CN108998365B - 无菌快速检测装置、药品及食品无菌快速检测方法 - Google Patents

Abstract

一种无菌快速检测装置及快速检测方法，即在罐体上，与罐体一体成型有一伸向罐体内部的空心管柱；在管柱的底部设置有一顶部设有弹性封堵的采样针；在采样针上方，预置有一个开口向下的封堵有橡胶塞的真空采样管。该快速检测装置无菌消毒后，在全封闭无菌环境下，将被检测物注入罐体内并注入培养基，过滤、富集、培养，数小时后，用力向下按压真空采样管，采样针穿过其顶部的橡胶封堵、真空采样管底部的橡胶塞，伸入真空采样管内，被检测液体经采样针被吸入真空采样管内。取样结束后，拔出真空采样管，采样针顶部的弹性封堵随拔出的真空采样管同步恢复弹性，将采样针封堵住，保证罐体内的原液不被污染；然后，将提取的样品进行RNA快速检测。

Description

无菌快速检测装置、药品及食品无菌快速检测方法

技术领域

本发明涉及一种用于药品及食品无菌快速检测的装置，以及利用该装置进行的药品及食品无菌快速检测方法。本发明属于药品及食品安全性监督无菌检查方法及耗材领域。

背景技术

根据2015年版《中国药典》的规定，所有食品、药品在出厂前均需要进行无菌检测，无菌检测合格后，方可投放市场。目前，各生产厂家的通常做法是：在无菌环境下，将被检测批次的药品或食品注入如图1A和图1B所示的培养器中，进行微生物富集，然后加入培养基进行培养，按国家药典规定的温度培养14天。培养期间要逐日观察并记录是否有菌生长。若不能从外观上判断有无微生物生长，还需取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。这种检测方法的弊端：1、方法繁琐。2、检测周期长，至少需要14天，甚至更长时间，严重地影响制药企业的生产效率，资金周转。

尽管现在有各种快速检测方法，在确定有活细菌存在的问题上是可靠的，但不能排除特别是药品及食品检测过程中受外界污染的可能性，无法完全避免产生假阳性。

发明内容

鉴于上述原因，本发明的目的是提供一种无菌快速检测装置。该无菌快速检测装置在不脱离原先的无菌培养模式和药典认可的无菌封闭环境培养技术范畴内，可实现封闭取样，且对原液无污染，保证检测结果的可靠性，避免产生假阳性。

本发明的另一目的是提供一种利用该无菌快速检测装置进行药品及食品无菌快速检测的方法。该方法在全封闭无菌环境下进行RNA快速检测，活细菌检测的裂解步骤都在封闭取样的封闭的真空采样管中进行，确保在获取RNA过程中无外源性微生物影响。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种无菌快速检测装置，它包括底座，设置在底座上的罐体，在罐体内的底部铺设有用于富集微生物的微孔滤膜，在罐体的底面上设有出液口，在罐体的顶面设有用于注入被检测药品及食品和培养基的可密封的透气盖，在透气盖的下方铺设有用于过滤杂质的过滤膜；

在所述罐体上，与罐体一体一次成型有一个空心的管柱，该管柱伸向罐体内部；在管柱的底部设置有一个插入罐体内的采样针；

在距离所述采样针顶部1-2mm处，采样针的侧壁上开设有一个侧孔，在采样针的顶部设有弹性封堵，该弹性封堵将采样针的顶部及侧孔封堵住；

在所述管柱内，所述采样针的上方，预置有一个开口向下的真空采样管；该真空采样管的开口处封堵有橡胶塞，在橡胶塞的外面设有塑料压盖。

在本发明优选实施例中，在所述管柱的内侧壁上设有一限位槽，在所述真空采样管的外侧壁上设有与该限位槽配合的限位机构。

所述采样针的顶部为尖的。

本发明还提供了一种利用前述无菌快速检测装置进行药品及食品无菌快速检测的方法，它包括如下步骤：

1)富集：取待检样品，在无菌环境下，使用如权利要求1-3任一项所述的无菌快速检测装置对待检样品中的微生物进行富集；

2)培养：在经步骤1)富集有微生物的罐体中加入培养基，截去管路，放入培养箱中进行静置培养；

由于待检样品性质不同，培养的时间差异较大，培养时间可以从3小时到24小时，如富营养的大输液样品中的微生物繁殖会很快，而抗生素样品中微生物在培养初期会由于受到抗生素的抑制而活性恢复需要一定的时间，几个小时的培养无法大量增殖需要延长到十几小时或者一天以上，因此培养时间根据不同待检样品性质会有一定的跨度；

