CN109021015A - 二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents
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-
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Abstract
本发明公开了一种二氢嘧啶‑磷酰胺类衍生物及其制备方法和应用。所述化合物具有式I所示的结构。本发明还涉及含有式I结构化合物的制备方法，药物组合物以及提供上述化合物在制备抗HBV药物中的应用。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物及其制备方法与制药用途。
背景技术
乙型病毒性肝炎(viral hepatitis type B)，简称乙肝(Hepatitis B)，是由乙型肝炎病毒(HBV)所致的重大传染性疾病，长期发展可导致急慢性病毒性肝炎、重型肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。目前用于预防和治疗慢性乙型肝炎(CHB)的药物主要有疫苗、干扰素、免疫调节药以及DNA聚合酶抑制剂。但是由于它们存在耐药性、副作用、停药后反弹和不能彻底的清除乙肝病毒等缺点，因此研发新型高效、低毒和抗耐药性的非核苷类乙肝病毒抑制剂具有重要意义。
核心蛋白是HBV核壳体组成的主要结构蛋白，在病毒进化过程中相对保守，并且核心蛋白的组装在乙肝病毒生命周期中发挥着重要作用。然而，目前还没有相关靶点的药物上市。针对目前进入临床候选药物肝毒性强、水溶性差以及代谢稳定性差的缺点，通过核心蛋白与配体的晶体复合物结构，进行了基于靶点的合理药物设计，设计合成了一类新颖的二氢嘧啶-磷酰胺化合物，此类化合物在现有技术中未见相关报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物及其制备方法，本发明还提供了上述化合物作为非核苷类HBV抑制剂的活性筛选结果及其应用。
本发明的技术方案如下：
一、二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物
本发明涉及的二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物，具有如下通式I所示的结构：
其中，
R为含3-6个碳原子的环烷基、苯环、含或不含卤素的苄基；
根据本发明优选的，通式I中，R为环丙烷，环丁烷，环戊烷，环己烷，苯环，苄基，卤素取代的苄基。
进一步优选的，二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物是具有下列结构的化合物之一：
表1二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物结构式
二、二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物的制备方法
二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物的制备方法，步骤包括：首先以化合物2-噻唑甲脒盐酸盐、2-溴-4-氟苯甲醛和乙酰乙酸乙酯为起始原料，通过“一锅法”环合得到关键中间体2，在四氯化碳溶液中，中间体2与N-溴代丁二酰亚胺发生溴代反应得到重要中间体3，中间体3与亚磷酸三乙酯通过Abuzov反应得到化合物4，在乙腈溶液中，化合物4与三甲基溴硅烷发生水解反应得到重要中间体5，最后，中间体5再与含不同取代基的伯胺缩合得到目标化合物I；
合成路线如下：
试剂及条件:(i)2-溴-4-氟苯甲醛，乙酰乙酸乙酯，醋酸钠，乙醇，80℃；(ii)N-溴代丁二酰亚胺，四氯化碳，50℃；(iii)亚磷酸三乙酯，160℃；(iv)三甲基溴硅烷，乙腈，80℃；(v)含不同取代基的伯胺，三苯基膦，2,2'-二硫二吡啶，三乙胺，吡啶，60℃；
其中，R同上述通式I中所述；
所述的含不同取代基的伯胺为环丙胺，环丁胺，环戊胺，环己胺，苯胺，苄胺，4-氟苄胺，4-氯苄胺，4-溴苄胺。
本发明所述的二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物的制备方法，具体制备步骤如下：
(1)将2-噻唑甲脒盐酸盐12.22mmol溶于250mL无水乙醇中，下依次加入2-溴-4-氟苯甲醛18.42mmol，乙酰乙酸乙酯12.22mmol，醋酸钠12.22mmol，80℃回流反应6h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去无水乙醇，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，重结晶得到化合物2；
(2)将中间体2 4.71mmol溶于200mL四氯化碳中，缓慢加入N-溴代丁二酰亚胺4.94mmol，50℃回流反应10h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去四氯化碳，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，重结晶得到化合物3；
