPossessing Short-chain Fatty Acids”Tetrahedron,2010,66,2728–2731。

由此制备的式(I)化合物可以初步筛选使用人类乳腺肿瘤细胞生长抑制测定法(human mammary tumor cell growth inhibition assay)检测其抑制人类乳腺肿瘤细胞(human mammary tumor cells)，如SKBR3以及MDA-MB-231对于细胞生长的功效。随后可以使用体内检测(in vivo assays)，如小鼠乳腺肿瘤细胞转移测定法评估其于肿瘤切除后抑制老鼠乳腺肿瘤细胞转移的功效。可以进一步测试所选择的化合物以验证其在治疗癌症中的功效。例如，化合物可以与化学治疗药剂，(如，多西紫杉醇(docetaxel))共同施予具有肿瘤的动物(如，小鼠)，然后评估其治疗效果。基于该结果，可以确定适当的剂量范围和给药途径。

在没有进一步的阐述下，相信本领域技术人员可以基于以上描述，最大限度地利用本发明。因此，以下具体实施例系被解释为仅是说明性的，无论如何都不是限制性的揭露其余部分。所引用的公开文献内容已通过引用并入本发明。

以下是用于制备和测试前述式(I)化合物的材料与方法。

化学材料与分析

所有化学品和溶剂均从商业供货商处购买并按原样使用。所有反应在干燥氮气环境下进行。使用Merck 60F254硅胶玻璃衬板(5×10cm)透过薄层层析法(Thin LayerChromatography，TLC)监测反应。在紫外线照射(254nm)下或通过用喷洒磷钼酸试剂(Aldrich)并于80℃下加热后，目视检测区域。所有快速管柱层析系使用Merck Kieselgel60，No.9385，230-400网目ASTM硅胶作为固定相进行。在Varian Mercury-300或VarianMercury-400光谱仪上测量质子(1H)核磁共振谱。相对于溶液层析峰(solvent peak)的共振，在δ标度上以百万分之一(ppm)记录部分化学位移。以下缩写用于描述耦合情形：s＝单重峰；d＝双重峰；t＝三重峰；q＝四重峰；quin＝五重峰；br＝宽光谱；以及m＝多重峰。

化合物

甲基(E)-3-[2-(3,4-二羟苯基)-7-羟基-3-甲氧羰基-2,3-二氢-1-苯并呋喃-5基]-2-丙烯酸，即Q2-3，系根据Pieters等人于Journal of medicinal chemistry,42,5475-5481(1999)中所描述的方法进行制备并为表征。更具体地，在无水苯和无水丙酮的存在下，透过氧化银将咖啡酸甲酯二聚产物通过硅胶柱层析以乙酸乙酯正己烷(ethylacetate n-hexane)作为洗脱剂进行纯化。蒸发后，得到无色无定形固体(18.8％)。1H NMR(CDCl3,400MHz)_ppm 3.64(3H,s),3.66(3H,s),4.14(1H,d,J＝7.2Hz),5.87(1H,d,J＝7.2Hz),6.12(1H,d,J＝16.0Hz),6.61(1H,dd,J＝8.4,2.0Hz),6.69(1H,d,J＝8.4Hz),6.76(1H,d,J＝2.0Hz),6.90(1H,brs),6.93(1H,br s),7.43(1H,d,J＝16.0Hz)。

其他类似物以上述方式制备。对于所有生物测试，化合物是新鲜溶解于DMSO中，作为50mM储备溶液，并在相同的培养基中进一步稀释。

细胞株

4T1、TS/A、3T3、SKBR3、WI38、NHDF、MCF-7、MCF-10A以及MDA-MB-231细胞得自美国典型菌种保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)(马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)。4T1、4T1-luc2(即以IF4γ启动子驱动的荧光基因(IF4γpromoter-drivenluciferase gene)转染之4T1细胞)、MDA-MB-231、MDA-MB-231-luc2(即以IF4γ启动子驱动的荧光基因转染之MDA-MB-231细胞)、SKBR3以及WI38细胞株系由萧培文博士(“中央研究院”，台北，中国台湾)提供。MCF-10A细胞株系由李文华博士(“中央研究院”，台北，中国台湾)提供。NHDF细胞株系由蒋丙煌博士(台大食品科技研究所，台北，中国台湾)提供。将4T1以及MDA-MB-231-luc2细胞维持在补充有10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、100μM非必需氨基酸以及100μM丙酮酸钠的RPMI-1640(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)完全培养基之中。将稳定转染的4T1-luc2细胞补充有0.5％嘌呤霉素(puromycin)的RPMI完全培养基中。3T3、NHDF以及TS/A细胞维持在补充有3.7g/L碳酸氢钠、3.6g/L HEPES以及10％FBS的DMEM(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)中。将MCF-7细胞维持在补充有3.7g/L碳酸氢钠以及10％FBS的DMEM中。将WI38以及M10细胞保持在补充有2.2g/L碳酸氢钠、3.6g/L HEPES、1X非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠以及10％FBS的MEM(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)中。将SKBR3以及MDA-MB-231细胞维持在补充有2g/L葡萄糖以及10％FBS的DMEM/F-12(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)中。将MCF-10A细胞维持在补充有10μg/ml胰岛素以及10％FBS的DMEM/F-12中。所有培养基均补充有100μg/ml链霉素(streptomycin)、100单位/ml青霉素(penicillin)和2mM L-谷氨酰胺。细胞在37℃、5％CO2的培养箱中生长。

