TWI664170B - 用於抗血管生成之咖啡酸衍生物 - Google Patents

Abstract

本發明發展一種在抗血管生成中具有生物活性之一系列咖啡酸甲酯衍生物。本發明表明本發明化合物在血管內皮細胞(VEC)中經由調節VEGF/VEGFR-2及其下游信號級聯作用來抑制血管生成。

Description

用於抗血管生成之咖啡酸衍生物

本發明係關於用於治療血管生成病症之化合物、組合物及方法。特定言之，本發明係關於咖啡酸衍生物及其抗血管生成應用。

由International Agency for Research on Cancer(IARC)發佈之世界健康統計(GLOBOCAN 2008)指示癌症仍為全世界死亡之主要原因。相較於正常細胞，基因組不穩定性及高突變率之細胞特性使腫瘤細胞易於逃避(或抵抗)標準化學療法。已表明血管生成之病理性進展不僅涉及腫瘤生長以及癌細胞之癌轉移，因此其已變成癌症靶向療法之潛在靶標及治療策略。因此，由於血管內皮細胞(VEC)在腫瘤誘發之血管生成中起關鍵作用，已提出其作為應用於癌症療法上之候選治療靶標。

已表明，為存在於許多日常天然食品中之大量植物化學物質之咖啡酸顯示許多有益生物活性，諸如抗發炎性及抗病毒作用以及抗氧化性(Touaibia,M.,Jean-Francois,J.,Doiron,J.,2011.Caffeic Acid,a versatile pharmacophore：an overview.Mini-Rev.Med.Chem.11,695-713)。然而，咖啡酸酯在空氣中易於氧化且可微溶於水。此等限制使其難以作為醫學藥物來應用。因此，愈來愈多的研究人員關注咖啡酸酯衍生物以探究其可能的生物活性作用及機制。為咖啡酸酯之穩定鈉鹽之咖啡酸鈉為經報導經由活化細胞凋亡之固有路徑具有抗腫瘤作用 的第一咖啡酸酯衍生物(Xu,F.,Zhang,S.H.,Shao,R.G.,Zhen,Y.S.,2005.Anticancer activity of sodium caffeate and its mechanism.Acta Pharmacol.Sin.26,1248-1252)。此外，報導了其藉由誘發內皮細胞中之生長抑制及細胞凋亡之抗血管生成作用(Xu,F.,Ou-Yang,Z.G.,Zhang,S.H.,Song,D.Q.,Shao,R.G.,Zhen,Y.S.,2006.Sodium caffeate induces endothelial cell apoptosis and inhibits VEGF expression in cancer cells.Yao Xue Xue Bao.41,572-576)。已提及，為咖啡酸之天然存在之酯的咖啡酸甲酯及其氧化衍生物在抗癌活性中比咖啡酸鈉有效(Bailly,F.,Toillon,R.A.,Tomavo,O.,Jouy,N.,Hondermarck,H.,Cotelle,P.,2013.Antiproliferative and apoptotic effects of the oxidative dimerization product of methyl caffeate on human breast cancer cells.Bioorg.Med.Chem.Lett.23,574-578)。US 20020188021提供一種在有需要個體體內增強放射療法之方法，其包含以有效增強個體之放射療法之量向個體投與諸如咖啡酸苯乙基酯(CAPE)或其類似物之增強劑。US 20070232668提供呈現作為Jak2/STAT3路徑及下游靶標之抑制劑效能且抑制癌細胞株生長及存活的化合物。US 20100010002係關於咖啡酸或衍生物或其鹽在對用GLEEVEC(格列衛(Glivec)、甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate)或STI571)治療具有抵抗性之慢性骨髓性白血病(CML)之治療中，或其用於減少對GLEEVEC具有抵抗性之細胞生長或增殖中之用途。US 20110275577提供咖啡酸類似化合物及組合物及其作為用於治療皮膚病、婦科及生殖疾病之藥劑的應用，諸如發炎性皮膚病病狀、發育不良、瘤形成、原位癌瘤、侵入性癌瘤、硬化性苔癬、扁平苔癬、陰道發育不良、陰道癌、外陰發育不良、外陰癌、頸發育不良、頸癌瘤及卡堡氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)。

然而，仍需要用於治療增生性病症之經改良咖啡酸衍生物及方法。

本發明提供一種具有下式(I)或式(II)之化合物， 其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅及R₆如本文中所描述定義。

本發明亦提供一種包含本發明化合物之組合物。

本發明亦提供一種用於治療與過度血管生成及/或異常血管生成相關之病症及疾病之方法，其包含向個體投與本發明化合物。在某一實施例中，血管生成病症包括(但不限於)癌症、糖尿病性視網膜病變、缺血性視網膜靜脈閉塞，及早產兒視網膜病、年齡相關之黃斑變性(AMD)、新生血管性青光眼、銀屑病、晶狀體後纖維組織增生、血管纖維瘤、炎症、類風濕性關節炎(RA)、再狹窄、支架內再狹窄、血管移植再狹窄等。

圖1A及圖1B展示K20E對腫瘤生長及血管生成之抑制活性。應用攜腫瘤之小鼠模型(A)及基質膠栓塞分析(Matrigel plug assay)(B)以分別評估K20E在抗腫瘤及抗血管生成中之活體內活性。與對照組相比，分別*P<0.05及**P<0.01。與僅用VEGF處理之組相比，‡P<0.01。

圖2A至圖2E展示K20E之生長抑制。藉由使用流式細胞儀分析經若干濃度K20E處理之細胞之細胞週期。與對照組(僅用5% FBS處理)相比，分別*P<0.05及**P<0.01。

圖3A及圖3B展示K20E對HUVEC遷移及侵入之抑制。藉由分別使 用傳斯維爾遷移分析(Transwell migration assay)(A)及基質膠侵入分析(B)檢驗用K20E處理之HUVEC之細胞遷移及侵入。在40倍放大率之顯微法下捕獲影像(上圖)，且經捕獲影像之統計結果展示為柱狀圖(下圖)。與對照組(僅用5% FBS處理)相比，**P<0.01。

圖4展示K20E對形成HUVEC之管狀網路之調節。在40倍放大率之顯微法下捕獲影像(上圖)，且經捕獲影像之統計結果呈現為柱狀圖(下圖)。與對照組(僅用5% FBS處理)相比，**P<0.01。

圖5A及圖5B展示K20E對LLC1癌細胞中之VEGF表現的抑制調節。藉由分別使用免疫墨點及ELISA分析偵測胞內VEGF及分泌性VEGF蛋白質水準。與對照組(僅用10% FBS處理)相比，*P<0.05。