(3)将中间体3 2.00mmol溶于3mL亚磷酸三乙酯中，160℃加热反应2h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去亚磷酸三乙酯，加入5mL乙酸乙酯拌样，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，重结晶得到化合物4；
(4)将化合物4 2.00mmol溶于50mL乙腈中，冰浴下缓慢加入三甲基溴硅烷10.00mmol，80℃加热回流5h；反应结束后，冷却至室温，加入饱和碳酸氢钠溶液调pH至8,加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并水相，加入1M稀盐酸调pH至1，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩，得到化合物5；
(5)取一10mL圆底烧瓶，将中间体5 0.20mmol溶于3mL吡啶中，加入1.20mmol不同取代的伯胺和2.40mmol三乙胺；另取一10mL圆底烧瓶，将1.40mmol三苯基膦和1.40mmol 2,2'-二硫二吡啶溶于3mL吡啶中，室温搅拌15分钟后加入前一圆底烧瓶中，N2置换，60℃加热反应2h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去吡啶，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，重结晶得到化合物I。
本发明所述的室温为20-25℃。
三、二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物的应用
本发明公开了二氢嘧啶--磷酰胺类衍生物抗HBV活性筛选结果及其作为抗HBV抑制剂的应用。通过实验证明本发明的二氢嘧啶--磷酰胺类衍生物可作为经典的HBV非核苷类抑制剂应用。
如表2所示，对所合成的目标化合物I-(1～9)进行了体外抗HBV活性评价，通过CCK-8法测定了20μM药物浓度下细胞的死亡率；同时，通过PCR法测定了20μM药物浓度下抑制HBV DNA复制活性，选择先导化合物GLS4和上市药物拉米夫定为阳性对照，其中I-6和I-7表现了较好的抑制HBV DNA复制活性。
如表3所示，根据初步筛选的结果，对初筛的目标化合物I-6和I-7进行进一步的体外抗HBV活性评价，通过CCK-8法测定了药物在不同浓度下的细胞毒性；通过PCR法测定了药物在不同浓度下抑制HBV DNA复制活性。选择先导化合物GLS4和上市药物拉米夫定为阳性对照，每个化合物设置五个浓度梯度(50μM、5μM、0.5μM、0.05μM和0.005μM)，分别计算出半数抑制浓度CC50、IC50和选择性系数SI。
本发明的二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物是一类结构新颖的非核苷类HBV抑制剂，可作为抗HBV的先导化合物。
本发明的二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物可作为非核苷类HBV抑制剂应用。具体地说，作为HBV抑制剂用来制备抗乙肝药物。
一种抗HBV药物组合物，包括本发明的二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
本发明公开了二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物、其制备方法、抗HBV活性筛选结果及其作为抗HBV抑制剂的首次应用。实验证明本发明的二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物可作为HBV抑制剂用于制备抗乙肝药物。
具体实施方式
通过下述实例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容，在下列实例中，所有目标化合物的编号与表1相同。
合成路线：
试剂及条件:(i)2-溴-4-氟苯甲醛，乙酰乙酸乙酯，醋酸钠，乙醇，80℃；(ii)N-溴代丁二酰亚胺，四氯化碳，50℃；(iii)亚磷酸三乙酯，160℃；(iv)三甲基溴硅烷，乙腈，80℃；(v)含不同取代基的伯胺，三苯基膦，2,2'-二硫二吡啶，三乙胺，吡啶，60℃；
实施例1.化合物2的制备
取100mL圆底烧瓶，将2-噻唑甲脒盐酸盐(0.50g,3.05mmol)溶于50mL无水乙醇中，室温条件下依次加入2-溴-4-氟苯甲醛(0.93g,4.60mmol)，乙酰乙酸乙酯(600μL,4.60mmol)，乙酸钠(0.50g,6.13mmol)，80℃回流反应6h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去无水乙醇，加入水(60mL)，乙酸乙酯萃取三次(25mL x 3)，合并有机相，饱和食盐水洗一次(25mL)，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结晶得到黄色固体0.75g，收率58％；熔点153-156℃。
化合物2波谱数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.81(d,J＝2.8Hz,1H),7.46(s,1H),7.38–7.28(m,2H),6.97(t,J＝8.2Hz,1H),6.15(s,1H),4.05(q,J＝7.1Hz,2H),2.53(s,3H),1.13(t,J＝7.1Hz,3H)；EI-MS:424.3[M+H]+.