建立三维共培养系统

为了模拟肿瘤微环境，采用三维(3-D)共培养系统以维持乳腺肿瘤细胞以及肿瘤相关的纤维母细胞(tumor-associated fibroblasts)于，如Rajan等人所发表Natureprotocols,1,2753-2758(2006)之相邻的胶原凝胶(collagen gels)中。更具体地说，溶解在乙酸中的大鼠尾胶原蛋白溶液(rat tail collagen solution)以1N NaOH中和，接着在4℃下以9:1的比例与10×PBS混合。为了构建实体瘤样细胞群(solid tumor-like cellmass)，将每个相应培养基(1×10 6个细胞/ml)中的小鼠(4T1或TS/A细胞)或人(MCF-7或MDA-MB-231细胞)的乳腺肿瘤细胞以1:1比例的4mg/ml胶原蛋白溶液混合。立即分别装载4滴胶原蛋白-肿瘤细胞混合物(1×10 4个细胞/10μl/滴)于6孔细胞培养分隔盘的每个分隔中，然后将分隔盘翻转并维持在37℃的CO 2培养箱中以进行胶原凝胶化。为了制备基质胶原蛋白凝胶(图3c)，将培养基与4mg/ml胶原蛋白溶液以1:1的比例(最终浓度：2mg/ml)进行混合。等分的1ml基础胶原蛋白溶液装载到培养分隔盘上，并逐一以胶原-肿瘤细胞混合物覆盖。然后将培养盘维持在37℃的CO 2培养箱中另外10分钟。为制备包含纤维母细胞的胶原蛋白凝胶，将每个相应培养基(3×10 6细胞/ml)中的小鼠(3T3细胞)或人(WI38)纤维母细胞与4mg/ml的胶原蛋白溶液以3:1的比例混合。1ml含有纤维母细胞的胶原蛋白溶液(1×106个细胞/1ml/孔)，并立即装载在每个固体基础胶原蛋白凝胶上。最后，将各纤维母细胞类型的培养基加入顶层，并将不同药物处理的测试化合物悬浮于之中。在肿瘤细胞以及纤维母细胞共培养24或72小时后，直接从每个孔中收集液体培养基用于进一步的测试。

为了从3-D胶原蛋白凝胶中的纤维母细胞中收集全部蛋白质，将一层包含有纤维母细胞的胶原蛋白凝胶从基础凝胶上分离出来，通过使用吸量管端部以平滑地刮除胶原蛋白层。然后使用剪刀将每个收集的含纤维母细胞的胶原凝胶在微离心管中切碎，并分别溶解于1ml Trizol(Invitrogen)或1ml组织蛋白萃取试剂(Tissue Protein ExtractionReagent)(Thermo)中，以分别萃取全部的RNA以及细胞蛋白。

细胞存活率分析(MTT Assay)

将分配于96孔培养盘中的M10、WI38、SKBR3以及MDA-MB-231细胞(1×105cells/ml)与载体(vehicle)或测试化合物(Q2-3)一起于5％CO2培养箱中相应的基础培养基培养24或72小时。为了评估Q2-3处理的纤维母细胞分泌的IL-25对于乳腺肿瘤细胞生长活性的影响，将分配于96孔培养盘中的4T1以及MDAMB-231细胞(1×104cell/ml)与对照组培养基或不同的纤维母细胞对照培养基(200μl/ml)，每天更换持续5天。所有处理均在一式三份的细胞培养物中进行。使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl)-2,5-二苯基四唑溴化物(3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)(MTT；Sigma-Aldrich)比色法测定细胞的生长活性。使用多孔扫描分光光谱仪(multiwall scanningspectrophotometer)测量570nm处的吸亮度(A570)。

小鼠

自中国台湾台北购买鼠龄6-8周的雌性BALB/c小鼠以及裸鼠(BALB/cAnN.Cg-Foxnlnu/CrlNarl)。在特定病原体条件下，将受试小鼠保持在维持于24±2℃以及40-70％湿度、12小时光/黑周期的层流气流柜中。涉及动物的所有操作和实验方案均由台北“中央研究院”动物实验管理小组(Institutional Animal Care and Utilization Committee，IACUC)批准。

4T1-Luc2以及MDA-MD-231-Luc2乳腺癌-肿瘤切除模型

BALB/c小鼠，在异氟烷(isoflurane)麻醉下将4T1-Luc2细胞(5×105/100μl PBS/小鼠)经皮下注射到第四乳腺脂肪垫中。肿瘤生长系通过根据以下公式测量肿瘤体积来监测：体积＝长度×(宽度)2/2。在第14天肿瘤建立(180-200mm3)后，将受试小鼠分成不同组别(8只小鼠/组)并进行不同的处理。在肿瘤细胞植入后15天，原位初级4T1肿瘤通过肿瘤切除术去除。对于药物治疗，给小鼠施予不同的试剂，包括载体-对照(vehicle-control)(PBS)、小鼠IL-25蛋白(10μg/kg，ProSpec，瓦恩兰，美国纽泽西州)、Q2-3(2、20或100μg/kg)或多西紫杉醇(2mg/kg，Sigma-Aldrich)，于肿瘤切除后通过静脉注射3周(3次注射/周)。对于小鼠IL-25活性的体内中和，在肿瘤切除后第0、3、6、9、12、15、18天，将小鼠通过腹腔注射100μg抗小鼠IL-25(IL-17E)抗体(克隆35B，Biolegend)或同种型对照大鼠IgG(100μg，大鼠，IgG1κ，Biolegend)。为了检测人MDA-MD-231-Luc2肿瘤细胞的转移，在异氟烷麻醉下，将裸鼠皮下注射5×10 5MDA-MD-231-Luc2细胞至乳腺脂肪垫。在第24天肿瘤建立(250-350mm3)后，将测试小鼠分成不同组(8只小鼠/组)并进行不同的处理。在植入肿瘤细胞后25天，初级原位MDA-MD-231-Luc2肿瘤通过肿瘤切除手术手术切除。对于药物治疗，给予小鼠PBS(载体-对照)、Q2-3(100μg/kg)、多西紫杉醇(5mg/kg)或Q2-3(100μg/kg)+多西紫杉醇(5mg/kg)，于肿瘤切除后通过静脉注射3周(3次注射/周)。为了监测老鼠(4T1)或人(MDA-MD-231)转移性肿瘤的进展，将以不同药物/试剂处理的受试小鼠另外进行8周肿瘤转移活性以及存活率进行比较。在腹膜内注射150mg/kg D-荧光素(D-luciferin)(NanoLighttechnology，派托普湖畔，美国亚利桑那州)后，使用非侵入性IVIS影像系统(Calipers，霍普金顿，美国麻萨诸塞州)分析受试小鼠中4T1-luc2肿瘤细胞的生物发光信号。