圖6A至圖6D展示K20E對HUVEC細胞中VEGFR-2及VEGFR-2介導之信號級聯之蛋白質水準的抑制調節。藉由使用免疫墨點偵測VEGFR-2(A)、ERK1/2-MAPK級聯(B)、AKT-mTOR路徑(C)及明膠酶(D，左圖)之表現水準。藉由使用明膠酶譜法評估明膠酶活性(D，右圖)。與對照組(僅用5% FBS處理)相比，分別*P<0.05及**P<0.01。

圖7展示K20E對HUVEC中之p53及p21蛋白質之蛋白質水準的影響。藉由使用免疫墨點檢驗蛋白質表現。與對照組(僅用5% FBS處理)相比，*P<0.05。

本發明開發在抗血管生成中具有生物活性之一系列咖啡酸甲酯衍生物。本發明表明本發明化合物在血管內皮細胞(VEC)中經由調節VEGF/VEGFR-2及其下游信號級聯支配抑制血管生成。

在本文中未特定定義之術語應由熟習此項技術者根據本發明及上下文來賦予其應具有之含義。然而，如本說明書中所使用，除非相反規定，否則以下術語具有指示之含義且將遵守以下約定。

術語「一(a/an)」係指一或多種。

如本文中所使用，除上下文另外要求外，術語「包含(comprise)」及該術語之變化形式，諸如「包含(comprising/comprises/)」及「所包含(comprised)」不意欲排除其他添加劑、組分、整數或步驟。

如本文中所使用，術語「個體」在本文中定義包括動物，諸如哺乳動物，包含(但不限於)靈長類(例如人類)、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、家兔、大鼠、小鼠及其類似動物。在特定實施例中，個體為人類。術語「個體」及「患者」在本文中提及例如哺乳動物個體(諸如人類)時可互換使用。

如本文中所使用，術語「治療(treat/treating/treatment)」係指疾病或病症之根除或改善，或與疾病或病症相關之一或多種症狀之根除或改善。在某些實施例中，該等術語係指因向患有疾病或病症之個體投與一或多種預防劑或治療劑而使得此類疾病或病症的擴散或惡化降至最低。在一些實施例中，該等術語係指在特定疾病症狀之診斷或發作後投與含或不含一或多種額外活性劑之本文中所提供之化合物或劑型。

如本文中所使用，術語「預防(prevent/preventing/prevention)」係指對疾病或病症或其一或多種症狀之發作、復發、或擴散的預防。在某些實施例中，該等術語係指在症狀發作之前，用含或不含一或多種額外活性劑之本文中所提供之化合物或抗體或劑型治療或投與上述化合物或抗體或劑型，尤其對處於本文中所提供之疾病或病症風險下的患者。該等術語涵蓋抑制或減少特定疾病之症狀。在此方面，術語「預防(prevention)」可與術語「預防性治療」互換使用。

除非另有指示，否則如本文中所使用，術語「共投與」及「結合」包括在無特定時間限制內同步、並行或循序投與兩種或兩種以上治療劑。在一個實施例中，該等治療劑具有相同組成或單位劑型。在 其他實施例中，該等治療劑具有獨立組成或單位劑型。

如本文中所使用，術語「有效量」為當向個體投與化合物時達成有益結果之化合物的量或者具有活體內或活體外所需活性之化合物的量。在發炎性病症及免疫病症之情況下，有益的臨床結果包括與疾病或病症相關之症狀程度或嚴重度之減小及/或與缺乏治療相比較個體壽命及/或生活品質之提高。向個體投與化合物之精確量將視疾病或病狀之類型及嚴重度而定，且視個體特徵而定，諸如大體健康、年齡、性別、體重及對藥物之耐受。其將亦視發炎性病症之程度、嚴重度及類型而定。熟習此項技術者將能視該等及其他因素而確定適當劑量。

如本文中所使用，術語「烷基」意謂通常具有1至6個碳原子之飽和直鏈或分支鏈非環烴。代表性飽和直鏈烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基及正己基；而飽和分支鏈烷基包括異丙基、第二丁基、異丁基、第三丁基、異戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等，及其類似基團。包括於本發明化合物中之烷基可視情況經一或多個取代基取代，諸如胺基、烷胺基、烷氧基、烷硫基、側氧基、鹵基、醯基、硝基、羥基、氰基、芳基、烷芳基、芳氧基、芳硫基、芳胺基、碳環基、碳環基氧基、碳環基硫基、碳環基胺基、雜環基、雜環基氧基、雜環基胺基、雜環基硫基及其類似基團。另外，烷基段中之任一碳可經氧、硫或氮取代。

如本文中所使用之術語「烷氧基」係指經由氧原子鍵聯至另一部分之烷基。烷氧基可經取代或未經取代。

如本文中所使用，術語「烯基」意謂通常具有2至10個碳原子且具有至少一個碳-碳雙鍵之直鏈或分支鏈烴基。代表性直鏈及分支鏈烯基包括乙烯基、烯丙基、1-丁烯基、2-丁烯基、異丁烯基、1-戊烯 基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、1-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、1-癸烯基、2-癸烯基、3-癸烯基及其類似基團。烯基可經取代或未經取代。

如本文中所使用，術語「炔基」意謂通常具有2至10個碳原子且具有至少一個碳-碳參鍵之直鏈或分支鏈烴基。代表性直鏈及分支鏈炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、5-己炔基、1-庚炔基、2-庚炔基、6-庚炔基、1-辛炔基、2-辛炔基、7-辛炔基、1-壬炔基、2-壬炔基、8-壬炔基、1-癸炔基、2-癸炔基、9-癸炔基及類似基團。炔基可經取代或未經取代。

如本文中所使用，術語「烷氧基」係指經由氧連接至母體分子結構之直鏈、分支鏈、環狀組態及其組合之基團--O-烷基(在一些實施例中，包括1至10個碳原子)。實例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、環丙氧基、環己氧基及其類似基團。「低碳烷氧基」係指含有1至6個碳之烷氧基。在一些實施例中，C₁-C₄烷氧基為涵蓋1至4個碳原子之直鏈與分支鏈烷氧基。除非在本說明書中另有說明，否則烷氧基視情況經一或多個取代基取代。術語「烯氧基」及「炔氧基」反映「烷氧基」之以上描述，其中前綴「烷(alk)」分別經「烯(alken)」或「炔(alkyn)」置換，且母體「烯基」或「炔基」術語如本文中所描述。

如本文中所使用之術語「取代」意謂指定原子、基團或部分體上之任何一或多個氫經選自所指示之群組中的基團置換，其限制條件為不可超過該原子之正常價數，且該取代法應產生可接受之穩定化合物。