实施例2.化合物3的制备
取100mL圆底烧瓶，将中间体2(0.50g，1.17mmol)溶于50mL四氯化碳中，缓慢加入NBS(0.22g，1.24mmol)，50℃回流反应2h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去四氯化碳，加入水(50mL)，乙酸乙酯萃取(20mL x 3)，合并有机相，饱和食盐水洗一次(25mL)，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结晶得到黄色固体0.35g，收率59％；熔点123-128℃。
化合物3的波谱数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84(d,J＝3.1Hz,1H),7.52(s,2H),7.44–7.35(m,1H),7.32(dd,J＝8.1,2.6Hz,1H),7.02(t,J＝8.0Hz,1H),6.09(s,1H),4.94(d,J＝8.9Hz,1H),4.61(s,1H),4.09(d,J＝7.0Hz,2H),1.16(t,J＝7.1Hz,3H)；EI-MS:502.2[M+H]+.
实施例3.化合物4的制备
取10mL圆底烧瓶，将中间体3(1.00g，2.00mmol)溶于3mL亚磷酸三乙酯中，160℃加热反应2h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去亚磷酸三乙酯，加入5mL乙酸乙酯拌样，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结晶得到黄色固体0.75g，收率67％。
化合物4波谱分析数据：1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.63(s,1H),8.00(d,J＝3.1Hz,1H),7.93(d,J＝3.1Hz,1H),7.57(dd,J＝8.5,2.3Hz,1H),7.46(dd,J＝8.6,6.2Hz,1H),7.24(td,J＝8.5,2.3Hz,1H),6.00(d,J＝2.4Hz,1H),4.10–3.99(m,6H),3.95(q,J＝7.1Hz,2H),1.15-1.25(m,6H),1.04(t,J＝7.1Hz,3H)；EI-MS:560.2[M+H]+.
实施例4.化合物5的制备
取100mL圆底烧瓶，将化合物4(1.12g，2.00mmol)溶于50mL乙腈中，冰浴下缓慢加入三甲基溴硅烷(1.32mL，10.00mmol)，80℃加热回流5h；反应结束后，冷却至室温，加入饱和碳酸氢钠溶液调PH至8，加入水(50mL)，乙酸乙酯萃取(20mL x 3)，合并水相，加入1M稀盐酸调pH至1，加入水(50mL)，乙酸乙酯萃取(20mL x 3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩，得到黄色固体0.65g，收率65％。
化合物5波谱分析数据：EI-MS:504.0[M+H+2]+
实施例5.化合物I-1的制备
取10mL圆底烧瓶，将中间体5(0.10g，0.20mmol)溶于3mL吡啶中，加入环丙胺(82μL，1.20mmol)和三乙胺(330μL，2.40mmol)；另取10mL圆底烧瓶，将三苯基膦(0.36g，1.40mmol)和2,2'-二硫二吡啶(0.31g，1.40mmol)溶于3mL吡啶中，室温搅拌15分钟后加入前一圆底烧瓶中，N2置换，60℃加热反应2h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去吡啶，加入水(50mL)，乙酸乙酯萃取(20mL x 3)，合并有机相，饱和食盐水洗一次(25mL)，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，无水乙醚-正己烷混合溶剂重结晶得到黄色固体0.02g，收率17％。
化合物I-1波谱分析数据：1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.08(s,1H),7.95(d,J＝2.9Hz,1H),7.90(d,J＝2.9Hz,1H),7.61–7.51(m,2H),7.21–7.14(m,1H),6.00(s,1H),4.99(dd,J＝19.0,7.1Hz,2H),3.94(m,3H),3.41(dd,J＝29.3,14.2Hz,1H),2.30(m,2H),1.03(t,J＝7.0Hz,3H),0.52–0.35(m,8H)；EI-MS:582.1[M+H]+.