免疫荧光染色

从每个肿瘤切除的小鼠获得的肺组织标本以4％福尔马林固定并包埋在石蜡中。为了组织学上的比较，制备6μm厚的组织切片，并以苏木精(hematoxylin)及伊红(eosin)(H&E)染色。对于免疫荧光染色，固定的组织切片最先浸入沸腾的柠檬酸钠(sodiumcitrate)缓冲液(0.01M柠檬酸钠缓冲液，pH 6.0)中30分钟。用5％脱脂牛奶封闭肺组织切片，并与抗FSP-1抗体(1:200稀释，Millipore)、FITC键结(FITC-conjugated)之抗CD206抗体(1:200稀释，Biolegend)或PE键结(PE-conjugated)之抗IL-25抗体(1：100；R&D)于1％脱脂牛奶中室温下1小时。接着以含有0.1％聚氧乙烯山梨醇酐月桂酸酯(Tween20)的PBS洗涤切片。为了检测初级抗体，将部分切片与FITC键结的抗小鼠IgG(1:200，JacksonImmunoresearch，维斯特格罗夫，宾夕法尼亚州)一起培养以用于FSP-1。4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)(1μg/ml；Sigma-Aldrich)系用于染色细胞核。织切片免疫染色的荧光显微镜评估系使用ZeissAxiovert200M显微镜(Carl Zeiss，海德堡，德国)进行。使用数字相机(Orca ER，Hamamatsu)拍摄图像，并使用Axiovision 4.6.3(Carl Zeiss)进行处理。

条件培养基中IL-25之抗体调节的清除(Antibody-mediated depletion of IL-25)

为了在3T3或MDA-MB-231细胞的条件培养基中降低以及耗尽IL-25蛋白质分子，根据制造商的建议下使用磁珠抗体偶联之试剂组(Dynabeads antibody coupling kit)(Life Technology；14311D)，产生10mg/ml抗IL25抗体(ProteinTech，芝加哥，伊利诺伊州)-偶联珠粒。将兔子IgG(ProteinTech，芝加哥，伊利诺伊州)用以作为同种型对照抗体，抗体偶联反应后，将每个条件培养基(4ml)与2mg抗体偶联珠粒于室温下的滚轮上作用1小时，接着将条件培养基(CM)置于磁铁上1分钟，使得珠粒于管壁上进行收集。自3T3-CM、NHDF-CM或WI38-CM中抗体抓到之蛋白质(antibody-pulled down proteins)使用西方墨点转渍分析法(western blot analysis)检测每种条件培养基中分泌的IL-25蛋白含量。在一些试验中，收集上清液并用来处理于小鼠或人乳腺肿瘤细胞上。

IL-25R siRNA处理

转染前将MDA-MB231以及MCF-7细胞以每孔105个细胞种于6孔培养盘中24小时。用于抑制人IL-25受体(IL25-RB)表现的siRNAs购自Biotools(中国台湾)，如下：IL-17RB-homo-448(IL-25R-1siRNA)；IL-17RB-homo-519(IL-25R-2siRNA)；IL-17RB-homo-956(IL-25R-2siRNA)；阴性对照(Neg)。在转染开始时，将每个测试的IL25RsiRNA寡聚体(oligomers)(100pmol)于250μl Opti-MEM I减低血清培养基(Opti-MEM I Reduced SerumMedium)中稀释。等分的5μl荧光金纳米团簇(Lipofectamine 2000)转染试剂(Invitrogen)于250μl的Opti-MEM I减低血清培养基中稀释。将稀释的oligomers与稀释的Lipofectamine 2000轻轻混合，并在室温下培养20分钟。随后将oligomers-Lipofectamine2000复合物加到每个含有细胞和培养基的培养孔中。将细胞在37℃培养72小时，直到受测细胞准备好以IL25细胞因子或不同的条件培养基进行处理。

西方墨点转渍检测法(Western blot assay)

3T3、WI38、NHDF、MDA-MB-231、MCF-10A以及MCF-7的细胞裂解物，或自3T3、WI38或NHDF条件培养基中IL-25抓到之蛋白质裂解物，通过使用8、10或15％的分段凝胶进行SDS-PAGE电泳分离。将分离的蛋白质转移到PVDF膜(PVDF membrane)(Novex，圣地亚哥，加利福尼亚州)上，并以anti-IL-25、anti-IL-25R(兔子多元抗体；ProteinTech，芝加哥，伊利诺伊州)、anti-Caspase-3(抗半胱氨酸蛋白酶-3)(兔子多元抗体，Abcam，美国麻萨诸塞州)、anti-Caspase-8(抗半胱氨酸蛋白酶-8)(小鼠单元抗体，Cell Signaling，波士顿，美国麻萨诸塞州)或anti-β-actin(抗β-肌动蛋白)(兔子多元抗体，Abcam)进行墨点转渍。将膜(membrane)在室温下于含有5％脱脂奶粉之PBST缓冲液(PBST buffer)(含有0.1％Tween20的磷酸盐缓冲盐水(PBS))中封闭60分钟。接着将封闭后的转渍膜(Blotted membranes)在4℃下以特定的市售抗体(1:1000稀释)培养隔夜。使用小鼠β-actin蛋白作为参照来评估相等量下的蛋白质。转渍膜以PBST缓冲液冲洗3次，每次5分钟。将洗涤的转渍膜与HRP键结的二抗(山羊多元抗体；1:100000稀释，Abcam)一起培养，再以PBST缓冲液洗涤三次。转染的蛋白质以增强的化学发光(chemiluminescence)(ECL)检测试剂盒(Amersham PharmaciaBiotech，白金汉郡，英国)显现。使用ImageJ软件对发光带中的蛋白进行定量。