本文中所使用之短語「醫藥學上可接受之」係指彼等在合理醫學判斷之範疇內適於接觸人類及動物組織而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，且具有合理效益/風險比值之化合物、物質、組合物及/或劑型。

如本文中所使用之「醫藥學上可接受之鹽」係指所揭示化合物之衍生物，其中母體化合物藉由製成其酸性鹽或鹼性鹽而改質。醫藥學上可接受之鹽之實例包括(但不限於)鹼性殘基(諸如胺)之無機酸鹽或有機酸鹽；酸性殘基(諸如羧酸)之鹼金屬鹽或有機鹽；及其類似物。

如本文中所使用，術語「立體異構體」為針對個別分子之所有異構體的通用術語，該等異構體僅在其原子空間定向上不同。其包括對映異構體及具有一個以上對掌性中心的彼此不為鏡像的化合物異構體(非對映異構體)。

術語「對掌性中心」係指與四個不同基團連接之碳原子。

術語「對映異構體」及「對映異構之」係指無法疊加於其鏡像上且從而為光學活性之分子，其中對映異構體使偏光平面在一個方向上旋轉且其鏡像化合物使偏光平面在相對方向上旋轉。

術語「外消旋」係指具有相等份對映異構體之混合物且該混合物為光學非活性的。

在一個態樣中，本發明提供一種具有下式(I)或式(II)之化合物， 其中 X為O、N或S；R₁為C_1-10烷基、C_2-10烯基或C_2-10炔基，其未經取代或經鹵素、NH₂、NO₂、CN、OH、-CHO、C(O)₂C_1-10烷基、C(O)₂C_1-10烯基或C(O)₂C_1-10炔基取代；R₂為C_1-10烷氧基、C_2-10烯氧基、C_2-10炔氧基、-O-乙醯基、羥基、甲醯基、鹵離子、CN、NO₂、SH、NH₂、醯胺基、磺醯基或磺醯胺基；R₃為C_1-10烷基、C_2-10烯基、C_2-10炔基、C(O)₂C_1-10烷基、C(O)₂C_1-10烯基或C(O)₂C_1-10炔基；R₄為C_1-10烷氧基、C_2-10烯氧基、C_2-10炔氧基、-O-乙醯基、羥基、甲醯基、鹵離子、CN、NO₂、SH、NH₂、醯胺基、磺醯基或磺醯胺基；R₅為OH、C_1-10烷氧基、C_2-10烯氧基、C_2-10炔氧基、-O-乙醯基、羥基、甲醯基、鹵離子、CN、NO₂、SH、NH₂、醯胺基、磺醯基或磺醯胺基；且R₆為H、鹵素、OH、NH₂、CN或NO₂；或其立體異構體，或其對映異構體，或其前藥或其醫藥學上可接受之鹽。

在一個實施例中，R₁為未經取代或經OH、CHO或C(O)₂C_1-4烷基取代之C_1-4烷基或C_1-4烯基。在一個實施例中，R₂為C_1-4烷氧基或-O-乙醯基。在一個實施例中，R₃為C_1-4烷基或C(O)₂C_1-4烷基。在一個實施例中，R₄為C_1-4烷氧基或-O-乙醯基。在一個實施例中，R₅為OH或-O-乙醯基。在一個實施例中，R₆為H。

在一些實施例中，R₁為-CH₂CH₂CH₂OH或-CH=CHCHO或-CH=CHC(O)₂CH₃；R₂為-OCH₃或-O-C(O)CH₃；R₃為-CH₃或-C(O)₂CH₃；R₄為-OCH₃或-O-C(O)CH₃；R₅為OH或-O-C(O)CH₃；且R₆ 為H。

在一些實施例中，本發明化合物係選自由以下組成之群： 或其立體異構體，或其對映異構體，或其前藥或其醫藥學上可接受之鹽。

本文中所描述之化學實體及中間物之分離及純化必要時可藉由任何適合分離或純化程序來實現，該等程序諸如為過濾、萃取、結晶、管柱層析、薄層層析或厚層層析或此等程序之組合。適合分離及分離程序之特定說明參考本文中以下實例而給出。然而，亦可使用其他等效分離程序。

當所需時，非限制性例示性化合物之(R)-異構體及(S)-異構體(若存在)可藉由熟習此項技術者已知之方法溶解，例如藉由(例如藉由結晶)形成可經分離之非對映異構鹽或錯合物；經由(例如藉由結晶、氣液層析或液相層析)形成可經分離之非對映異構衍生物；使一種對映異構體與對映異構體-特異性反應劑選擇性反應，例如酶促氧化或酶促還原，隨後分離經修飾之對映異構體與未經修飾之對映異構體；或在對掌性環境(例如於對掌性支架上，諸如具有結合對掌性配位體或以對掌性溶劑存在之二氧化矽)中之氣液層析或液相層析。或者，特定對映異構體可使用光學活性反應劑、基質、催化劑或溶劑藉由不對稱合成或藉由不對稱轉換將一個對映異構體轉換至另一對映異構體來合成。另外，本文中所提供之化合物之滯轉異構體(亦即圍繞單鍵受阻旋轉之立體異構體)可藉由熟習此項技術者已知之方法溶解或分離。

本文中所描述之化合物可視情況與醫藥學上可接受之酸接觸以形成相對應的酸加成鹽。再者，本文中所描述之化合物可視情況與醫藥學上可接受之鹼接觸以形成相對應的鹼加成鹽。

在一些實施例中，本文中所提供之化合物可通常藉由通常熟知合成方法之適合組合合成。基於本發明，用於合成此等化學實體之技術對熟習相關技術者而言均易於清楚且易懂。許多視情況經取代之起始化合物及其他反應物例如自Aldrich Chemical Company(Milwaukee,Wis.)市售可得，或可易於由熟習此項技術者使用通常採用之合成方法製備。

提供以下論述以說明可用於製造以下代表性化合物之某些方法，且不意欲限制可用於製備本文中提供之化合物的反應或反應程序之範疇。以可藉由根據常識及常用技術修改以下方案來理解之類似方式製備除代表性化合物以外之化合物。

