CN109022622A - 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的pcr检测引物及检测方法 - Google Patents

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的pcr检测引物及检测方法 Download PDF

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刘红
唐芳
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Abstract

本发明涉及一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的PCR检测引物，所述引物的核苷酸序列为：上游引物5'‑AATTTCTCCAAGCCTTCTCACC‑3'，下游引物5'‑TCTGGCAGCAAAGGTAACTCC‑3'。本发明相较于现有技术的引物具有测定范围更广的优点，引物设计时参照GenBank中所发表的十足目甲壳动物中所获得的IHHNV序列，避开了IHHNV在不同群体间的变异位点，选择在所发表序列中均保守的部分进行引物设计，所测范围更广，更稳定，结果更准确可靠。可应用于我国对虾养殖及育苗过程中的IHHNV病原检测和早期预警，具有良好的前景。

Description

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的PCR检测引物及检测 方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术检测领域,具体涉及一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的PCR检测引物及检测方法。
背景技术
传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)是单股DNA小病毒，是目前已知的对虾病毒中颗粒最小的一种，病毒粒(Virion)直径约22nm(纳米)，无套膜(Nonenveloped)，20面体(Icosahedron)对称的球状颗粒.IHHNV感染对虾的部位，包括外胚层组织，如鳃、表皮、前后肠上皮细胞、神经索和神经节；以及中胚层器官，如造血组织、触角腺、性腺、淋巴器官、结缔组织和横纹肌。在宿主细胞核内形成包涵体。在白对虾(Litopenaeus vannamei)则引起矮小畸形症候群(Runt-deformity syndrome，简称RDS)，成长缓慢且不齐，额角弯向一侧，第六腹节及尾扇变形或变小，造成高达50％的经济损失。传染性皮下及造血组织坏死病毒IHHNV容易被忽略，因为IHHNV感染南美白对虾，不会导致死亡。南美白对虾在感染IHHNV之后，有可能终身带原，并透过垂直传染途径感染子代，或透过食物链或互相残食或水体而引起水平感染，其中以吃食病虾的传染性最高。IHHNV自1983年在夏威夷首次爆发至今，目前已经公布全基因组序列有夏威夷株、印度株、韩国株、中国福建株、中国赣榆株、中国射阳株。为了防止IHHNV的爆发，目前可以采取以下几个措施防范：严格筛选IHHNV-free的对虾作为亲本来孵育虾苗；受精卵和幼体必须严格消毒；虾苗养殖场的水源、设备、管道等等需要定期彻底消毒，以及需要一定的生物安全防护系统；在养殖塘中放养Specific-Pathogen-Free(SPF)虾苗，定期的对虾塘进行IHHNV生物诊断等。
IHHNV的诊断技术有两种即组织学检测和分子生物学诊断。目前的分子生物学诊断方法主要有PCR方法、套式PCR、荧光定量染料法、LAMP法等。PCR方法具有高灵敏度的优点，但是用现有技术中已发表引物进行IHHNV病毒检测时，准确性和稳定性不够，有时容易发生漏检，例如，有的带病样品检测为阴性，但现有引物不是在所有株系中均为保守，导致部分该区域有变异的株系漏检。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的PCR检测引物，利用其对IHHNV进行PCR检测时，检测结果更准确，更稳定，不会发生漏检。
本发明的另一目的还在于提供一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的PCR检测方法。
技术方案
一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的PCR检测引物，所述引物由上游引物和下游引物组成，其核苷酸序列为：
上游引物：5'-AATTTCTCCAAGCCTTCTCACC-3'
下游引物：5'-TCTGGCAGCAAAGGTAACTCC-3'。
一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的PCR检测方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)采用上述引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判断样品中是否含对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒。具体判断方法：在777bp处看是否有产物条带，有产物条带的话，说明模板中含有IHHNV病毒，即为IHHNV阳性；反之在777bp处没有产物条带，说明模板中不含有IHHNV病毒，即为IHHNV阴性。
步骤(2)中，所述PCR扩增反应的反应体系为20μL，包括2×Taq PCR Master Mix10μL，上游引物、下游引物各0.5μL，ddH2O 8.5μL，DNA模板0.5μL。
步骤(2)中，所述PCR扩增反应的程序为：94℃3min；94℃1min，68℃1min，72℃1min,35个循环；72℃10min。
步骤(3)中，琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖浓度为1.5％，电压为70V。
本发明的有益效果：本发明的PCR检测引物与已发表引物对比，具有如下优势：①避开某些变异株的变异区，灵敏度更高；②选取共有序列进行设计，准确率更高。即具有高灵敏度与高准确率的优点，适合检测易携带IHHNV病毒的海洋生物，包括各生长阶段的对虾，鱿鱼，沙蚕等海洋生物，特别适用于对虾养殖过程中IHHNV的检测及监测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为不同IHHNV模板稀释浓度下PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为IHHNV模板在10-10和10-11两个稀释浓度下二次PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为以双蒸馏水为模板的二次PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图4为以沙蚕总DNA为模板的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中，PCR扩增反应的反应试剂购自天根生化科技有限公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
实施例1灵敏度检测
对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的PCR检测引物由上游引物和下游引物组成，其核苷酸序列为：
上游引物：5'-AATTTCTCCAAGCCTTCTCACC-3'