流式细胞仪检测

为检测骨髓抑制型细胞(myeloid derived suppressor cells，MDSC)，收集每组组织中的小鼠肺细胞并在4℃下以抗体特异性细胞标记(antibodies against specificcell markers)染色30分钟，其包括FITC键结的抗小鼠CD11b(用于细胞表面)、APCCy7键结的抗小鼠Ly-6C以及PE键结的抗小鼠Ly-6G(均用于细胞内染色)。所有三种抗体得自Biolegend(圣地亚哥，加利福尼亚州)。单核以及颗粒MDSCs细胞的百分比分别以CD11b+Ly-6C+细胞以及CD11b+Ly-6G+细胞进行圈选(gated)。为了定量表达IL-25的纤维母细胞，分离自小鼠肺组织的个别细胞，以Alexa

647-键结的抗ER-TR7(Novus，美国)与抗FSP-1(Millipore)一抗，以及FITC键结之二抗(Abcam)进行染色。PE键结的抗小鼠IL-17E抗体(R&D)用于肺组织中细胞内IL-25分子的染色。表达IL-25之纤维母细胞的百分比以FSP-1+ER-TR7+细胞进行圈选(gated)。流式细胞仪检测在“中央研究院”农业生物科技研究中心(ABRC)的FACS LSR II(BD，荷兰)机器上进行。

统计分析

统计分析系使用不成对的双尾Student's t检定进行。使用GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software)进行统计分析。通过Kaplan-Meier曲线的对数排序(log-rank)(Mantel-Cox)检定来确定肿瘤转移或小鼠存活率的差异。所有统计检定均为双侧。小于0.05的P值被认为是显著的(*，P<.05；**，P<0.01；***，P<0.001；n.s，不显著)。

实施例1：Q2-3对乳癌以及非恶性细胞的细胞毒性作用。

进行了一项研究以评估Q2-3对乳癌和非恶性细胞的细胞毒性作用。

图1为苯并二氢呋喃类木脂素(Q2-3)对乳癌及非恶性细胞之细胞毒性影响的示意图。(a)：由两个咖啡酸甲酯分子组成合成Q2-3(甲基(E)-3-[2-(3,4-二羟基苯基)-7-羟基-3-甲氧基羰基-2,3-二氢-1-苯并呋喃-5-基]丙-2-烯酸酯)的示意图。(b)和(c)：MTT测定Q2-3对于SKBR3(ER-Her+人类乳腺癌细胞株)、MDA-MB-231(ER-Her-人类乳腺癌细胞株)、M10(人类正常上皮细胞株)以及WI38(人类肺纤维母细胞株)的细胞毒性作用。种植2×104个细胞并于Q2-3处理24或72小时后对其生长活性进行比较。在0.3μM检测到Q2-3的起始细胞毒性剂量，SKBR3和MDA-MB-231细胞的杀死率>50％。

甲基(E)-3-[2-(3,4-二羟基苯基)-7-羟基-3-甲氧基羰基-2,3-二氢-1-苯并呋喃-5-基]丙-2-烯酸酯，如Q2-3，系按图1a示意图所示由咖啡酸甲酯合成。Q2-3作为单一异构体纯度约为96％。

在正常人类乳腺上皮细胞(normal human mammary epithelial，M10)、正常人类乳腺纤维母细胞(WI38)以及两个人类乳腺肿瘤细胞(SKBR3和MDA-MB-231)，这四种不同细胞株上测试了Q2-3对细胞活力的影响，通过以不同浓度的Q2-3处理细胞24小时(图1b)以及72小时(图1c)。图1b和1c都显示，与对照组(0.1％DMSO)的细胞相比，Q2-3有效地抑制SKBR3和MDA-MB-231细胞的生长(≥60％抑制)，在相对低的浓度下(≥0.5μM)。相比之下，M10以及WI38细胞株对于Q2-3处理显示出更高得多的抗性，在2μM浓度时显示≥80％的存活力。

这些结果表示Q2-3对乳腺肿瘤细胞表现出高的细胞毒性作用，但对正常的人类乳腺上皮细胞和纤维母细胞无明显影响。

实施例2：Q2-3对抑制小鼠中4T1乳腺肿瘤细胞转移的效果

进行了一项研究以评估Q2-3对抑制小鼠中4T1乳腺肿瘤细胞转移的影响。

图2为小鼠肿瘤切除后，Q2-3抑制4T1乳腺肿瘤细胞移转的结果示意图。(a)：切除原位原发性肿瘤后，以PBS(0.1％DMSO于生理食盐水)、多柔比星(2mg/kg)或不同剂量的Q2-3进行体内治疗处理的肿瘤小鼠(每组n＝8)之代表性生物发光影像。以PBS处理组(载体)中，有三只小鼠在肿瘤切除术前3周死亡。红色信号代表比色刻度上的最高表现量。(b)：沿着指定的时间周期(每组n＝8)，透过测量小鼠中p/s/cm 2/sr的荧光素酶活性来定量肿瘤转移。(c)：不同处理后测试小鼠的存活率。在对照(DMSO)和Q2-3处理(20或100μg/kg)组之间P<0.05。(通过log-rank检定分析Kaplan-Meier的结果)。(d)：通过流式细胞仪检测定量受试小鼠肺组织中Q2-3(2、20或100μg/kg)对于单核细胞(CD11b+Ly6C+)以及颗粒细胞(CD11b+Ly6G+)MDSCs群体变化的影响分析，使用FACS系统和DIVA软件。