3)取样：下压上述无菌快速检测装置的真空取样管，推动采样针顶部的弹性封塞，使得采样针的侧孔在真空采样管中外露，在外界大气压的作用下，将所述无菌快速检测装置罐体中的培养基吸入预置的真空采样管中；达到取样量后，上拔真空采样管，随着真空采样管的拔出，采样针顶部的弹性封堵同步恢复，封住采样针顶部及侧孔，完成无菌取样；

本发明使用无菌快速检测装置，由于培养和取样部分同时消毒灭菌，保证取样无污染，当第一次取样后，弹性封堵迅速封堵采样针和侧孔，该结构使得罐体内不会进入外来污染，可以保证多次取样也不受到污染；

4)检测：取培养基1-3mL，进行细菌的RNA检测。

所述RNA检测的方法为：a)两步法检测RNA、b)一步法检测RNA，或c)免RNA检测法。

所述步骤1)中待检样品取样量为按照药典或食品行业相关检测标准进行取样。

所述步骤2)中培养基为药典或食品行业相关检测标准规定的培养基，静置培养温度按照药典或食品行业相关检测标准规定的温度进行培养。

本发明的优点：

1、本发明提供的无菌快速检测装置在不脱离原先的无菌培养模式和药典认可的无菌封闭环境培养技术范畴内，可实现封闭取样，且对原液无污染，抽取的样液能真实地反应罐体1内待检测的药品及食品样品的真实状态，保证检测结果的可靠性，准确性，避免产生假阳性。

2、本发明提供的无菌快速检测的方法在全封闭无菌环境下进行RNA快速检测，活细菌检测的裂解步骤都在封闭取样的封闭的真空采样管中进行，确保在获取RNA过程中无外源性微生物影响，检测速度快，检测结果真实、可靠。

附图说明

图1A和图1B为现有的无菌检测培养器结构示意图。

图2为本发明无菌快速检测装置结构示意图。

图3为图2中A部分局部放大图。

图4为本发明俯视图。

图5为本发明两步法检测细菌RNA中采用27f和1492r引物对进行PCR时在不同温度下的电泳结果图。

图6为本发明两步法检测细菌RNA中采用357f和519r引物对进行PCR时在不同温度下的电泳结果图。

图7为本发明两步法检测细菌RNA中采用357f和907r引物对进行PCR时在不同温度下的电泳结果图。

图8为本发明两步法检测细菌RNA中采用926f和1100r引物对进行PCR时在不同温度下的电泳结果图。

图9为本发明一步法RT-qPCR采用357f和519r引物进行荧光定量的曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的结构及特征进行详细说明。需要说明的是，可以对此处公开的实施例做出各种修改，因此，说明书中公开的实施例不应该视为对本发明的限制，而仅是作为实施例的范例，其目的是使本发明的特征显而易见。

如图2所示，本发明提供的无菌快速检测装置包括底座1，设置在底座上的罐体2，在罐体内的底部铺设有用于富集微生物的微孔滤膜3，在罐体的底面上设有出液口4，在罐体的顶面设有用于注入待检测样品(例如药品、食品)和培养基的可密封的透气盖5，在透气盖5的下方铺设有用于过滤杂质的过滤膜6。

如图2和图3所示，本发明在罐体2上，与罐体一体一次成型有一个空心的管柱7，管柱7伸向罐体内部。在管柱7的底部设置有一个插入罐体内的采样针8。在采样针的顶部设有弹性封堵81，在距离采样针顶部1-2mm处，采样针的侧壁上开设有一个侧孔82。正常状态，该弹性封堵81将采样针顶部及侧孔封堵住。