在另一態樣中，本發明提供一種包含本文中所提供之化合物或立體異構體、互變異構體、鹽或前藥之組合物。組合物可用於例如本文中所描述之使用方法。

在另一態樣中，本發明提供一種用於治療與過度血管生成及/或異常血管生成相關之病症及疾病之方法，其包含向個體投與本發明化合物。血管生成之不當及異位表現可對有機體有害。大量病理學病狀與額外血管之生長有關。出於治療癌症及血管生成病症之目的，開發本發明以抑制血管生成信號傳遞。血管生成病症包括(但不限於)癌症、糖尿病性視網膜病變、缺血性視網膜靜脈閉塞，及早產兒視網膜病、年齡相關之黃斑變性(AMD)、新生血管性青光眼、銀屑病、晶狀體後纖維組織增生、血管纖維瘤、炎症、類風濕性關節炎(RA)、再狹窄、支架內再狹窄、血管移植再狹窄等。另外，與癌組織及贅生性組織相關之血液供應增加促進生長，導致快速腫瘤增大及癌轉移。此 外，腫瘤中新血管及淋巴管的生長向反叛細胞提供逃脫途徑，從而促進癌症之轉移及由此引起的擴散。因此，可使用本發明之化合物例如藉由抑制及/或減少血管形成；藉由使內皮細胞增生或涉及血管生成之其他類型細胞增生得以抑制、阻斷、減少、降低等，以及促使該等細胞類型之細胞死亡或細胞凋亡來治療及/或預防任何前述血管生成病症。較佳地，血管生成病症為癌症；更佳地，該癌症為轉移性癌症；更佳地，該癌症為膀胱癌、血癌、骨癌、骨髓癌、腦癌、乳癌、結腸癌、食道癌、眼癌、胃腸道癌、牙齦癌、頭癌、腎癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、頸癌、卵巢癌、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、睾丸癌、舌癌、眼癌(諸如眼黑色素瘤)或子宮癌。

在一個實施例中，本發明方法進一步包含投藥第二抗癌療法。較佳地，第二抗癌療法為化學療法、手術療法、免疫療法或放射療法。

在某些實施例中，組合物為醫藥組合物或單一單位劑型。醫藥組合物及單一單位劑型包含治療有效量之本發明化合物及視情況通常一或多種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑或稀釋劑。本文中所描述之載劑及賦形劑僅為例示性的，且不以任何方式限制。適合之載劑或賦形劑為熟習藥劑學技術者所熟知，且適合賦形劑之非限制性實例包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、水稻、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、乾燥脫脂牛奶、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇及其類似物。特定賦形劑是否適用於併入醫藥組合物或劑型中視此項技術中所熟知之多種因素而定，該多種因素包含(但不限於)劑型將向患者投與之方式及劑型中之特定活性成分。組合物或單一單位劑型必要時亦可含有少量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩衝劑。

通常可使用實驗模型及/或臨床試驗確定最佳劑量。最佳劑量可 視個體之身體質量、體重或血容量而定。一般而言，以劑量形式存在之本文中所描述之化合物的量介於每公斤體重約0.1mg至約10mg；較佳為約0.5mg/kg至約10mg/kg、約0.5mg/kg至約8mg/kg、約0.5mg/kg至約6mg/kg、約0.5mg/kg至約5mg/kg、約1mg/kg至約10mg/kg、約1mg/kg至約8mg/kg、約1mg/kg至約6mg/kg、約1mg/kg至約5mg/kg或約1mg/kg至約3mg/kg之範圍內。一般可使用適於所治療或預防之病狀的分析監測個體之療效，該等分析將為一般熟習此項技術者所熟悉且在本文中經描述。

包含本文中所描述之化合物的組合物之劑量可視個體病狀(亦即為熟習醫學技術者清楚的疾病階段)、功能、所引起症狀之嚴重度、大體健康狀況，以及年齡、性別及重量，及其他因素而定。同樣，可根據由熟習醫學技術者所理解之參數確定用於治療疾病或病症之化合物劑量。因此，適合之劑量可視個體病狀(亦即由熟習醫學技術者所考慮的疾病階段)、大體健康狀況，以及年齡、性別及重量，及其他因素而定。

醫藥組合物可為無菌水性或非水性溶液、懸浮液或乳液，其另外包含生理學上可接受之賦形劑(醫藥學上可接受或合適之賦形劑或載劑)(亦即，不干擾活性成分活性之無毒物質)。此等組合物可呈固體、液體或氣體(氣霧劑)之形式。或者，本文中所描述之組合物可調配為凍乾物，或可使用此項技術中已知技術將化合物囊封於脂質體內。醫藥組合物亦可含有其他組分，其可具有生物活性或不具有生物活性。此等組分包括(但不限於)緩衝液(例如，中性緩衝生理鹽水或磷酸鹽緩衝生理鹽水)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露糖醇、蛋白質、多肽或胺基酸(諸如甘胺酸)、抗氧化劑、螯合劑(諸如EDTA或麩胱甘肽)、穩定劑、染料、調味劑及懸浮劑及/或防腐劑。

組合物亦可調配為丸劑、膠囊、顆粒或錠劑，除本發明化合物之外，該等組合物亦含有稀釋劑、分散劑及表面活性劑、黏合劑及潤滑劑。熟習此項技術者可進一步以適合之方式及根據接受之實踐調配本發明化合物，諸如Remington's Pharmaceutical Sciences,Gennaro編，Mack Publishing Co.,Easton,Pa.1990中所揭示之彼等實踐。

可以如由熟習醫學技術者確定之適於待治療之疾病或病症的方式投與醫藥組合物。投與之適當劑量以及合適持續時間及頻率將由諸如以下因素決定：患者之病狀、患者疾病之類型及嚴重度、活性成分之特定形式及投藥方法。一般而言，適合之劑量(或有效劑量)及治療方案提供包含呈足以提供治療及/或防治性益處(例如，改良之臨床結果，諸如愈加頻繁之完全或部分緩解，或無疾病及/或整體存活期延長，或症狀嚴重度之減輕或如本文中所描述之其他益處)之量的如本文中所描述之化合物之組合物。

包含本發明化合物之本文中所描述之醫藥組合物可需要藉由有效傳遞有效量之化合物之任一若干途徑向個體投與。該等投藥途徑包括例如局部、口腔、鼻、鞘內、直腸、陰道、眼內、結膜下、舌下或非經腸投藥(包括皮下、靜脈內、肌內、胸骨內、陰莖海綿體內、耳道內或尿道內注射或灌注)。

本發明化合物在同種異體移植腫瘤模型中抑制腫瘤生長且顯示抗血管生成活性。此外，此等化合物顯著減少G2/M期下之細胞週期之停滯且誘發細胞凋亡。亦藉由此等化合物顯著抑制細胞遷移、侵入及管形成。另外，其大大下調癌細胞中胞內及分泌性血管內皮生長因子(VEGF)。此外，VEGF受體-2(VEGFR-2)及其下游信號級聯(AKT-mTOR及MEK1/2-ERK1/2)以及明膠酶在經本發明化合物處理之癌細胞中皆明顯減少。相反地，此等化合物可上調癌細胞中p53及p21蛋白質之表現水準。