为探讨Q2-3的抗转移作用，将基因转殖的荧光素酶表达老鼠4T1-Luc2细胞注射到受试小鼠的乳腺脂肪垫中。在肿瘤细胞植入后15天，通过手术切除步骤小心地去除原位4T1肿瘤。如图2所示，在随后的8周内检查并比较对照组和Q2-3治疗小鼠的肿瘤转移活性和存活时间。图2a显示，通过检测4T1-Luc2细胞的发光活性作为肿瘤转移的指标，发现Q2-3治疗(≥20μg/kg)显著抑制4T1细胞向肺的转移。图2b显示，与用于治疗人类乳癌的临床药物多柔比星(2mg/kg)的治疗相比，以相对较低剂量(≥20μg/kg)的Q2-3治疗具有较高的抗转移作用。最后，图2c显示Q2-3治疗也显著增加肿瘤切除小鼠的存活率。

这些结果表明，Q2-3的体内给药有效地防止了肿瘤切除术后的乳腺肿瘤转移。

骨髓抑制型细胞(MDSCs)于调节肿瘤生长的重要性已有很多的报导。例如，参见Gabrilovich等人，Nature reviews Immunology,12,253-268(2012)。MDSCs剧烈的聚集以及活化也被认为是肿瘤进展的重要病理特征，这可以在4T1肿瘤切除模型中很轻易地观察到，在肿瘤切除后3-4周于转移组织中单核细胞和颗粒细胞MDSCs的群体中可以高度的检测到。

Q2-3对活体内MDSC群体扩增的抑制作用也用于评估MDSCs的单核细胞(CD11b+Ly6C+)以及颗粒细胞(CD11b+Ly6G+)亚型。在肿瘤切除后3周，分析并比较受试小鼠肺组织中这两种MDSC细胞类型的群体。图2d显示，与PBS(载体对照)处理的小鼠相比，Q2-3处理的(10μg/kg)小鼠中其CD11b+Ly6C+以及CD11b+Ly6G+MDSC群体分别从0.9％显著降低至0.4％，以及从42.9％至12.5％。

这些结果表示Q2-3对体内乳腺肿瘤细胞具有抗转移作用。

实施例3：体内和体外Q2-3于肺纤维母细胞中上调IL-25表现的影响

进行了一项研究以评估在体内和体外条件下，Q2-3对肺纤维母细胞中上调IL-25表现的影响。

图3为体内和体外Q2-3对于肺纤维母细胞中上调IL-25表现的影响之示意图。(a)：IF染色。在肿瘤切除后21天，收集对照组(PBS中0.1％DMSO)、Q2-3处理组以及多西紫杉醇处理之小鼠其肺脏组织，并染色以显现IL-25表现细胞(IL-25-expressing cells)(红色并用箭头表示)、FSP-1(绿色)以及DAPI(蓝色)。T代表肿瘤，A代表肺泡。(b)：使用流式细胞仪检测量化Q2-3对FSP-1+ER-TR7+细胞群体变化及其对于受试小鼠肺脏中IL-25表现量的影响。使用FACS系统和DIVA软件进一步分析，圈选的FSP-1+ER-TR7+细胞中IL-25+纤维母细胞的百分比。FSP-1，纤维母细胞特异性蛋白-1(fibroblast specific protein-1)；ER-TR7，伊拉斯姆斯大学鹿特丹-胸腺网-7(Erasmus University Rotterdam-thymic reticulum-7)。(c)：构建用于乳腺肿瘤细胞和肿瘤相关纤维母细胞的3-D细胞共培养系统。(d)：以西方墨点转渍法分析小鼠IL-25于3T3纤维母细胞中的表现情形。(e)：以西方墨点转渍法分析人类IL-25于WI38纤维母细胞中的表现情形以反映于3-D培养中Q2-3的处理情形。如上所述，上层的一些纤维母细胞与乳腺肿瘤细胞共同培养。使用ImageJ软件对于3T3以及WI38纤维母细胞中IL-25的表达量进行定量以及标准化。将受测样本中IL-25表现量的折迭变化以0h(小时)组纤维母细胞的值进行标准化，并以标记蓝色的数字表示。β-肌动蛋白作为内部对照。

鉴于实施例2中描述Q2-3具有有效抗转移作用，可以假设在体内施予Q2-3时可对目标转移组织赋予调节作用。为了表征Q2-3的调节活性之于生理上的意义，进行了分析以评估受试小鼠肺组织体内几种分泌的细胞因子的表达。Q2-3处理后IL-25表现情形的变化特别明显。如图3a所示，施予Q2-3(100μg/kg)可得到一个易测得之肺纤维母细胞IL-25活性的刺激作用，其主要围绕肺主动脉以及静脉组织。在对照组以及DT-处理的小鼠肺组织中，几乎或不存在可测得之IL-25表现于肺纤维母细胞中。