实施例6.化合物I-2的制备
取10mL圆底烧瓶，将中间体5(0.10g，0.20mmol)溶于3mL吡啶中，加入环丁胺(103μL，1.20mmol)和三乙胺(330μL，2.40mmol)；另取10mL圆底烧瓶，将三苯基膦(0.36g，1.40mmol)和2,2'-二硫二吡啶(0.31g，1.40mmol)溶于3mL吡啶中，室温搅拌15分钟后加入前一圆底烧瓶中，N2置换，60℃加热反应2h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去吡啶，加入水(50mL)，乙酸乙酯萃取(20mL x 3)，合并有机相，饱和食盐水洗一次(25mL)，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，无水乙醚-正己烷混合溶剂重结晶得到黄色固体0.02g，收率16％。
化合物I-2波谱分析数据：1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.92(s,1H),7.95(d,J＝3.0Hz,1H),7.90(d,J＝3.0Hz,1H),7.56(m,,2H),7.26–7.14(m,1H),5.99(s,1H),4.93(td,J＝11.3,5.2Hz,2H),3.94(q,J＝7.1Hz,2H),3.89–3.77(m,1H),3.52(tt,J＝17.3,8.6Hz,2H),3.27(dd,J＝18.7,15.0Hz,1H),2.18–1.93(m,4H),1.92–1.75(m,4H),1.57–1.34(m,4H),1.02(t,J＝7.0Hz,3H)；EI-MS:610.1[M+H]+.
实施例7.化合物I-3的制备
取10mL圆底烧瓶，将中间体5(0.10g，0.20mmol)溶于3mL吡啶中，加入环戊胺(118μL，1.20mmol)和三乙胺(330μL，2.40mmol)；另取10mL圆底烧瓶，将三苯基膦(0.36g，1.40mmol)和2,2'-二硫二吡啶(0.31g，1.40mmol)溶于3mL吡啶中，室温搅拌15分钟后加入前一圆底烧瓶中，N2置换，60℃加热反应2h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去吡啶，加入水(50mL)，乙酸乙酯萃取(20mL x 3)，合并有机相，饱和食盐水洗一次(25mL)，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，无水乙醚-正己烷混合溶剂重结晶得到黄色固体0.02g，收率16％。
化合物I-3波谱分析数据：1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.07(s,1H),7.95(d,J＝3.1Hz,1H),7.89(d,J＝3.1Hz,1H),7.59(dd,J＝8.7,6.3Hz,1H),7.55(dd,J＝8.6,2.5Hz,1H),7.17(td,J＝8.4,2.5Hz,1H),6.00(s,1H),4.41(dd,J＝21.3,11.4Hz,2H),3.94(q,J＝7.1Hz,2H),3.90–3.81(m,1H),3.52–3.39(m,2H),1.83–1.67(m,4H),1.61(m,4H),1.40(m,8H),1.02(t,J＝7.1Hz,3H)；EI-MS:638.2[M+H]+.