在管柱7内，采样针的上方，预置有一个开口向下的真空采样管9。真空采样管9的开口处封堵有橡胶塞91，在橡胶塞的外面设有塑料压盖92。

为防止真空采样管9从管柱7内滑脱，如图4所示，本发明在管柱7的内侧壁上设有一限位槽71，相应地，在真空采样管9的外侧壁上设有与限位槽71配合的限位机构93(例如凸块)。真空采样管9外侧壁上的限位机构93容置在管柱7内侧壁上的限位槽71内。

在本发明制造时，即将采样针8和真空采样管9放置在罐体1的管柱7内，并和罐体1一起消毒，封装，备用。使用时，在全封闭无菌环境下，撕开包装，将待检测的药品及食品样品注入罐体1内，进行微生物富集，再注入培养基，进行培养。

经计算，有些微生物，如大肠杆菌每20分钟繁殖一代，一个细菌5小时后即可繁殖出32768个，在100毫升的培养液中，每毫升培养液中有327个作用的细菌，经过离心将培养液浓缩至10微升，就可以在显微镜下观察到细菌的存在。

故，在全封闭无菌环境下，将待检测的药品及食品样品及培养基注入罐体1内，培养5小时后，用力向下按压真空采样管9，采样针8的顶部穿过采样针顶部的弹性封堵81、真空采样管底部的压盖92和橡胶塞91，伸入真空采样管9内，罐体1内的液体经采样针的侧孔82被吸入真空采样管9内。取样结束后，拔出真空采样管9，随拔出的真空采样管9采样针8顶部的弹性封堵81恢复弹性，将采样针8的顶部及侧孔封堵住，从而保证罐体1内的原液不被污染。

由于真空采样管9、采样针8连同罐体1一并经过无菌消毒、封装，整个取样操作过程也是在全封闭无菌环境下完成的，故，真空采样管9抽取的样液能真实地反应罐体1内待检测的药品及食品样品的真实状态，从而，保证检测结果的可靠性，准确性，避免产生假阳性。

当第一次取样后，弹性封堵迅速封堵采样针顶部及其侧孔，该结构使得罐体内不会进入外来污染，可以保证多次取样对原液也无污染。

将真空采样管9中的样液放到显微镜下观察。如果显微镜下观察，看到微生物，那么说明此批样品不合格，不必再对该批药品及食品进行培养，观察，彻底销毁即可，提高药品及食品生产企业的生产效率，解决企业的资金周转问题。

如果显微镜下没有看到任何微生物，那么说明此批药品及食品还有进一步培养、观察的必要，继续培养，每隔5小时，再次取样观察，如果显微镜下观察，看到微生物，那么说明此批样品不合格，不必再对该批药品及食品进行培养，观察，彻底销毁即可。如果显微镜下仍然没有看到任何微生物，则继续培养、观察，直至药典规定的培养期结束。

为便于真空采样管9取样，所述采样针8的顶部可设计成尖状。

利用本发明公开的无菌快速检测装置进行药品及食品无菌快速检测方法如下：

实施例1无菌取样

为了完全模拟食品药品取样，这里以大肠杆菌作为待检样品微生物，使用本发明公开的无菌快速检测装置进行富集培养。

1)富集：取1个大肠杆菌，在无菌环境下，使用无菌快速检测装置的滤器对大肠杆菌待检样品中的微生物进行截留、富集；

2)培养：在经步骤1)富集有微生物的罐体中加入培养基，截去管路，放入培养箱中进行静置培养12-24小时；

3)取样：下压上述的无菌快速检测装置的真空取样管，推动采样针上的弹性封堵，使得采样针上部的侧孔在真空采样管中外露，在外界大气压的作用下，将所述无菌快速检测装置罐体中的培养基吸入预置的真空采样管中；达到取样量后，上拔真空采样管，随着真空采样管的拔出，采样针顶部的弹性封堵同步恢复，封住采样针顶部及侧孔，完成无菌取样。

