CN109055480B - 一种纺锤水蚤体内附着细菌的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纺锤水蚤体内附着细菌的检测方法，具体为：从水样中取成体纺锤水蚤，放入盛有无菌水的无菌容器中，进行紫外照射，灭活水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌；将灭杀所得纺锤水蚤转移至无菌离心管中，冻融后超声，破碎剑水蚤身体结构；将冻融所得纺锤水蚤放入装有无菌水的离心管中，加入含有D‑氨基酸的解吸剂溶液，超声处理后再离心处理，取离心上清液；将解吸步骤所得离心上清液，进行细菌培养和菌落计数，计算每个纺锤水蚤体内的细菌数量。本发明检测方法操作步骤简单、检测周期短，使得体内附着细菌脱附效率高、速度快、解吸更加彻底、解吸剂用量少，检测方法准确度高、检测结果稳定可靠。

Description

一种纺锤水蚤体内附着细菌的检测方法

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，尤其是涉及一种纺锤水蚤体内附着细菌的检测方法。

技术背景

纺锤水蚤广泛分布于海洋，是众多经济鱼类和虾蟹幼体主要的天然饵料生物。据FAO估计，1999年海洋渔业产业中，0.92亿吨的渔获量是以天然桡足类饵料生物为食的鱼类。纺锤水蚤属，广泛分布与我国沿海、日本沿海、太平洋和印度洋，是舟山渔场及邻近海域夏季浮游动物的优势种之一，由于生活史短、饵料副宽等特点，适合应用于水产养殖业。纺锤水蚤的营养价值n-3高度不饱和脂肪酸(n-3HUPA)是海水仔稚鱼的必需脂肪酸，它们是海水仔稚鱼正常生长所必需的，尤其是廿碳五烯酸(EPA，20:5n-3)和廿二碳六烯酸(DHA，22:6n-3)。EPA和DHA的缺乏或不足将影响鱼虾幼体的生长发育，成活率降低，活力不足，抗逆性减弱。海水鱼不能把亚麻酸(18:3n-3)自身生物合成为EPA和DHA，所需要的EPA和DHA只能从饲料中摄取。大量研究表明很多沿岸性的桡足类动物富含DHA和EPA(大约占到所含脂肪酸的60％)，能够满足仔稚鱼对HUFA的需求。但自然海域采集的纺锤水蚤由于携带许多致病细菌，直接投喂易引起养殖病害扩散，纺锤水蚤可作为细菌的载体或其他致病性原生动物的中间宿主，细菌可在纺锤水蚤的体内稳定赋存；纺锤水蚤可对其携带的细菌提供庇护作用。因此有效评价纺锤水蚤体内细菌数量，对于纺锤水蚤的作为水产养殖业开口饵料应用具有重要前景。

大量的文献表明，目前国内外可见文献报道的无脊椎类浮游动物体内微生物的检测主要参照Bichai.F提出的方法。该方法采用液氯将剑水蚤体内微生物有效灭活后，通过超声波细胞破碎仪将浮游动物体内破坏释放其体内微生物。这个方法主要有两个弊端：首先，由于采用液氯消毒会造成消毒剂分子渗透入浮游动物体内，对其体内细菌有一定的灭活作用，会造成检测结果失真；其次，超声波细胞破碎仪有着大功率、高频率的特点，能够破碎组织、细菌、病毒、孢子及其它细胞结构，因而在超声破碎过程中能够杀死部分体内细菌，也会造成检测结果偏低。此外，由于大部分体内细菌都集中在浮游动物的肠道部位，若不将细菌从肠道中释放，会使浮游动物经超声破碎后向水中释放的体内细菌浓度偏低，也会造成检测结果偏低。现在技术如授权公告号为CN 103451262 B的中国发明专利，公开了一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法。利用紫外线对水样中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌进行灭活。该方法在有效灭活水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌的前提下，由于剑水蚤对其体内细菌的庇护作用，避免了现有检测方法采用液氯灭活剑水蚤体内附着细菌的过程中，由于氯分子的渗透作用会对体内微生物产生影响的问题。采用冻融法与超声法破碎剑水蚤身体结构，附加解吸剂洗脱其肠道等器官附着的体内细菌。最后根据生活饮用水标准检验法(GB/T5750.12-2006)中细菌总数的测定方法进行细菌的培养和计数，检测其体内细菌数量。该检测方法具有准确度高、可靠等优点，具有广阔的应用前景。但是该检测方法对水蚤类浮游动物体内附着细菌的解吸效果仍然不是太理想。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种操作步骤简单、检测周期短，使得体内附着细菌脱附效率高、速度快、解吸更加彻底、解吸剂用量少，检测方法准确度高、检测结果稳定可靠的纺锤水蚤体内附着细菌的检测方法。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