实施例8.化合物I-4的制备
取10mL圆底烧瓶，将中间体5(0.10g，0.20mmol)溶于3mL吡啶中，加入环己胺(138μL，1.20mmol)和三乙胺(330μL，2.40mmol)；另取10mL圆底烧瓶，将三苯基膦(0.36g，1.40mmol)和2,2'-二硫二吡啶(0.31g，1.40mmol)溶于3mL吡啶中，室温搅拌15分钟后加入前一圆底烧瓶中，N2置换，60℃加热反应2h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去吡啶，加入水(50mL)，乙酸乙酯萃取(20mL x 3)，合并有机相，饱和食盐水洗一次(25mL)，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，无水乙醚-正己烷混合溶剂重结晶得到黄色固体0.02g，收率15％。
化合物I-4波谱分析数据：1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.10(s,1H),7.95(d,J＝3.1Hz,1H),7.90(d,J＝3.1Hz,1H),7.61–7.52(m,2H),7.16(td,J＝8.4,2.5Hz,1H),5.99(s,1H),4.39–4.23(m,2H),3.96–3.90(m,2H),3.77(dd,J＝17.7,15.0Hz,1H),3.38(dd,J＝14.8,11.0Hz,1H),2.91(m,2H),1.77(m,4H),1.63(m,4H),1.49(m,2H),1.24–1.05(m,10H),1.01(t,J＝7.0Hz,3H)；EI-MS:666.3[M+H]+.
实施例9.化合物I-5的制备
取10mL圆底烧瓶，将中间体5(0.10g，0.20mmol)溶于3mL吡啶中，加入苯胺(110μL，1.20mmol)和三乙胺(330μL，2.40mmol)；另取10mL圆底烧瓶，将三苯基膦(0.36g，1.40mmol)和2,2'-二硫二吡啶(0.31g，1.40mmol)溶于3mL吡啶中，室温搅拌15分钟后加入前一圆底烧瓶中，N2置换，60℃加热反应2h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去吡啶，加入水(50mL)，乙酸乙酯萃取(20mL x 3)，合并有机相，饱和食盐水洗一次(25mL)，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，无水乙醚-正己烷混合溶剂重结晶得到黄色固体0.02g，收率15％。
化合物I-5波谱分析数据：1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.82(s,1H),7.98(m,2H),7.91(d,J＝3.1Hz,1H),7.62(dd,J＝11.9,7.2Hz,2H),7.58–7.47(m,3H),7.15(m,6H),7.00(td,J＝8.4,2.5Hz,1H),6.82(td,J＝8.7,4.3Hz,2H),5.93(d,J＝1.5Hz,1H),4.24(dd,J＝18.8,14.6Hz,1H),3.89–3.74(m,3H),1.01(t,J＝7.0Hz,3H)；EI-MS:654.2[M+H]+.
实施例10.化合物I-6的制备
取10mL圆底烧瓶，将中间体5(0.10g，0.20mmol)溶于3mL吡啶中，加入苄胺(131μL，1.20mmol)和三乙胺(330μL，2.40mmol)；另取10mL圆底烧瓶，将三苯基膦(0.36g，1.40mmol)和2,2'-二硫二吡啶(0.31g，1.40mmol)溶于3mL吡啶中，室温搅拌15分钟后加入前一圆底烧瓶中，N2置换，60℃加热反应2h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去吡啶，加入水(50mL)，乙酸乙酯萃取(20mL x 3)，合并有机相，饱和食盐水洗一次(25mL)，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，无水乙醚-正己烷混合溶剂重结晶得到黄色固体0.02g，收率15％。
化合物I-6波谱分析数据：1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.96(s,1H),7.97(d,J＝3.1Hz,1H),7.92(d,J＝3.1Hz,1H),7.58–7.52(m,2H),7.33(d,J＝7.1Hz,4H),7.27–7.19(m,6H),7.05(td,J＝8.5,2.4Hz,1H),5.99(d,J＝1.3Hz,1H),5.12–5.02(m,2H),4.03(d,J＝9.7Hz,4H),3.88(q,J＝6.9Hz,2H),3.79(dd,J＝18.7,14.6Hz,1H),3.61(dd,J＝18.4,14.7Hz,1H),0.99(t,J＝7.1Hz,3H)；EI-MS:684.2[M+H+2]+.