实施例2两步法检测细菌RNA

1.细菌RNA提取

1)取1mL实施例1的培养样品加入到1.5mLEP管中，800～1200rpm室温离心5min(本实施例中采用1200rpm)，弃上清，收集沉淀。

2)向沉淀中加入1mL Trizol，吹打重悬菌液，常温下静置5min。

3)加入三氯甲烷200μL，剧烈震荡15s，然后常温静置2-3min。

4)4℃，10,000g离心15min，取上清转移至另一干净EP管中，上清中加入等体积(约600μl)异丙醇，混匀，然后常温下静置10min。

5)4℃，10,000g离心10min后，此时可见管底白色沉淀，弃上清，加入1ml预冷的无水乙醇清洗沉淀。

6)4℃，7500g离心5min，弃上清，再加入1ml预冷的无水乙醇清洗沉淀，清洗后小心倒出无水乙醇，沉淀在空气中干燥。

7)加入4μl RNAase-free ddH₂0，反复吹打混匀。

8)测RNA浓度，结果备用。

2.RNA-cDNA逆转录

RNA 1μg加水至12μL，65℃孵育5min(金属浴)，冰上2min，瞬时离心后，置冰上。

制备逆转录反应体系如表1所示：

表1

名称	体积
		5×reaction Buffer	4μL
RNA抑制剂(RI)	1μL
		dNTP mix	2μL
逆转录酶	1μL
		模板	1-2μL
加水补足到	20μL

逆转录反应条件如表2所示：

表2

温度	时间
		25℃	5min
42℃	60min
		70℃	5min
4℃	保温

3.PCR检测

将逆转录的产物进行PCR反应，PCR仪为BIO-RAD MyCycler^TM Thermal Cycler，PCR反应体系如表3所示：

表3

名称	体积
		2×mix	10μL
template(逆转录产物)	1μL
		Primers	0.5μL×2
PCR水	8μL
		Total	20μL

PCR反应条件如表4所示：

表4

所用引物对(Primers)如表5所示：

表5

为了检测不同退火温度对于RT-PCR的影响，因此，分别选取55.0℃，55.7℃，56.9℃，58.7℃，61.1℃，63.0℃，64.2℃，65.0℃进行PCR。

4.电泳：根据产物片段的大小，制备1～2％琼脂糖凝胶进行分析。

如图5所示为引物27f和1492r的PCR电泳结果图，其中1-8分别对应退火温度为55.0℃，55.7℃，56.9℃，58.7℃，61.1℃，63.0℃，64.2℃，65.0℃的PCR结果，M为DNAmarker。

如图6所示为引物357f和519r的PCR电泳结果图，其中1-8分别对应退火温度为55.0℃，55.7℃，56.9℃，58.7℃，61.1℃，63.0℃，64.2℃，65.0℃的PCR结果，M为DNAmarker。

如图7所示为引物357f和907r的PCR电泳结果图，其中1-8分别对应退火温度为55.0℃，55.7℃，56.9℃，58.7℃，61.1℃，63.0℃，64.2℃，65.0℃的PCR结果，M为DNAmarker。

如图8所示为引物926f和1100r的PCR电泳结果图，其中1-8分别对应退火温度为55.0℃，55.7℃，56.9℃，58.7℃，61.1℃，63.0℃，64.2℃，65.0℃的PCR结果，M为DNAmarker。

通过不同退火温度来确定最佳PCR反应条件。

通过图5-8可以看出，采用实施例1的1个大肠杆菌存在的情况下，通过短时扩增，采用本实施例的方法即可检出。

其中如图5所示的第一对引物对(引物27f和1492r)在温度为55.0℃，55.7℃，56.9℃，58.7℃，61.1℃，63.0℃时可以得到较为清晰的条带，而64.2℃，65.0℃时可以隐约看到条带，而其中55.0℃时条带最为清晰，可以作为PCR反应的最优条件。