一种纺锤水蚤体内附着细菌的检测方法，包括体表附着细菌灭杀、冻融、解吸、检测，其中解吸步骤用解吸剂中含有D-氨基酸。D-氨基酸能够占据菌表亲疏水点位，改变细菌表面疏水性，提高有生物膜内释放出的细菌表面亲水性和Zeta电位绝对值，使得纺锤水蚤体内附着细菌在解脱剂的作用下快速溶于其中，且D-氨基酸对细菌的生长活性没有明显影响，能够保证检测结果的稳定性和精确性；且该检测法操作步骤简单、检测周期短，对于纺锤水蚤类浮游动物体内附着细菌的检测效果显著。

作为优选，D-氨基酸选自D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-苯丙氨酸或D-甲硫氨酸。

作为优选，解吸剂包括如下成分及其重量份：氯化钠0.8-1.0份、表面活性剂0.03-0.05份、磷酸氢二钠0.1-0.25份、磷酸二氢钾0.2-0.4份、D-氨基酸0.01-0.02份。该解吸剂中各有效成分间能发挥协同作用，在较少量作用的条件下即能使纺锤水蚤体内附着细菌实现解吸彻底、效率高的解吸。

进一步优选，表面活性剂包含鼠李糖脂和吐温80。纺锤水蚤体内附着细菌主要依靠微生物分泌胞外聚合物而形成的生物膜粘附于纺锤水蚤体内，而鼠李糖脂和吐温80的合理存在能够和解吸剂中的其他成分发生增益作用，能够破坏生物膜外侧的亲水膜，进而破坏生物膜的空间三维结构，促进细菌生物膜的解体，然后配合离心作用，使得生物膜脱落而解体，进而使其内部微生物能够完全散播到解脱剂中，提高本发明检测方法的精确性。

更进一步优选，表面活性剂还包含D-鼠李糖，表面活性剂中鼠李糖脂、吐温80和D-鼠李糖的质量比为1:10-12:0.03-0.05。该表面活性剂中特殊比例的鼠李糖脂、吐温80和D-鼠李糖的混合结合显著降低阴离子非离子表面活性剂的沉淀/吸附损失，提高表面活性剂有效浓度，从而协同增强解吸水蚤体内附着细菌，增强纺锤水蚤体内附着细菌的解吸，显著减少解吸剂用量，同时能协同增大附着细菌在溶液中浓度，提高附着细菌的解析度。

作为优选，解吸步骤为：将冻融所得纺锤水蚤放入装有25mL无菌水的50mL离心管中，加入1.0-1.3mL解吸剂溶液，在330-380W的超声波功率下超声处理12-15min，然后再在1800-2300rpm、20-30℃下离心处理2-5min，离心结束后取离心上清液，备用。本发明解吸步骤采用解吸剂、超声波处理和离心处理相结合的方式对纺锤水蚤的肠道等器官附着细菌进行解吸，较现有技术，使得体内附着细菌脱附效率高、速度快、解吸更加彻底、解吸剂用量少，进而使得本发明检测方法准确度高、检测结果稳定可靠。

作为优选，体表附着细菌灭杀步骤为：从水样中取成体纺锤水蚤，放入盛有无菌水的无菌容器中，对容器的中水蚤采用200-275nm的紫外线进行照射，灭活水中自由细菌和纺锤水蚤体表附着细菌。本发明采用的波段紫外线又称为短波灭菌紫外线，它的穿透能力很弱，无法穿透大部分的透明玻璃及塑料，更不会穿透纺锤水蚤坚硬的体表外壳，当这种紫外线照射纺锤水蚤体表时，由于受到纺锤水蚤体表外壳的保护，紫外线无法穿透体表，保护了其体内细菌免受紫外线照射。

作为优选，冻融步骤为：将灭杀所得纺锤水蚤转移至无菌离心管中，加入无菌水，置于-20至-10℃的冰箱中恒温冷冻1-2h，冷冻完毕后取出在20-30℃下进行恒温融化10-20min，再用功率为80-120W的超声波进行超声处理1-5min，破碎纺锤水蚤身体结构，备用。本发明采用冻融法结合超声波振荡，冻融时将样本置于冰箱中恒温冷冻，再经恒温融化，使得纺锤水蚤的蚤体完全破碎，且能最大限度减少对体内细菌的伤害。