實例 物質及方法 化學物質

針對VEGFR-2(#9698)、磷酸-MEK1/2(#9121)、磷酸-ERK1/2(#4370 s)、ERK1/2(#9102)、磷酸-AKT(#4060)、AKT(#9272)、磷酸-mTOR(#2971)、mTOR(#2972)及MMP-2(#9272)之初級抗體購自Cell signaling Technology(Beverly,MA,USA)。抗MMP-9(#ab38898)及抗p21(#ab7960)抗體及咖啡酸甲酯(#ab142321)自Abeam(Cambridge,MA,USA)獲得。用於偵測MEK1/2(#sc-6250)、VEGF(#sc-7269)及β-肌動蛋白-(#sc-47778)之初級抗體購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA,USA)。用於偵測p53(#GTX 100446)之初級抗體購自GeneTex Inc.(Irvine,CA,USA)。所有未提及之其他反應劑亦購自Sigma-Aldrich(Louis,MO,USA)。

細胞培養

人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC；#8000)購自ScienCell Research Laboratories(San Diego,CA,USA)。將細胞接種於經明膠塗佈之培養皿上，且使其在含有5%胎牛血清(FBS；#0025；ScienCell)、30μg/mL內皮細胞生長補充劑(ECGS；#1052；ScienCell)、100單位/毫升青黴素G及100μg/mL硫酸鏈黴素(#0503；ScienCell)之內皮細胞培養基商品(#1001；ScienCell)中生長。繼代3-6細胞用於實驗。小鼠Lewis肺癌瘤細胞株1(LLC1；#60050)購自Food Industry Research and Development Institute(Hsinchu,Taiwan)，且在補充有10% FBS(HyClone,Logan,UT,USA)、4mM L-麩醯胺酸、1.5g/L碳酸氫鈉、100單位/毫升青黴素G及100μg/mL鏈黴素之Gibco®杜爾貝科氏改質伊格爾培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium)(#12800-017；Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中經培養。在37℃下在含濕氣5% CO₂ 氛圍中培育所有細胞，且每2-3天更換培養基。

細胞活力分析(MIT分析)

在較小修改之情況下，根據前述研究進行實驗(Pan等人，2010)。簡言之，接種細胞(2×104細胞/孔)且使其在正常培養基下生長24h。在0.5% FBS之情況下饑餓另24h後，用若干濃度(1、2、4、8及16μM)之測試化合物處理細胞24h，接著用5mg/mL MTT溴化(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑)培育2h。此後，用1×PBS洗滌細胞，接著將二甲亞碸(DMSO)添加至各孔。使用650nm作為參考波長在570nm處測定各孔之吸光度值。對照組(僅用5%或10% FBS處理)之吸光度定義為100%。

攜Lewis肺癌瘤之小鼠模型

根據吾等過去研究報告之方法，在經過些微修改下，進行實驗設計及程序(Liu等人，2013)。簡言之，雄性C57BL/6小鼠(平均8週齡)購自BioLASCO(Taipei,Taiwan)，且在12h光照/黑暗週期中在自由攝取食物及水之情況下圈養。所有動物護理遵循China Medical University(Taichung,Taiwan)之機構動物倫理指南。適應1週後，將小鼠隨機分成三組(n=6/組)：組1(對照組；用標準生理鹽水處理)，組2(每天使用4mg/kg體重K20E處理)，及組3(每天使用8mg/kg體重K20E處理)。首先，將LLC1肺癌細胞(100μL總體積中6×10⁵個細胞)經皮下注入小鼠背部皮膚中以誘發肺癌瘤異種移植。兩週後，攜腫瘤之小鼠根據實驗設計(標準生理鹽水或具有不同劑量之K20E)藉由一天一次腹膜內注射開始接受治療兩週。在研究結束時，收集腫瘤塊供照相且稱重。

基質膠栓塞分析

將雄性C57BL/6(平均6週齡)小鼠隨機分成4組(n=3/組)：組1(對照組；注射500μL冷基質膠[#356237；BD Biosciences])，組2(注射含 有100ng/ml VEGF及100U/mL肝素之500μL冷基質膠)，組3(注射溶解於含有100ng/ml VEGF及100U/mL肝素之500μL冷基質膠中之4μM K20E)，及組4(注射溶解於含有100ng/ml VEGF及100U/mL肝素之500μL冷基質膠中之8μM K20E)。適應1週後，將小鼠麻醉且將上述預先製備之冷基質凝膠經皮下注入左腹股溝區域中，以在正常體溫下形成果凍狀之栓塞。將會藉由基質膠栓塞所釋放之VEGF引誘血管內皮細胞，在基質膠栓塞內形成新脈管，該過程將受添加於基質膠栓塞中之抗血管生成物質抑制。7天後，處死小鼠且回收基質膠栓塞且拍照。所收穫之基質膠栓塞在1×磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中進一步均質化，接著在4℃下，在10000×g下離心10min。根據製造商之說明書，使用德拉布坎反應劑(Drabkin's Reagent)(#D5941；Sigma-Aldrich,Louis,MO,USA)檢驗經均質化基質膠栓塞之上清液中之血紅素含量。含於紅血球中之血紅素應僅存在於具有良好功能及結構之脈管中，因此血紅素含量可視為基質膠栓塞內脈管形成之指標。

細胞週期分析

根據過去報告，在些微修改下進行實驗(Pan等人，2010)。簡言之，將HUVEC(5×10⁵細胞/孔)接種於6孔培養盤上，且在24h之K20E(0.5、1及2μM)處理後收穫。收穫細胞用70%冰冷乙醇固定隔夜。將細胞集結粒離心(1500rpm，5min，4℃)，接著使其再懸浮於含有4μg/mL碘化丙錠、1% Triton X-100及0.5mg/mL RNA酶A之500μL DNA染色緩衝液中。黑暗中在37℃(水浴)下培育30min後，藉由分別使用FACSCanto流式細胞儀(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)及ModFit LT程式(Verify Software House,Topsham,ME,USA)偵測並分析細胞週期階段分佈。

細胞遷移及侵入分析

為了評估細胞遷移，將懸浮於無血清培養基內之HUVEC(1× 10⁵細胞/孔)接種於置放於下部腔室(24孔培養盤之孔)中之上部腔室(具有8μM微孔尺寸之ThinCerts^TM細胞培養插入物；#662638；Greiner Bio-One Inc.,Monroe,NC,USA)的內表面上。為了檢驗細胞侵入，將HUVEC與相等體積之解凍基質膠預混合且快速接種於上部腔室上。細胞附著2h後，將不同濃度(0.5、1及2μM)之K20E添加於上部腔室及下部腔室中，同時5% FBS作為化學引誘劑添加於下部腔室中以促進細胞遷移或侵入。培育16h後，將培養基(或基質膠)自上部腔室內部乾脆利落地移除，且在室溫下將附著於上部腔室外表面上之遷移細胞或侵入細胞用10%甲醛固定10min。經固定細胞隨後用蘇木素對比染色。藉由使用40倍放大率之光照顯微法自5個隨機區域計數各組之相對細胞數目。對照組(僅用5% FBS處理)之細胞數目定義為100%。