如图6所示的第二对引物对(引物357f和519r)在温度为55.0℃，55.7℃，56.9℃，58.7℃，61.1℃，63.0℃，64.2℃，65.0℃时均可以得到较为清晰的条带，因而可以选择任一温度作为PCR反应的条件。

如图7所示的第三对引物对(引物357f和907r)在温度为55.0℃，55.7℃，56.9℃，58.7℃时可以得到较为清晰的条带，而在61.1℃，63.0℃，64.2℃，65.0℃时基本看不到条带，因此可以选择55.0℃，55.7℃，56.9℃，58.7℃作为PCR反应的条件。

如图8所示的第四对引物对(引物926f和1100r)在温度为55.0℃，55.7℃，56.9℃，58.7℃，61.1℃，63.0℃时可以得到较为清晰的条带，而在64.2℃，65.0℃时基本看不到条带，因此可以选择55.0℃，55.7℃，56.9℃，58.7℃，61.1℃，63.0℃作为PCR反应的条件。

通过上述比较可以得到不同引物对和不同PCR反应条件下对微生物的反应灵敏度，说明本发明采用的检测方法的灵敏性和可靠性。

实施例3一步法RT-qPCR检测

同样对实施例1中培养样品进行检测，一步法RT-qPCR反应在StepOne^TM实时荧光定量PCR系统中进行，使用Power Green RNA-to-CT^TM 1-Step Kit(ABI公司)，按照使用手册进行操作。

RT-qPCR反应体系如表6所示：

表6

RT-qPCR反应条件如表7所示：

表7

定量分析结果如表8所示：

表8

序号	模板量×109cfu/ml	Ct值(Mean±SD)
			1	0.22	26.18±0.20
2	0.55	25.11±0.55
			3	1.1	23.36±0.07

对应曲线图如图9所示，从图9中可以看出在实施例1中1个大肠杆菌存在的情况下，通过短时扩增，采用本实施例的方法即可检出，说明本发明采用的检测方法的灵敏性和可靠性。

实施例4免RNA提取法

该方法使用北京田恩泽基因科技有限公司的免RNA提取RT-PCR试剂盒，并按使用手册进行操作。

1.裂解

1)取1ml培养基液，800～1200rpm(本实施例中使用1200rpm)，5min室温离心。弃上清。

2)加入40μl新鲜配制的裂解液，轻柔吹打约10次(不要起气泡)，37℃放置30分钟裂解细菌。

3)70℃10分钟灭活裂解液中的DNase，所得40μL细胞裂解液可以直接用于下一步的逆转录步骤，或者放-80℃长期保存。

2.逆转录

配制逆转录混合反应液(RT Mix)，如表9所示：

表9

名称	体积
		随机引物(0.2μg/μl)	0.50μl
MMLV逆转录酶(含RI)	3.00μl
		RNase-free水	加水至10.00μl

1)取10μL RT Mix加至40μL细胞裂解液中。

2)轻柔混匀后短暂离心。

3)放入PCR仪中，42℃90分钟，然后94℃变性5分钟。

4)所得cDNA可以立即用于后续的PCR或荧光定量PCR，或者放-20℃长期保存一年。

3.PCR反应

配制PCR反应体系30μL：

PCR反应体系如表10所示

表10

名称	体积
		PCR MgicMix 3.0	15.00μL
PCR引物1(10uM)27f	1.00μL
		PCR引物2(10uM)1492r	1.00μL
RNase-free水	12.00μL
		合计	29.00μL
逆转录产物	1.00μl(轻柔混合均匀后，最后加入)

放入PCR仪中进行PCR反应，反应条件如表11所示：

表11

反应引物采用表5中任一引物对即可。PCR结束后取5μL反应产物进行电泳检查。当电泳泳道中无条带时，即表示待检样品无菌，是合格产品；当电泳泳道中有条带时，即表示待检样品中含有活菌，是不合格产品。