作为优选，检测步骤为：将解吸步骤所得离心上清液，进行细菌培养和菌落计数，计算每个纺锤水蚤体内的细菌数量。

进一步优选，检测步骤中细菌检测是根据GB/T5750.12-2006中细菌总数的测定方法进行的。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1)本发明检测方法操作步骤简单，灵敏度高，稳定性好，对于纺锤水蚤类浮游动物体内细菌检测效果显著，准确度高、检测结果稳定可靠；2)本发明解吸步使得体内附着细菌脱附效率高、速度快、解吸更加彻底、解吸剂用量少，进而使得本发明检测方法准确度高、检测结果稳定可靠；3)本发明用解吸剂中各有效成分间能发挥协同作用，在较少量作用的条件下即能使纺锤水蚤体内附着细菌实现解吸彻底、效率高的解吸，能够保证检测结果的稳定性和精确性；4)本发明检测方法经过适当改进也可用去检测其它浮游动物体内细菌，适用范围较广，实用性较强，具有较高的可操作性，适合广泛推广与应用。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

一种纺锤水蚤体内附着细菌的检测方法，包括体表附着细菌灭杀、冻融、解吸、检测，其中解吸步骤用解吸剂中含有D-氨基酸。D-氨基酸能够占据菌表亲疏水点位，改变细菌表面疏水性，提高有生物膜内释放出的细菌表面亲水性和Zeta电位绝对值，使得纺锤水蚤体内附着细菌在解脱剂的作用下快速溶于其中，且D-氨基酸对细菌的生长活性没有明显影响，能够保证检测结果的稳定性和精确性；且该检测法操作步骤简单、检测周期短，对于纺锤水蚤类浮游动物体内附着细菌的检测效果显著。

上述D-氨基酸选自D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-苯丙氨酸或D-甲硫氨酸。

上述解吸剂具体包括如下成分及其重量份：氯化钠0.8份、表面活性剂0.03份、磷酸氢二钠0.1份、磷酸二氢钾0.2份、D-酪氨酸0.01份。该解吸剂中各有效成分间能发挥协同作用，在较少量作用的条件下即能使纺锤水蚤体内附着细菌实现解吸彻底、效率高的解吸。

其中，表面活性剂包含鼠李糖脂和吐温80。纺锤水蚤体内附着细菌主要依靠微生物分泌胞外聚合物而形成的生物膜粘附于纺锤水蚤体内，而鼠李糖脂和吐温80的合理存在能够和解吸剂中的其他成分发生增益作用，能够破坏生物膜外侧的亲水膜，进而破坏生物膜的空间三维结构，促进细菌生物膜的解体，然后配合离心作用，使得生物膜脱落而解体，进而使其内部微生物能够完全散播到解脱剂中，提高本发明检测方法的精确性。

表面活性剂还包含D-鼠李糖，表面活性剂中鼠李糖脂、吐温80和D-鼠李糖的质量比为1:10:0.03。该表面活性剂中特殊比例的鼠李糖脂、吐温80和D-鼠李糖的混合结合显著降低阴离子非离子表面活性剂的沉淀/吸附损失，提高表面活性剂有效浓度，从而协同增强解吸水蚤体内附着细菌，增强纺锤水蚤体内附着细菌的解吸，显著减少解吸剂用量，同时能协同增大附着细菌在溶液中浓度，提高附着细菌的解析度。

解吸步骤为：将冻融所得纺锤水蚤放入装有25mL无菌水的50mL离心管中，加入1.0mL解吸剂溶液，在330W的超声波功率下超声处理12min，然后再在1800rpm、20℃下离心处理2min，离心结束后取离心上清液，备用。本发明解吸步骤采用解吸剂、超声波处理和离心处理相结合的方式对纺锤水蚤的肠道等器官附着细菌进行解吸，较现有技术，使得体内附着细菌脱附效率高、速度快、解吸更加彻底、解吸剂用量少，进而使得本发明检测方法准确度高、检测结果稳定可靠。