该结果表示Q2-3诱导肺组织微环境中纤维母细胞于IL-25的表达，其并非常规使用的抗癌药物其药理学目标。

为量化表现IL-25的肺纤维母细胞其细胞群变化以反映Q2-3处理情形，定量受试小鼠肺组织中FSP-1+ER-TR7+的细胞群体，并比较肿瘤切除后3周其IL-25表现情形。图3b显示，与PBS(载体对照)处理的小鼠相比，在Q2-3处理的小鼠中发现IL-25+之纤维母细胞(FSP-1+ER-TR7+IL-25+细胞)细胞群从16.7％大幅上升至79.5％。此外，以Q2-3处理的小鼠，其所有FSP-1+ER-TR7+之纤维母细胞细胞群也以剂量依赖的方式从5.2％增加至7.3％。相较之下，以DT处理，平行测试作为参考的药，并没有增加受试小鼠肺中FSP-1+ER-TR7+细胞的数量以及IL-25的表现情形。有趣的是，在肺中观察到Q2-3诱导的FSP-1+IL-25+纤维母细胞群体的增加，在脾脏或其他测试组织中并未检测到(数据未显示)，表示在肺纤维母细胞内源性IL-25的表现是组织特异性的，可通过药物治疗诱导。

结果与图3所示的数据一致，并且进一步量化和支持Q2-3在体内刺激肺纤维母细胞的发现。

为了进一步研究Q2-3对肿瘤微环境中纤维母细胞的特定影响，采用三维(3-D)细胞共培养系统仿真体内乳腺肿瘤微环境。见图3C，在该系统中，将高密度的小鼠或人类乳腺癌细胞混合于含有培养基的胶原蛋白(1×10 5个细胞/20μl包含培养基的胶原蛋白溶液)中，并滴入培养基层(4个群落/孔)。1×10 6小鼠(3T3细胞)或人类(NHDF以及WI38细胞)纤维母细胞生长在3-D胶原凝胶的上层，与或不与下层的测试乳腺肿瘤细胞共同培养。通过这种人工重建方法，比较小鼠和人类纤维母细胞中IL-25的表现情形，单独或与测试乳腺肿瘤细胞共培养。此外，该3-D装置也用于研究Q2-3补充到测试培养基中的效果。观察到在Q2-3处理24小时或72小时后，小鼠(3T3)和人类(WI38)纤维母细胞中IL-25的表现增加，如图3d以及3e所示。

该结果表示，Q2-3在小鼠以及人类纤维母细胞两者中均显著上调IL-25的表现。

实施例4：经Q2-3处理所分泌的IL-25对抑制小鼠以及人类转移性乳腺肿瘤细胞生长的影响

进行了一项研究以评估经Q2-3处理所分泌的IL-25对抑制小鼠以及人类转移性乳腺肿瘤细胞生长的影响。

图4是经Q2-3处理所分泌的IL-25于抑制小鼠和人类转移性乳腺肿瘤细胞生长的作用示意图。(a)：以西方墨点转渍法分析小鼠(3T3)以及人类(WI38)纤维母细胞的IL-25分泌活性以反映Q2-3处理的情形。从3-D培养物中收集不同的纤维母细胞条件培养基(CM)，包括3T3-CM以及WI38-CM，并以考马斯蓝染色，显示测试培养基(CM)中总蛋白质标准化后的表现。将等分的3T3-CM以及WI38-CM用于IL-25的免疫消耗(immuno-depleted)。兔子IgG(同种型对照抗体)用于该免疫消耗(immunodepletion)试验中的阴性对照。以Q2-3处理的3T3-CM(蓝色)或Q2-3处理的WI38-CM样本(紫色)所检测到的值进一步与IL-25的值(相对染色强度)进行标准化。(b)：IL-25免疫消耗后3T3-CM对4T1细胞的细胞毒性降低。对照(新鲜)培养基，3T3-CM、Q2-3处理之3T3-CM、Q2-3处理之3T3-CM并伴有IL-25蛋白、Q2-3处理之3T3-CM并伴有IL-25的免疫消耗，以及Q2-3处理之3T3-CM并伴有对照IgG调节的免疫消耗，比较其对于4T1细胞生长的抑制作用。(c)：IL-25免疫消耗后，WI38-CM对MDA-MB-231的细胞毒性降低。类似地，比较WI38-CM伴有添加的IL-25蛋白、WI38-CM伴有IL-25的免疫消耗，或Q2-3处理之WI38-CM并伴有对照IgG调节的免疫消耗，其对于MDA-MB-231细胞生长的抑制作用。在培养5天后，使用MTT分析法测定4T1细胞或MDA-MB-231细胞的生长活性，并将其与对照组(仅含新鲜培养基)中的活细胞数进行标准化。误差线，±SD。n＝3.*，P<0.05，**，P<0.01，***，P<0.005(双尾Student’s t检验)。(d)：以西方墨点转渍法分析IL-17RA以及IL-17RB(IL-25R)于乳腺癌细胞株(MDA-MB-231和MCF-10A)中的表现情形。以三种设计的siRNAi处理抑制人类IL-25R(56和33kDa分子)于MDA-MB-231细胞中的表现，阴性对照(Neg)RNAi被用作非特异性对照组。(e)：以西方墨点转渍法分析MDA-MB-231细胞中caspases8以及caspases 3的裂解。以对照、Neg RNAi或IL-25R RNAi处理MDA-MB-231细胞48小时，然后每个测试组中的部分细胞再以人类重组IL-25(200ng/ml)、WI38-CM或WI38-CM伴有IL-25的免疫消耗，另外处理24小时。β-肌动蛋白作为内部对照。从三个独立实验中获得相似的结果。白色箭头，裂解的蛋白质。黑色箭头，未裂解的蛋白质。