上述实施例可基于RNA的快速检测，将细菌培养扩增和RNA的扩增相结合，实现药品中可能的活细菌RNA的倍增，提高检测灵敏度。有限时间的无菌培养，将药品中可能存在的微生物进行扩增到RNA可提取限度，再进行RNA扩增实验。由于在食品药品生产中也有灭菌环节，因此在食品药品出厂后会含有已经杀灭的细菌(死菌)，而本发明采用RNA检测而非DNA检测，正是避免食品药品中原有的死菌对检测结果的影响，只有含有在食品药品中的活菌才可以被检出。

从上述实施例可以看出，本申请提供一种无菌快速检测装置，以及以该装置进行的食品药品快速无菌检测方法，可快速准确地检测出视频药品中是否遭到的微生物污染，可将药典中规定的14天缩短到1-3天，从而大大减轻食企药企的检测负担，由于该装置始终处于无菌状态，其检测结果真实可信。

SEQUENCE LISTING

<110> 牛刚

王华山

<120> 无菌快速检测装置、药品及食品无菌快速检测方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tacggttacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctcctacggg aggcagcag 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaattaccgc ggcggctg 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccgtcaattc ctttaagttt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaactcaaag gaattgacgg 20

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gggttgcgct cgttg 15

Claims (7)

1.一种无菌快速检测装置，它包括底座，设置在底座上的罐体，在罐体内的底部铺设有用于富集微生物的微孔滤膜，在罐体的底面上设有出液口，在罐体的顶面设有用于注入被检测药品及食品和培养基的可密封的透气盖，在透气盖的下方铺设有用于过滤杂质的过滤膜；其特征在于：

在所述罐体上，与罐体一体一次成型有一个空心的管柱，该管柱伸向罐体内部；在管柱的底部设置有一个插入罐体内的采样针；

在距离所述采样针顶部1-2mm处，采样针的侧壁上开设有一个侧孔，在采样针的顶部设有弹性封堵，该弹性封堵将采样针的顶部及侧孔封堵住；

在所述管柱内，所述采样针的上方，预置有一个开口向下的真空采样管；该真空采样管的开口处封堵有橡胶塞，在橡胶塞的外面设有塑料压盖。

2.根据权利要求1所述的无菌快速检测装置，其特征在于：在所述管柱的内侧壁上设有一限位槽，在所述真空采样管的外侧壁上设有与该限位槽配合的限位机构。

3.根据权利要求2所述的无菌快速检测装置，其特征在于：所述采样针的顶部为尖的。

4.一种利用权利要求1-3任一项所述的无菌快速检测装置进行药品及食品无菌快速检测方法，其特征在于：它包括如下步骤：

1)富集：取待检样品，在无菌环境下，使用如权利要求1-3任一项所述的无菌快速检测装置对待检样品中的微生物进行富集；

2)培养：在经步骤1)富集有微生物的罐体中加入培养基，截去管路，放入培养箱中进行静置培养；

3)取样：下压权利要求1-3任一项所述的无菌快速检测装置的真空取样管，推动采样针顶部的弹性封塞，使得采样针的侧孔在真空采样管中外露，在外界大气压的作用下，将所述无菌快速检测装置罐体中的培养基吸入预置的真空采样管中；达到取样量后，上拔真空采样管，随着真空采样管的拔出，采样针顶部的弹性封堵同步恢复，封住采样针顶部及侧孔，完成无菌取样；

4)检测：取培养基1-3mL，进行细菌的RNA检测。

5.如权利要求4所述的药品及食品无菌快速检测方法，其特征在于，所述RNA检测的方法为：a)两步法检测RNA、b)一步法检测RNA，或c)免RNA检测法。

6.如权利要求4所述的药品及食品无菌快速检测方法，其特征在于，所述步骤1)中待检样品取样量为按照药典或食品行业相关检测标准进行取样。

7.如权利要求4所述的药品及食品无菌快速检测方法，其特征在于，所述步骤2)中培养基为药典或食品行业相关检测标准规定的培养基，静置培养温度按照药典或食品行业相关检测标准规定的温度进行培养。