体表附着细菌灭杀步骤为：从水样中取成体纺锤水蚤，放入盛有无菌水的无菌容器中，对容器的中水蚤采用200nm的200nm紫外线进行照射，灭活水中自由细菌和纺锤水蚤体表附着细菌。采用的波段紫外线又称为短波灭菌紫外线，它的穿透能力很弱，无法穿透大部分的透明玻璃及塑料，更不会穿透纺锤水蚤坚硬的体表外壳，当这种紫外线照射纺锤水蚤体表时，由于受到纺锤水蚤体表外壳的保护，紫外线无法穿透体表，保护了其体内细菌免受紫外线照射。

冻融步骤为：将灭杀所得纺锤水蚤转移至无菌离心管中，加入无菌水，置于-20℃的冰箱中恒温冷冻1h，冷冻完毕后取出在20℃下进行恒温融化10min，再用功率为80W的超声波进行超声处理1min，破碎纺锤水蚤身体结构，备用。采用冻融法结合超声波振荡，冻融时将样本置于冰箱中恒温冷冻，再经恒温融化，使得纺锤水蚤的蚤体完全破碎，且能最大限度减少对体内细菌的伤害。

检测步骤为：将解吸步骤所得离心上清液，进行细菌培养和菌落计数，计算每个纺锤水蚤体内的细菌数量。

上述检测步骤中细菌检测是根据GB/T5750.12-2006中细菌总数的测定方法进行的。

实施例2：

一种纺锤水蚤体内附着细菌的检测方法，包括体内附着细菌灭杀、冻融、解吸、检测，具体包括如下步骤：

1)体表附着细菌灭杀：从水样中取成体纺锤水蚤，放入盛有无菌水的无菌容器中，对容器的中水蚤采用250nm的紫外线进行照射，灭活水中自由细菌和纺锤水蚤体表附着细菌；

2)冻融：将灭杀所得纺锤水蚤转移至无菌离心管中，加入无菌水，置于-15℃的冰箱中恒温冷冻1.5h，冷冻完毕后取出在25℃下进行恒温融化15min，再用功率为100W的超声波进行超声处理3min，破碎纺锤水蚤身体结构，备用；

3)解吸：将冻融所得纺锤水蚤放入装有25mL无菌水的50mL离心管中，加入1.15mL解吸剂溶液，在350W的超声波功率下超声处理14min，然后再在2000rpm、25℃下离心处理3min，离心结束后取离心上清液，备用；

4)检测：将解吸步骤所得离心上清液，进行细菌培养和菌落计数，计算每个纺锤水蚤体内的细菌数量，其中细菌检测是根据GB/T5750.12-2006中细菌总数的测定方法进行的。

其中，解吸剂具体包括如下成分及其重量份：氯化钠0.9份、表面活性剂0.04份、磷酸氢二钠0.18份、磷酸二氢钾0.3份、D-氨基酸0.015份。上述表面活性剂中鼠李糖脂、吐温80和D-鼠李糖的质量比为1:11:0.04；D-氨基酸为质量比为1:0.25的D-酪氨酸和D-亮氨酸。

实施例3：

一种纺锤水蚤体内附着细菌的检测方法，包括体内附着细菌灭杀、冻融、解吸、检测，具体包括如下步骤：

1)体表附着细菌灭杀：从水样中取成体纺锤水蚤，放入盛有无菌水的无菌容器中，对容器的中水蚤采用275nm的紫外线进行照射，灭活水中自由细菌和纺锤水蚤体表附着细菌；

2)冻融：将灭杀所得纺锤水蚤转移至无菌离心管中，加入无菌水，置于-10℃的冰箱中恒温冷冻2h，冷冻完毕后取出在30℃下进行恒温融化20min，再用功率为120W的超声波进行超声处理5min，破碎纺锤水蚤身体结构，备用；

3)解吸：将冻融所得纺锤水蚤放入装有25mL无菌水的50mL离心管中，加入1.3mL解吸剂溶液，在380W的超声波功率下超声处理15min，然后再在2300rpm、30℃下离心处理5min，离心结束后取离心上清液，备用；

4)检测：将解吸步骤所得离心上清液，进行细菌培养和菌落计数，计算每个纺锤水蚤体内的细菌数量，其中细菌检测是根据GB/T5750.12-2006中细菌总数的测定方法进行的。

其中，解吸剂具体包括如下成分及其重量份：氯化钠1.0份、表面活性剂0.05份、磷酸氢二钠0.25份、磷酸二氢钾0.4份、D-氨基酸0.02份。上述表面活性剂中鼠李糖脂、吐温80和D-鼠李糖的质量比为1:12:0.05；D-氨基酸为D-苯丙氨酸。