实施例11.化合物I-7的制备
取10mL圆底烧瓶，将中间体5(0.10g，0.20mmol)溶于3mL吡啶中，加入对氟苄胺(137μL，1.20mmol)和三乙胺(330μL，2.40mmol)；另取10mL圆底烧瓶，将三苯基膦(0.36g，1.40mmol)和2,2'-二硫二吡啶(0.31g，1.40mmol)溶于3mL吡啶中，室温搅拌15分钟后加入前一圆底烧瓶中，N2置换，60℃加热反应2h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去吡啶，加入水(50mL)，乙酸乙酯萃取(20mL x 3)，合并有机相，饱和食盐水洗一次(25mL)，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，无水乙醚-正己烷混合溶剂重结晶得到黄色固体0.02g，收率14％。
化合物I-7波谱分析数据：1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.92(s,1H),7.96(d,J＝3.1Hz,1H),7.92(d,J＝3.1Hz,1H),7.58–7.49(m,2H),7.35(t,J＝6.0Hz,4H),7.11–7.01(m,5H),5.98(s,1H),5.12(td,J＝11.3,7.0Hz,2H),4.05–3.94(m,4H),3.88(q,J＝7.1Hz,2H),3.69(ddd,J＝51.1,18.5,14.7Hz,2H),0.99(t,J＝7.1Hz,3H)；EI-MS:718.3[M+H]+.
实施例12.化合物I-8的制备
取10mL圆底烧瓶，将中间体5(0.10g，0.20mmol)溶于3mL吡啶中，加入对氯苄胺(146μL，1.20mmol)和三乙胺(330μL，2.40mmol)；另取10mL圆底烧瓶，将三苯基膦(0.36g，1.40mmol)和2,2'-二硫二吡啶(0.31g，1.40mmol)溶于3mL吡啶中，室温搅拌15分钟后加入前一圆底烧瓶中，N2置换，60℃加热反应2h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去吡啶，加入水(50mL)，乙酸乙酯萃取(20mL x 3)，合并有机相，饱和食盐水洗一次(25mL)，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，无水乙醚-正己烷混合溶剂重结晶得到黄色固体0.02g，收率13％。
化合物I-8波谱分析数据：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.92(s,1H),7.96(d,J＝3.2Hz,1H),7.93(d,J＝3.2Hz,1H),7.57–7.50(m,2H),7.34(dd,J＝8.6,3.4Hz,4H),7.27(dd,J＝8.3,5.4Hz,4H),7.08(td,J＝8.5,2.7Hz,1H),5.98(d,J＝2.0Hz,1H),5.18(ddt,J＝10.6,7.2,4.7Hz,2H),4.05–3.95(m,4H),3.88(q,J＝7.1Hz,2H),3.79–3.59(m,2H),0.99(t,J＝7.1Hz,3H)；EI-MS:750.2[M+H]+.
实施例13.化合物I-9的制备
取10mL圆底烧瓶，将中间体6(0.10g，0.20mmol)溶于3mL吡啶中，加入对溴苄胺(152μL，1.20mmol)和三乙胺(330μL，2.40mmol)；另取10mL圆底烧瓶，将三苯基膦(0.36g，1.40mmol)和2,2'-二硫二吡啶(0.31g，1.40mmol)溶于3mL吡啶中，室温搅拌15分钟后加入前一圆底烧瓶中，N2置换，60℃加热反应2h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去吡啶，加入水(50mL)，乙酸乙酯萃取(20mL x 3)，合并有机相，饱和食盐水洗一次(25mL)，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，无水乙醚-正己烷混合溶剂重结晶得到黄色固体0.02g，收率12％。
化合物I-9波谱分析数据：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.92(s,1H),7.96(d,J＝3.2Hz,1H),7.93(d,J＝3.2Hz,1H),7.57–7.49(m,2H),7.41(dd,J＝8.1,5.6Hz,4H),7.27(dd,J＝8.4,3.6Hz,4H),7.08(td,J＝8.5,2.7Hz,1H),5.97(d,J＝2.0Hz,1H),5.25–5.11(m,2H),3.98(q,J＝8.4Hz,4H),3.87(q,J＝7.0Hz,2H),3.79–3.60(m,2H),0.99(t,J＝7.1Hz,3H)；EI-MS:838.2[M+H]+.