下游引物：5'-TCTGGCAGCAAAGGTAACTCC-3'。
直接PCR检测：
(1)将传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)模板稀释至8个不同浓度梯度，依次为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11copy/μl。
(2)采用上述引物进行PCR扩增反应，得到8个PCR扩增产物；
所述PCR扩增反应的反应体系为20μL，包括2×Taq PCR Master Mix 10μL，上游引物、下游引物各0.5μL，ddH2O 8.5μL，DNA模板0.5μL。
所述PCR扩增反应的程序为：94℃3min；94℃1min，68℃1min，72℃1min,35个循环；72℃10min。
(3)将步骤(2)的8个PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.5％，电压为70V)，电泳图见图1，其中M为DNA MarkerII，从1开始向右的稀释浓度依次为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11copy/μl。由图1可以看出，7编号对应为10-10，图中依稀可见，除10-10以及10-11稀释外，其余均有明显产物。
二次PCR检测：
由于上面直接PCR检测实验中最后两个10-10和10-11较高稀释度模板在一次PCR产物电泳后未能检测出扩增产物，现进行二次PCR检测，即对该两个PCR反应产物进行10倍稀释，取稀释液作为模板再次进行PCR扩增，反应体系同上。二次PCR可以提高检测灵敏度2个级别，即100倍。反应产物电泳结果如图2所示，其中，2，3，4泳道为10-10稀释浓度，9，10，11泳道为10-11稀释浓度，在图2中均可以看到有明显产物。
综上，当一般养殖成虾中有发病症状时，说明感染可能较多，可以采用直接PCR检测，二次PCR适用于不发病日常监测，尤其是亲虾或虾苗养殖中。
实施例2特异性检测
为验证本发明PCR反应的特异性，进行以双蒸馏水为模板的阴性对照实验，反应体系同实施例1，只是模板以ddH2O代替，在PCR反应完成后以PCR反应产物为模板进行了二次PCR反应，以排出实验室的人为污染等因素。二次反应的产物电泳结果见图3，其中M为DNAMarkerII，泳道1-9为阴性对照，泳道10，11为阳性对照。
实施例3
在2015年4月23日到4月29日期间对144尾罗氏沼虾雌性亲虾分三次分别进行了二次PCR检测，检测方法：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)采用实施例1的引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；
所述PCR扩增反应的反应体系为20μL，包括2×Taq PCR Master Mix 10μL，上游引物、下游引物各0.5μL，ddH2O 8.5μL，DNA模板0.5μL。
所述PCR扩增反应的程序为：94℃3min；94℃1min，68℃1min，72℃1min,35个循环；72℃10min。
(3)将步骤(2)的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.5％，电压为70V)，根据电泳结果判断样品中是否含对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒。
电泳结果：阳性和阴性对照正常，样品全部未检测到IHHNV。
实施例4
在2016年11月到2017年10月，连续每月于江苏和上海等地虾塘中取罗氏沼虾样品，每月抽取12个虾塘，每塘取30尾虾，合计12批次4320尾虾，进行直接PCR检测：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)采用实施例1的引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；
所述PCR扩增反应的反应体系为20μL，包括2×Taq PCR Master Mix 10μL，上游引物、下游引物各0.5μL，ddH2O 8.5μL，DNA模板0.5μL。
所述PCR扩增反应的程序为：94℃3min；94℃1min，68℃1min，72℃1min,35个循环；72℃10min。
(3)将步骤(2)的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.5％，电压为70V)，根据电泳结果判断样品中是否含对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒。
电泳结果：发现IHHNV阳性3批次中各3尾合计9尾，检出率为2.08％。
对上述2016年11月到2017年10月的4320尾虾运用现有引物(上游：GAACGGCTTTCGTATTTTGG；下游：AGCGTAGGACTTGCCGATTA；产物预计大小：647bp)进行对照实验，阴性和阳性对照正常，直接PCR检测IHHNV阳性仅1批次的2尾虾，检出率为0.5％。
实施例5
由于在亲虾养殖中需要投喂生物饵料沙蚕，所投喂的沙蚕不能携带任何对虾病原，因此投喂前必须进行检测。2017年7月，对所投喂的生物饵料沙蚕进行检测，检测方法同实施例4，模板为沙蚕总DNA。电泳图见图4，其中，M为DNA MarkerII，泳道1，2，3为模板为ddH2O的阴性对照，泳道4-10为沙蚕DNA模板，泳道11，12，13为阳性对照。由图4可以看出，未检出IHHNV阳性样品。后又对2017年8月到2018年2月的34批次沙蚕进行检测，均未检出IHHNV阳性样品。

Claims (5)

1.一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的PCR检测引物，其特征在于，所述引物由上游引物和下游引物组成，其核苷酸序列为：
上游引物：5'-AATTTCTCCAAGCCTTCTCACC-3'
下游引物：5'-TCTGGCAGCAAAGGTAACTCC-3'。
2.一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)采用权利要求1所述引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判断样品中是否含对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒。
3.如权利要求2所述的PCR检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增反应的反应体系为20μL，包括2×Taq PCR Master Mix 10μL，上游引物、下游引物各0.5μL，ddH2O 8.5μL，DNA模板0.5μL。
4.如权利要求2所述的PCR检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增反应的程序为：94℃3min；94℃1min，68℃1min，72℃1min,35个循环；72℃10min。
5.如权利要求2或3或4所述的PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)中，琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖浓度为1.5％，电压为70V。
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