管形成分析

如過去報告所述進行實驗(Pan等人，2010)。將HUVEC(1×10⁴細胞/孔)接種於96孔盤之經基質凝膠塗佈之孔上，接著用各種濃度(0.5、1及2μM)K20E培育8h。此後，藉由在40倍放大率下之光照顯微法觀測類似毛細管之管形成，且量測毛細管網狀物之管長以評估K20E之抗血管生成作用。對照組(僅用5% FBS處理)之管長定義為100%。

西方墨點法

如過去報告所述進行實驗(Pan等人，2010)。簡言之，將細胞(5×10⁵細胞/孔)接種於6孔培養盤上，且在正常培養條件下用不同濃度(0.5、1及2μM)K20E培育15min或24h以分別偵測磷酸化蛋白質及總蛋白質之表現水準。收穫經處理細胞且藉由使用PROPREP®蛋白質萃取溶液(#17081；iNtRON Biotechnology,Gyeonggi-Do,South Korea)溶解。將細胞溶解物在13000×g下在4℃下進一步離心10min以收集 上清液用於十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。根據製造商說明書，藉由Bio-Rad蛋白質分析試劑套組(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)量測蛋白質濃度。使用10%厚塊SDS-PAGE凝膠使含有30μg蛋白質之等分試樣電泳，接著將其轉移至PVDF膜(Immobilon-P^TM Millipore,Bedford,MA,USA)。藉由5%(w/v)脫脂牛奶在室溫下阻斷非特異性結合位點1h後，用初級抗體(1：1,000稀釋)，隨後為辣根過氧化酶共軛二級抗體(1：2,000稀釋)培育膜。藉由使用Amersham ECL Plus^TM西方墨點法偵測試劑(GE Healthcare Bio-Sciences,Bucks,UK)觀測基質。藉由Fujifilm LAS-4000系統(San Leandro,CA,USA)獲取發光信號且藉由使用MultiGauge軟體(v3.0；Fujifilm)定量。將各實驗之結果歸一化成β-肌動蛋白之條帶密度。根據對照組(僅用5%或10% FBS處理)值作為100%計算相對蛋白質表現。

定量培養基中VEGF水準

將LLC1癌細胞(5×10⁵細胞/孔)接種於6孔培養盤上，接著用以1mL培養基之總體積計各種濃度(0.5、1、2及4μM)K20E培育24h。此後，收穫培養基以根據製造商說明書(Bio-Connect Diagnostics,Huissen,Netherlands)藉由ELISA試劑套組(#SEA143Mu)量測VEGF水準。

明膠酶譜法

在較小修改之情況下，根據前述研究之程序進行實驗(Chen等人，2012)。簡言之，將細胞(5×10⁵細胞/孔)接種於6孔培養盤上，且用若干濃度(0.5、1及2μM)K20E在正常培養條件下培育24h。此後，收集培養基且在4℃下在12000rpm下離心10min。將上清液(32μL)與8μL 5x非還原加樣緩衝液(12.5%溴酚藍、10% SDS、0.5M Tris-HCl pH=6.8及50%甘油)混合，接著使其溶解於具有0.1%明膠之8%厚塊SDS-PAGE凝膠中。電泳後，由2.5% Triton X-100洗滌凝膠10min三次，接 著在37℃下用顯影緩衝液(0.01% NaN₃、10mM CaCl₂及40mMTris-HCl pH=8.0)培育額外24h。此後，在室溫下用染色溶液(0.125%考馬斯藍(coomassie blue)R-250、50%甲醇及10%乙酸)染色凝膠1h，接著用去染緩衝液(40%甲醇及10%乙酸)脫色直至可見經明膠酶浸漬之條帶。藉由使用Multi Gauge軟體定量經浸漬條帶之強度。根據對照組(僅用5% FBS處理)值作為100%計算相對明膠酶活性。

資料分析

所有資料呈現為平均值±標準差(S.D)實驗重複三次。藉由單因子ANOVA評估統計顯著性。Pb 0.05之值視為在統計上顯著。

製備實例 實例1合成及識別K20

在室溫(RT)下將異丁香酚(10g於100mL二氯甲烷中)溶液以液滴形式添加至二乙酸碘苯(IDA；10g)於100mL二氯甲烷(用CaH₂乾燥)中之溶液中4h。48h後，將NaHCO₃(3g)添加至溶液中且攪拌1h。過濾混合物且在減壓下蒸發濾液，得到中間物1。將中間物1(1.12g)及二氯二氰基-苯醌(DDQ；3.24g)溶解於50mL 1,4-二噁烷中。接著使溶液回流。48h後，過濾溶液且在減壓下蒸發濾液，得到中間物2。在H₂下在室溫下攪拌具有10% PtO₂(96.3mg於H₂O中)之中間物2(1.33g於20mL CH₃OH中)之溶液。6h後，過濾混合物且在減壓下蒸發濾液，得到中間物3。使具有SeO₂(0.42g)之中間物3(0.64g於20mL乙醇中)之溶液回流。12h後，在減壓下蒸發混合物，接著添加30mL乙酸乙酯(EtOAc)。藉由矽藻土過濾混合物且在減壓下蒸發濾液。接著藉由用EtOAc/己烷(1：5)溶離之矽膠管柱層析(Silica凝膠60，Merck 70-230目)純化殘餘物，得到化合物K20。¹H-NMR(CDCl₃)δH 10.25(s,1H,CHO),7.64(s,1H,H-2'),7.37(d,J=8.0Hz,1H,H-6'),7.35(s,1H,H-4),7.04(d,J=8.0Hz,1H,H-5'),6.73(s,1H,H-6),6.11 (br s,1H,Ph-OH),4.00(s,3H,OMe),3.97(s,3H,OMe),3.69(t,J=6.5Hz,2H,H-3"),2.80(t,J=7.3Hz,2H,H-1"),1.94(m,2H,H-2")；13C-NMR(CDCl3)δC 186.8,165.9,148.7,146.9,144.6,141.6,139.9,127.3,123.7,120.6,116.7,115.0,113.5,111.0,108.8,62.2,56.3,56.1,34.7,32.5；IR(KBr)νmax：3513,3435,2940,2864,1637,1601,1522,1490,1409,1273,1139,1061,818cm^-1；EI-MS m/z(%)(70eV)356(M+,60；C₂₀H₂₀O₆),312(100),269(7),197(6),152(6),137(6),126(4),105(4),91(4),55(4)。