实施例14.目标化合物的体外抗HBV细胞活性筛选试验
测试原理
HBV转染的肝癌细胞HepG2.2.15细胞株，在进行细胞培养时能够分泌HBV病毒颗粒(包含病毒DNA)。在抗HBV目标化合物的干预下，细胞产生的DNA会有所变化，因此检测细胞产生的HBV DNA，参照未加药对照组的含量，可以反映样品药物的抗病毒活性作用。以拉米夫定为阳性对照药，用聚合酶链反应(PCR)检测药物抑制HBV DNA复制量的50％时的浓度数值IC50；运用CCK-8检测样品药物导致50％细胞毒性死亡的数值浓度为CC50值；并计算出待测化合物的“选择系数”(selectivity index)，计算公式：SI＝CC50/IC50。
测试方法
(1)细胞毒性实验
配成实验所需样品储备浓度(100μmol/L)，每个样品用HepG2.2.15细胞培养液配制2个稀释浓度(20μmol/L和5μmol/L)进行初步活性筛选，设立空白对照，并以拉米夫定作为的阳性对照药。加入96孔板细胞培养板，每浓度设置3个复孔，每4天换同浓度药液并设无药细胞对照组，共培养9天。用CCK-8法检测细胞存活率，确定药物对HepG2.2.15细胞的毒性。对活性好的化合物用HepG2.2.15细胞培养液配制5个稀释浓度(50μmol/L和5μmol/L、0.5μmol/L、0.05μmol/L、0.005μmol/L)，设立空白对照并以拉米夫定作为的阳性对照药。加入96孔板细胞培养板，每浓度设置3个复孔，每4天换同浓度药液并设无药细胞对照组，共培养9天。用CCK-8法检测细胞存活率，确定药物对HepG2.2.15细胞的毒性。
(2)抑制HBV DNA合成实验(PCR方法)
HepG2 2.2.15细胞在96孔细胞培养板中培养24小时后，加入所配20μmol/L和5μmol/L含药培养液，继续培养8天(每4天换液一次)，收集上清液，用探针法进行PCR检测。
表2.目标化合物抑制HBV DNA复制及细胞毒性的初步评价
如表2所示，对所合成的9个化合物进行了体外抗HBV活性评价，通过CCK-8法测定了20μM浓度下细胞的死亡率；同时，通过PCR法测定了20μM药物浓度下抑制HBV DNA复制活性。
初步活性筛选结果表明，化合物的细胞毒性随着R基团体积的增大而增大。在20μM浓度下，化合物I-3、I-4、I-8、I-9都表现了较大的细胞毒性，且大部分化合物抑制HBV DNA复制活性的抑制率大于50％，与拉米夫定的活性相当。其中，目标化合物I-6和I-7抑制HBVDNA复制活性的抑制率最高(83.6±1.4；90.1±0.7)，且毒性相对较小，可以进一步活性研究。
表3.活性化合物、先导化合物GLS4和上市药物拉米夫定抗HBV活性
如表3所示，根据初步筛选的结果，对初筛的目标化合物I-6和I-7进行进一步的体外抗HBV活性评价，通过CCK-8法测定了药物在不同浓度下的细胞毒性；通过PCR法测定了药物在不同浓度下抑制HBV DNA复制活性。选择先导化合物GLS4和上市药物拉米夫定为阳性对照，每个化合物设置五个浓度梯度(50μM、5μM、0.5μM、0.05μM和0.005μM)，分别计算出半数抑制浓度CC50、IC50和选择性系数SI。
活性结果表明，化合物I-6和I-7表现出了显著的抗HBV活性，特别是I-7，其IC50值为6.45±4.38μM，可作为新结构类型的化合物供进一步研究。
Claims (7)
1.二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物，其特征在于，是具有如下通式I所示的结构：
其中，
R为含3-6个碳原子的环烷基、苯环、含或不含卤素的苄基。
2.如权利要求1所述的二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物，其特征在于，通式I中，R为环丙烷，环丁烷，环戊烷，环己烷，苯环，苄基，卤素取代的苄基。
3.如权利要求2所述的二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物，其特征在于，是具有下列结构的化合物之一：