为了表征和分析纤维母细胞所分泌的IL-25对于乳腺肿瘤细胞生长活性的可能抑制作用，收集测试小鼠以及人类纤维母细胞之条件培养基中分泌的IL-25蛋白质，并透过使用抗IL-25抗体调节的免疫沉淀方法进行比较。在免疫沉淀之前，对于以Q2-3处理之纤维母细胞的条件培养基(包括3T3纤维母细胞条件培养基(3T3-CM)以及WI38纤维母细胞条件培养基(WI38-CM))之等分样本进行IL-25的免疫消耗。在本研究中，抗兔子IgG抗体(同种型对照)用作免疫消耗的阴性对照。透过免疫墨点法分析评估各种条件培养基中IL-25的含量以及IL-25的免疫消耗效率。

图4a显示以Q2-3处理的纤维母细胞条件培养基中分泌的IL-25表现量被发现显著高于未处理的纤维母细胞培养基。重要的是，这也表示以人类以及小鼠Q2-3处理的纤维母细胞条件培养基中分泌的多数IL-25(～90％)可以透过使用抗IL-25抗体达到免疫消耗。仅有非特异性蛋白质结合的的一小部分(4～9％的降低)被检测到同种型对照抗体，显示所使用的抗IL-25抗体其高特异性以及效率。

培养自老鼠以及人类纤维母细胞之IL-25免疫消耗的条件培养基，分别用于培养4T1以及MDA-MB-231肿瘤细胞。在本研究中，新鲜的条件培养基每24小时更换持续5天。以3T3-CM培养的4T1细胞比仅用新鲜培养基培养的细胞显示出高得多的生长活性。见图4B。该结果与图4C所示之自MDA-MB-231细胞获得的结果一致。

这些结果表示，纤维母细胞可以释放供肿瘤细胞扩增的重要细胞因子与分子。此外，外源性添加的IL-25蛋白(使用100ng/ml人类以及小鼠IL-25重组蛋白)降低了受测4T1以及MDA-MB-231细胞的生长活性。一致的是，与IL-25蛋白质处理之肿瘤细胞相比，以Q2-3处理之3T3-CM(图4b)培养的4T1细胞，或以Q2-3处理之WI38-CM培养的MDA-MB-231细胞(图4c)显示相对低的细胞生长活性。相反的，IL-25的消耗减弱了以Q2-3处理之纤维母细胞培养基对于小鼠(图4b)以及人类(图4c)乳腺肿瘤细胞的生长抑制作用。此种消耗，在透过使用同种型IgG抗体下并未观察到。

这些结果表示，以Q2-3处理之纤维母细胞所分泌的IL-25，在抑制转移性乳腺肿瘤细胞的生长活性中扮演关键角色。

为了研究乳腺肿瘤细胞中纤维母细胞所分泌的IL-25蛋白质的生长抑制活性是否受到IL-25R(IL17RB)在乳腺癌细胞中的讯号传导调节，使用IL-25R特异性siRNA抑制IL-25R在转移性乳腺癌细胞(MDA-MB-231细胞)的表现。为检测三个设计的IL-25R siRNA的抑制效果，于MDA-MB-231细胞中筛选IL-25R的表现(如图4d所示)，并与在MCF-10A细胞中(一种低IL-25R表现之非恶性和ER阴性的乳腺癌细胞株)的效果作比较。阴性对照组siRNA(非靶向siRNA)之处理对于IL-25R的表达没有显著影响。在三种测试的siRNA中，以IL-25R-1siRNA处理能表现出最高的抑制效果，而在处理的MDA-MB-231细胞中表现出IL17RB亚型(isoforms)(33和56kDa)表达的最高敲低效果。此外，在IL-25RB siRNA的处理中没有导致任何可测得的IL-17RA(IL-25R异二聚体的另一个组分)表现量的变化。因此选择IL-25R-1siRNA制备用于随后的实验。

图4e显示以IL-25(100ng/ml)或Q2-3处理之WI38条件培养基(Q2-3-WI38-CM)导致MDAMB-231细胞中caspases 8以及caspases3的裂解，这表示细胞凋亡的激活。与图4C的结果一致，来自Q2-3-WI38-CM之IL-25的消耗也因caspase蛋白的裂解拯救了受测的肿瘤细胞。相比之下，以IL-25R siRNA处理的MDA-MB-231细胞中，用IL-25或Q2-3-WI38-CM处理并不能诱导caspases 8以及caspases3的裂解活性。

这些结果表示Q2-3处理的WI38纤维母细胞分泌的IL-25有效诱导IL-25R调解之细胞凋亡，导致乳腺癌细胞死亡。

实施例5：IL-25在Q2-3对于乳腺肿瘤细胞的抗转移活性中的角色

进行了一项研究以评估IL-25在Q2-3对于乳腺肿瘤细胞的抗转移活性中的角色。

图5是IL-25在Q2-3对于乳腺肿瘤细胞的抗转移活性中的角色之示意图。(a)：肿瘤切除小鼠(每组n＝8)，在肿瘤切除后3周，以PBS(0.1％DMSO于生理食盐水)、Q2-3(100μg/kg；3次注射/周)、抗小鼠鼠IL-25Ab(100μg/小鼠，2次注射/周)、Q2-3+IL-25Ab或Q2-3+同种型IgG于体内治疗后的代表性生物发光影像。照片中标注”D”表示小鼠在肿瘤切除后3周内死亡。(b)：依照所指示的时间过程(12周)，透过测量小鼠的荧光素酶活性(p/s/cm2/sr)来定量肿瘤转移情形。(c)：不同处理后受试小鼠的存活率。n.s，「Q2-3」与「Q2-3+抗IgG」组别之间无显著性差异。**，「Q2-3」与「Q2-3+抗IL-25」组别之间具有P<0.01的显著性(通过log-rank检定分析Kaplan-Meier的结果)。