實例2合成及識別K20A

將二脫氫異丁香酚(1.15g)及DDQ(0.870g)溶解於10mL CH₂Cl/H₂O(4：1)之混合物中且攪拌48hr。過濾後，藉由矽膠管柱層析純化濾液，得到化合物K20A。¹H-NMR(CDCl₃)δH 9.64(d,J=7.6Hz,1H,H-3"),7.41(d,J=15.8Hz,1H,H-1"),7.02(s,1H,H-4),6.99(s,1H,H-6),6.97(d,J=8.1Hz,2H,H-6'),6.89(s,1H,H-2'),6.87(1d,J=8.1Hz,1H,H-5'),6.60(dd,J=15.8,7.6Hz,H-2"),5.66(s,1H,ph-OH),5.18(d,J=9.2Hz,1H,H-2),3.50(m,1H,H-3),1.40(d,J=6.8Hz,3H,C-3-Me)；13C-NMR(CDCl3)δC 193.6,153.2,150.6,146.7,146.0,144.6,134.0,131.2,128.1,126.3,119.9,117.3,114.3,111.8,108.9,94.5,56.0,55.9,45.1,17.7；IR(KBr)νmax：3486,2985,2852,2851,2734,1684,1620,1478,1133,821cm-1；MS(70eV；EI)m/z(%)：340(M+,100；C₂₀H₂₀O₅),325(7),137(15),97(15),71(18),57(30)。

實例3合成及識別K20E

將咖啡酸甲酯(762mg)溶解於20mL苯與30mL丙酮之混合物中。此後，將氧化銀(1.82g)添加至以上反應混合物中且在室溫下進一步攪拌60h。純化混合物之濾液以藉由用EtOAc/庚烷(1：1)溶離之矽膠管柱層析(Silica凝膠60，Merck 70-230目)產生中間化合物(341mg) (Pieters等人，1999)。進一步乙醯化中間物以生成最終產物K20E，藉由用乙酸乙酯/庚烷(1：1)溶離之矽膠管柱層析將其純化。K20E化合物之分子式確定為C₂₆H₂₄O₁₁([M+H]+ m/z 513.4708)；¹H-NMR(CDCl₃ 300MHz)δ：2.27(6H,s,OAc),2.30(3H,s,OAc),3.78(3H,s,OMe),3.83(3H,s,OMe),4.28(1H,d,J=7.4Hz,H-3),6.19(1H,d,J=7.4Hz,H-2),6.29(1H,d,J=15.8Hz,H-2"),7.17(1H,d,J=8.4Hz,H-5'),7.19(1H,s,H-6),7.21(1H,d,J=1.9Hz,H-2'),7.28(1H,dd,J=8.4,1.9Hz,H-6'),7.42(1H,s,H-4),7.59(1H,d,J=15.8Hz,H-1")；IR(KBr)νmax：3074,3016,1776(Ar-OCOCH₃),1739,1716(-COOMe),1643(),1612,1492(芳族)，1273,1203及1176cm^-1。

實例4合成及識別K20B

將K20E(2.12g)及DDQ(3.24g)溶解於50mL 1,4-二噁烷中。接著使溶液回流。48h後，過濾溶液且在減壓下蒸發濾液。接著藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，得到化合物K20B。¹H-NMR(CDCl₃ 300MHz)δ：2.31(3H,s,OAc),2.32(3H,s,OAc),2.42(3H,s,OAc),3.80(3H,s,COOMe),3.95(3H,s,COOMe),6.44(1H,d,J=16.1Hz,H-2"),7.30~7.33(2H,m,H-2',H-5'),7.77(1H,d,J=16.1Hz,H-1"),7.88~7.92(2H,m,H-6,H-6'),8.06(1H,d,J=1.3Hz,H-4)；13C-NMR(CDCl3 75MHz)δ：20.6,20.7,51.7,52.0,109.8,117.7,118.2,121.0,123.3,125.0,127.2,128.0,131.7,135.3,141.7,144.0,144.1,145.9,160.0,163.4,167.2,167.8,168.0,168.1；IR(KBr)νmax：3006,2957,2848,1779,1717,1642,1616,1501,1438,1378,1213,1084,1022,899,863cm-1；MS(70eV,EI)m/z(%)：510(M+,8),468(20),426(34),414(23),384(100),352(35),322(30),178(15),97(21),83(25),69(35),58(43)。

實例5合成及識別K20L

在室溫下將阿魏酸甲酯(10g；於10mL丙酮中)以液滴形式添加 至IDA(10g)於100mL二氯甲烷(用CaH₂乾燥)之溶液中4h。48h後，將NaHCO₃(3g)添加至溶液中且攪拌1h。過濾混合物且在減壓下蒸發濾液，得到化合物K20L。接著藉由用EtOAc/己烷(1：9)溶離之矽膠管柱層析純化殘餘物，得到化合物K20L。¹H-NMR(CDCl₃)δH：7.64(d,J=15.9Hz,1H,H-1"),7.17(s,1H,H-4),7.00(s,1H,H-6),6.88(s,3H,H-2',H-5',H-6'),6.30(d,J=15.9Hz,1H,H-2"),6.09(d,J=8.1Hz,1H,H-2),5.63(s,1H,Ph-OH),4.33(d,J=8.1Hz,1H,H-3),3.89(s,3H,OMe),3.86(s,3H,OMe),3.81(s,3H,COOMe),3.79(s,3H,COOMe)；13C-NMR(CDCl₃)δC：170.7,167.6,146.0,144.7,144.6,131.3,128.5,125.6,119.4,117.8,115.5,114.5,112.0,108.7,87.4,56.0,55.9,55.4,52.8,51.6；IR(KBr)νmax：3396,3011,2956,2849,1741,1637,1606,1496,1440,1287,837,612cm-1；MS(70eV,EI)m/z(%)：414(M+,95；C₂₂H₂₂O₈),382(100),350(73),280(15),266(12),167(8),151(7),137(6),58(18)。

生物評定 實例6具有抗腫瘤及抗血管生成作用之K20E

測試咖啡酸甲酯及K20系列化合物以藉由MTT分析確定對HUVEC之細胞生長的抑制作用。實驗資料表明，在所有經測試化合物之中，K20E在抑制HUVEC之細胞生長中顯示最高效能(參見下表)。藉此，在後續實驗中對K20E進行探究其藥理學機制。