对比例1：

一种纺锤水蚤体内附着细菌的检测方法，其解吸步骤用解吸剂具体包括如下成分及其重量份：氯化钠0.9份、表面活性剂0.04份、磷酸氢二钠0.18份、磷酸二氢钾0.3份、D-氨基酸0.015份。上述表面活性剂中吐温80和D-鼠李糖的质量比为12:0.04；D-氨基酸为质量比为1:0.25的D-酪氨酸和D-亮氨酸。其余步骤和实施例2完全一致，检测结果如表1。

对比例2：

一种纺锤水蚤体内附着细菌的检测方法，其解吸步骤用解吸剂具体包括如下成分及其重量份：氯化钠0.9份、表面活性剂0.04份、磷酸氢二钠0.18份、磷酸二氢钾0.3份、D-氨基酸0.015份。上述表面活性剂中鼠李糖脂和D-鼠李糖的质量比为12:0.04；D-氨基酸为质量比为1:0.25的D-酪氨酸和D-亮氨酸。其余步骤和实施例2完全一致，检测结果如表1。

对比例3：

一种纺锤水蚤体内附着细菌的检测方法，其解吸步骤用解吸剂具体包括如下成分及其重量份：氯化钠0.9份、表面活性剂0.04份、磷酸氢二钠0.18份、磷酸二氢钾0.3份、D-氨基酸0.015份。上述表面活性剂中鼠李糖脂、吐温80的质量比为1:11；D-氨基酸为质量比为1:0.25的D-酪氨酸和D-亮氨酸。其余步骤和实施例2完全一致，检测结果如表1。

对比例4：

一种纺锤水蚤体内附着细菌的检测方法，其解吸步骤用解吸剂具体包括如下成分及其重量份：氯化钠0.9份、表面活性剂0.04份、磷酸氢二钠0.18份、磷酸二氢钾0.3份。上述表面活性剂中鼠李糖脂、吐温80和D-鼠李糖的质量比为1:11:0.04。其余步骤和实施例2完全一致，检测结果如表1。

表1纺锤水蚤体内附着细菌的检测结果

对比表1的数据结果，可以发现本发明的方法所测得的纺锤水蚤体内附着的细菌总量明显大于对比例的检测法。本发明检测结果稳定，4次平行试验所得的数据比较接近，每次检测结果都相差30CFU/只以上。同时本发明用解吸剂中各有效成分间能发挥协同作用，在较少量作用的条件下即能使纺锤水蚤体内附着细菌实现解吸彻底、效率高的解吸。

本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种纺锤水蚤体内附着细菌的检测方法，包括体表附着细菌灭杀、冻融、解吸、检测，其特征在于：所述体表附着细菌灭杀步骤为：从水样中取成体纺锤水蚤，放入盛有无菌水的无菌容器中，对容器的中水蚤采用200-275nm的紫外线进行照射，灭活水中自由细菌和纺锤水蚤体表附着细菌；所述冻融步骤为：将灭杀所得纺锤水蚤转移至无菌离心管中，加入无菌水，置于-20至-10℃的冰箱中恒温冷冻1-2h，冷冻完毕后取出在20-30℃下进行恒温融化10-20min，再用功率为80-120W的超声波进行超声处理1-5min，破碎剑水蚤身体结构，备用；所述解吸步骤为：将冻融所得纺锤水蚤放入装有25mL无菌水的50mL离心管中，加入1.0-1.3mL解吸剂溶液，在330-380W的超声波功率下超声处理12-15min，然后再在1800-2300rpm、20-30℃下离心处理2-5min，离心结束后取离心上清液，备用；所述检测步骤为：将解吸步骤所得离心上清液，进行细菌培养和菌落计数，计算每个纺锤水蚤体内的细菌数量；

其中，所述解吸剂包括如下成分及其重量份：氯化钠0.8-1.0份、表面活性剂0.03-0.05份、磷酸氢二钠0.1-0.25份、磷酸二氢钾0.2-0.4份、D-氨基酸0.01-0.02份；所述表面活性剂为质量比为1:10-12:0.03-0.05的鼠李糖脂、吐温80和D-鼠李糖。

2.根据权利要求1所述的一种纺锤水蚤体内附着细菌的检测方法，其特征在于：所述D-氨基酸选自D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-苯丙氨酸或D-甲硫氨酸。

3.根据权利要求1所述的一种纺锤水蚤体内附着细菌的检测方法，其特征在于：所述细菌检测是根据GB/T5750.12-2006中细菌总数的测定方法进行的。