为阐述IL-25表现在Q2-3于乳腺肿瘤细胞的抗转移活性中起到的关键作用，使用抗体中和方法消耗如实施例2所描述之相同4T1肿瘤切除动物模型中体内的IL-25活性。再次检测来自受试小鼠中转殖基因4T1-Luc2细胞的发光活性，小鼠以Q2-3(100μg/kg)以及抗小鼠IL-25抗体(100μg/注射/小鼠)共同处理，不同于“仅以Q2-3处理”组所检测到的抗转移效应，结果为对照(PBS)组观察到完全转移活性。

相比之下，当使用不相关的抗IgG抗体进行该抗体消耗试验时，Q2-3对抗转移的作用实际上是持续的。见图5a和5b。

这些结果表示IL-25明显在Q2-3的抗转移活性中扮演着核心角色。

图5c显示，相较于以Q2-3治疗组的小鼠相比，共同处理组(Q2-3+抗-IL-25)中的小鼠也表现出降低至与对照组(PBS)组相似水平的存活率。有趣的是，即使体内施予抗小鼠IL-25抗体也被重复发现可测得之促进4T1转移情形，相比于对照肿瘤切除的小鼠，如图5a和5b所示。

该结果表明，内源性IL-25的存在或表达在未经治疗的肿瘤切除小鼠中导致肿瘤转移的抑制作用衰弱。换句话说，Q2-3的体内抗转移作用是由内源性IL-25活性所调节的。

实施例6：评估以Q2-3以及IL-25共同处理的抗转移活性

进行了一项研究来评估以Q2-3及IL-25共同处理的小鼠之抗转移活性。

图6是以Q2-3及IL-25共同处理之抗转移活性的评估结果示意图。

(a)：以PBS(0.1％DMSO于生理食盐水)、IL-25(200ng/小鼠)、Q2-3(100μg/kg)处理，或以IL-25以及Q2-3共同处理肿瘤切除的小鼠(每组n＝8)3周。依照指定的时间过程，透过测量小鼠中p/s/cm 2/sr的荧光素酶活性来定量肿瘤转移情形。(b)：不同处理后受试小鼠的存活率。n.s，Q2-3与共同处理组之间无显著差异(过log-rank检定分析Kaplan-Meier的结果)。

研究了体内IL-25的加成效应与重迭效应的关系。发现小鼠以Q2-3(100μg/kg)及IL-25(10μg/kg)共同处理系给予类似而不是迭加的抗转移活性作用，如同仅以Q2-3处理的小鼠组别。见图6A。与未处理组的小鼠相比，共同处理组中的小鼠也显示存活率增加至与Q2-3处理组相似的水平。见图6B。换句话说，Q2-3在体内的抗转移作用可以透过外源IL-25的施予而被有效地替代。这些结果进一步支持IL-25在Q2-3的抗转移作用中扮演的关键作用。

实施例7：评估以Q2-3及多西他赛共同处理的抗转移活性

进行了一项研究以评估以Q2-3及多西他赛(DT)共同处理的小鼠之抗转移活性。

图7是以Q2-3及多西他赛共同处理之抗转移活性的评估结果示意图。(a)：在体内以PBS(0.1％DMSO于生理食盐水)、Q2-3(100μg/kg)、多西紫杉醇(5mg/kg)处理，或以多西紫杉醇与Q2-3共同处理切除原位原发性肿瘤的小鼠(每组n＝8)3周后的的MDA-MB-231肿瘤裸鼠(每组n＝8)之代表性生物发光影像。以PBS处理(对照)以及以多西紫杉醇处理之组别，一只小鼠在肿瘤切除术前3周死亡。(b)：依照指定的时间过程透过测量小鼠中p/s/cm 2/sr的荧光素酶活性来定量肿瘤转移情形。(c)：不同处理后受试小鼠的存活率。P<0.05，多西紫杉醇处理以及共同处理的小鼠之间(过log-rank检定分析Kaplan-Meier的结果)。

为了进一步评估Q2-3在与其他临床使用的抗癌药物组合使用时能否对于抑制肿瘤转移给予互补或加成治疗作用，进行了一项研究以评估Q2-3加上DT(一种常用于治疗人类乳癌的药物)对于抑制裸鼠中人类MDA-MB-231-Luc2细胞的转移活性之作用。见图7。

透过检测原位原发性乳腺肿瘤组织切除后之受试小鼠中MDA-MB-231-Luc2细胞的发光活性(图7a)，观察到以Q2-3(100μg/kg)与DT(5mg/kg)合并治疗结果显示比仅用DT治疗具有更高的抗转移活性(图7b)。一致的是，与仅接受单一治疗的那些处理相比，这种合并治疗也进一步提高了测试小鼠的存活率(图7c)。值得注意的是，在治疗转移和延长存活率方面，仅使用低剂量的Q2-3治疗已经比用DT治疗更有效；在结合DT下，Q2-3更有效，如图7b和7c所示。

这些结果表明，通过调节肿瘤相关的微环境，体内施予Q2-3对于临床抗癌药物，DT，于抑制转移性肿瘤细胞活性的治疗效果可以给予较大的互补作用。

其他实施例

本说明书中公开的所有特征可以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以被替换为具有相同、等效或类似目的的替代特征。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅仅是等效或类似特征的通用系列的示例。

从上面的描述中，本领域技术人员可以轻易地确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。例如，也可以制备在结构上类似于本发明化合物的化合物，筛选其对类鸦片受体(opioid receptor)的调节活性以及治疗类鸦片受体相关的病症。因此，其它实施例也应在此权利要求范围内。

Claims (2)

1.一种医药组合物在制备用于抑制乳癌转移的药物中的用途，其中所述的医药组合物包含一第一化合物，以及一第二化合物；

其中所述的第一化合物为多西紫杉醇；以及

其中所述的第二化合物为

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述第一化合物的剂量为5mg/kg并且所述第二化合物的剂量为100μg/kg。

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