小鼠同種異體移植肺腫瘤模型用於評估本研究中之K20E之活體內抗腫瘤活性。結果展示在2週K20E處理後腫瘤塊狀物在攜LLC1腫 瘤小鼠中劑量依賴性減小(圖1A)。相較於對照組(Pb 0.05)，藉由每天8mg/kg K20，腫瘤塊顯著減小。

為了進一步闡明K20E對抗血管生成之作用，將與VEGF混合之基質膠經皮下植入小鼠中以評估K20E之抗新血管生成作用(圖1B)。研究展示，與對照組(無VEGF補充劑)相比，新生血管形成(展示為紅色)在具有VEGF之基質膠栓塞內受到顯著刺激，其藉由較高劑量(4μM及8μM)K20E而非較低劑量(1μM及2μM)以劑量依賴性方式(圖1B；上圖)顯著降低。同樣，對所收穫栓塞之血紅素含量之定量支持以上觀測結果(下圖；圖1B)。實驗資料顯示相較於僅具有VEGF之基質膠，K20E處理以劑量依賴性方式明顯減少具有VEGF之經植入基質膠栓塞之血紅素含量。活體外補充資料、雞胚絨毛尿囊膜(CAM)分析亦支持K20E可以劑量依賴性方式有效減少血管生成。

實例7 K20E在LLC1細胞及HUVEC中顯示生長抑制

為了區分K20E在癌細胞與血管內皮細胞(VEC)之間生物抑制作用，在兩種細胞中個別檢驗K20E之生長抑制。資料展示K20E可顯著抑制在正常培養條件下之LLC1肺癌細胞之細胞活力。LLC1上K20E之GI50值(造成50%生長抑制之濃度)為約79.4μM(資料中未示)。同樣，藉由以劑量依賴性方式之K20E處理可顯著減少經5% FBS刺激之HUVEC之細胞生長(圖2A)。HUVEC上K20E之GI50值為約7.5μM(參見上表)。此等資料表明根據GI50值K20E在抗血管生成中比在抗癌中有效。因此，在以下實驗中K20E之藥理學機制聚焦於抗血管生成。此外，為了減小K20E之非特異性細胞毒性，在以下研究中使用低濃度(0.5、1及2μM；大致等於GI10值)K20E。

為了進一步確定K20E對HUVEC之生長抑制，在用不同濃度(0.5、1及2μM；參見圖2B、圖2C及圖2D)K20E處理之細胞中分析細胞週期分佈。結果表明0.5及1μM K20E可分別顯著誘發HUVEC中亞 G1期(細胞凋亡)中之細胞及G2/M期中之停滯細胞(圖2E)。

實例8 K20E減少HUVEC遷移及侵入

VEC之細胞動力(遷移及侵入)為形成新癌旁血管中之最初現象。結果指示HUVEC之遷移可藉由5% FBS顯著增加，其作用可藉由0.5μM K20E顯著消除(圖3A)。同樣，5% FBS刺激亦顯著促進HUVEC之細胞侵入，其活性在用0.5μM K20E處理之細胞中可在很大程度上得到抑制(圖3B)。

實例9 K20E減少HUVEC管狀之網路之形成

可在生長於具有血管生成促進刺激劑之胞外基質(ECM)上之HUVEC中發現管狀網路之形成，其為血管生成過程中之重要步驟。研究顯示可在用5% FBS(作為血管生成刺激劑)處理8h後誘發基質膠上之HUVEC之管形成，其誘發可藉由以劑量依賴性方式之K20E處理顯著抑制(圖4)。

實例10 K20E下調HUVEC中LLC1細胞及VEGFR-2中之VEGF表現水準

自癌細胞分泌之VEGF及於VEC上活化之VEGFR-2為包括腫瘤新血管生成之病理性血管生成所需之兩種關鍵過程。藉此，在LLC1癌細胞內偵測胞內及分泌性VEGF蛋白質水準且分別收穫培養基。研究指示K20E可劑量依賴性降低LLC1癌細胞中胞內及分泌性VEGF蛋白質水準(圖5)。K20E亦分別顯著下調HUVEC中胞內及表面VEGFR-2之表現水準(圖6A)。因此，在HUVEC中進一步分析VEGFR-2主要下游信號級聯中之K20E之調節作用。實驗資料顯示K20E抑制處於激活水準而非總蛋白質水準下MEK1/2-ERK1/2(圖6B)及AKT-mTOR信號路徑(圖6C)。另一方面，藉由MAPK-ERK1/2及AKT-mTOR信號級聯調節之明膠酶(MMP-2及MMP-9)之蛋白質及活性水準亦在用K20E處理之HUVEC中明顯降低(圖6D)。

實例11 K20E活化HUVEC中之p53-p21信號路徑

根據自細胞週期分佈分析獲得之結果，K20E誘發HUVEC中細胞週期在G2/M期停滯且在亞G1期增加(圖2)。因此，亦在本研究中分析控制細胞週期停滯及細胞凋亡之p53-p21路徑之表現水準。實驗結果展示，p53及p21蛋白質之表現水準在經K20E處理後之HUVEC中劑量依賴性增加(圖7)。

Claims (10)

1. 一種化合物，其係 或其立體異構體，或其對映異構體或其醫藥學上可接受之鹽。
2. 一種組合物，其包含如請求項1之化合物或其立體異構體，或其對映異構體或其醫藥學上可接受之鹽。
3. 一種如請求項1之化合物或如請求項2之組合物的用途，其係用於製備治療抗腫瘤及抗血管生成作用的藥物。
4. 一種如請求項1之化合物或如請求項2之組合物的用途，其係用於製備抑制肺癌細胞的藥物。
5. 如請求項4之用途，其中該肺癌細胞為LLC1細胞。
6. 一種式(I)化合物或其立體異構體或其對映異構體或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製備抗血管生成的藥物， 其中X為O；R₁為未經取代或經OH、-CHO或C(O)₂C_1-10烷基取代之C_1-10烷基或C_2-10烯基； R₂為C_1-10烷氧基或-O-乙醯基；R₃為CO₂Me；R₄為C_1-10烷氧基或-O-乙醯基；R₅為OH或-O-乙醯基；且R₆為不存在。
7. 如請求項6之用途，其中該式(I)化合物抑制HUVEC之細胞生長。
8. 如請求項6之用途，其中該藥物與第二抗癌療法共同投與。
9. 如請求項8之用途，其中該第二抗癌療法為化學療法、手術療法、免疫療法或放射療法。
10. 如請求項6至9中任一項之用途，其中該式(I)化合物為 或其立體異構體，或其對映異構體或其醫藥學上可接受之鹽。