4.如权利要求1或2所述的二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物的制备方法，步骤包括：首先以化合物2-噻唑甲脒盐酸盐、2-溴-4-氟苯甲醛和乙酰乙酸乙酯为起始原料，通过“一锅法”环合得到关键中间体2，在四氯化碳溶液中，中间体2与N-溴代丁二酰亚胺发生溴代反应得到重要中间体3，中间体3与亚磷酸三乙酯通过Abuzov反应得到化合物4，在乙腈溶液中，化合物4与三甲基溴硅烷发生水解反应得到重要中间体5，最后，中间体5再与含不同取代基的伯胺缩合得到目标化合物I；
合成路线如下：
试剂及条件:(i)2-溴-4-氟苯甲醛，乙酰乙酸乙酯，醋酸钠，乙醇，80℃；(ii)N-溴代丁二酰亚胺，四氯化碳，50℃；(iii)亚磷酸三乙酯，160℃；(iv)三甲基溴硅烷，乙腈，80℃；(v)含不同取代基的伯胺，三苯基膦，2,2'-二硫二吡啶，三乙胺，吡啶，60℃；
其中，R同权利要求1或2的通式I中所述；
所述的含不同取代基的伯胺为环丙胺，环丁胺，环戊胺，环己胺，苯胺，苄胺，4-氟苄胺，4-氯苄胺，4-溴苄胺。
5.如权利要求4所述的二氢嘧啶-磷酰胺类衍生物的制备方法，步骤如下：
(1)将2-噻唑甲脒盐酸盐12.22mmol溶于250mL无水乙醇中，下依次加入2-溴-4-氟苯甲醛18.42mmol，乙酰乙酸乙酯12.22mmol，醋酸钠12.22mmol，80℃回流反应6h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去无水乙醇，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，重结晶得到化合物2；
(2)将中间体2 4.71mmol溶于200mL四氯化碳中，缓慢加入N-溴代丁二酰亚胺4.94mmol，50℃回流反应10h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去四氯化碳，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，重结晶得到化合物3；
(3)将中间体3 2.00mmol溶于3mL亚磷酸三乙酯中，160℃加热反应2h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去亚磷酸三乙酯，加入5mL乙酸乙酯拌样，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，重结晶得到化合物4；
(4)将化合物4 2.00mmol溶于50mL乙腈中，冰浴下缓慢加入三甲基溴硅烷10.00mmol，80℃加热回流5h；反应结束后，冷却至室温，加入饱和碳酸氢钠溶液调pH至8,加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并水相，加入1M稀盐酸调pH至1，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩，得到化合物5；
(5)取一10mL圆底烧瓶，将中间体5 0.20mmol溶于3mL吡啶中，加入1.20mmol不同取代的伯胺和2.40mmol三乙胺；另取一10mL圆底烧瓶，将1.40mmol三苯基膦和1.40mmol 2,2'-二硫二吡啶溶于3mL吡啶中，室温搅拌15分钟后加入前一圆底烧瓶中，N2置换，60℃加热反应2h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去吡啶，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，重结晶得到化合物I。
6.权利要求1-3任一项所述的化合物在制备抗HBV的药物中的应用。
7.一种抗HBV药物组合物，包含权利要求1-3任一项所述化合物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
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