CN108992444A - 盐酸安罗替尼在制备治疗肺纤维化疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，提供了盐酸安罗替尼的一种新用途，具体为在制备治疗肺纤维化疾病药物中的应用，还提供了一种药物组合物，包含盐酸安罗替尼及盐酸安罗替尼在药学上可接受的盐、酯、水合物或它们的组合以及辅料。本发明中盐酸安罗替尼对肺纤维化有良好的功效，无不良反应，可减缓博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化，为治疗、缓解或改善肺纤维化疾病提供良好的应用前景。

Description

盐酸安罗替尼在制备治疗肺纤维化疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种盐酸安罗替尼的新用途，具体涉及盐酸安罗替尼在制备治疗肺纤维化疾病药物中的应用。

背景技术

随着环境污染问题的加剧，空气质量不断下降，雾霾增多，导致肺部疾病发病率持续升高。肺纤维化(pulmonaryfibrosis，PF)是许多病因各异的肺间质疾病的终末期临床表现，是以肺泡持续性损伤、成纤维细胞增殖及大量细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)沉积，从而导致肺泡和肺间质出现不同程度的炎症和纤维化，进而导致肺结构破坏和呼吸衰竭，所以也称间质性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)或弥漫性实质性肺疾病(diffuse parenchymal lung disease，DPLD)。

特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)属于间质性肺疾病(ILDs)家族中的特发性间质性肺炎(IIP)组。IPF是一种病因不明的最常见的而且最严重的慢性炎症性间质性肺疾病，临床上表现为进行性呼吸困难伴刺激性干咳，病情常持续进展，中位生存期约为2.8年，5年生存率不足50％，患者多死于呼吸衰竭和继发肺部感染。世界各地均有报道，近年来其发病率呈不断上升趋势且无明显地理和种族差别，多为中老年人，常在50～70岁发病，儿童发病罕见。鉴于大量的临床情况，IPF的患病率和发病率很难估计，100000中有15-250的概率发生，根据国家、年龄、性别不同，每年有34000个新发病例。目前肺移植是唯一可延长肺纤维化患者生存期的治疗手段，特发性肺纤维化诊断和治疗中国专家共识指南推荐的IPF药物治疗主要包括吡非尼酮、尼达尼布、抗酸药物、N-乙酰半胱氨酸，其中获批的有效治疗IPF的药物仅有吡非尼酮、尼达尼布。虽然这些药物可以延缓肺功能下降速度，但不能逆转病情进展，而且相当一部分患者对治疗反应欠佳，其具体药理机制尚未完全清楚。因此阐明肺纤维化的发生发展机制，探索新的潜在的药物靶点，开发出针对肺纤维化的疗效确认、相对安全、价格合理的药物具有重要的社会意义和医学意义。

尽管目前对于肺纤维化的发病机制尚不十分明确，但有证据表明，细胞因子在肺纤维化的发生发展中起着关键作用，它们之间相互调控、相互制约，构成了复杂的细胞因子网络，共同参与肺纤维化进程。而TGF-β1是现在已知最强的促ECM积聚诱导因子，是肺纤维化形成的关键因子，是目前研究的最为深入、作用最重要的细胞因子，已被大多数学者公认为是参与肺纤维化进展的关键性细胞因子，参与肺纤维化发生发展的多个环节。在IPF患者中，TGF-β1主要由肺巨噬细胞、肺泡上皮细胞等分泌，可通过依赖Smad和非依赖Smad的方式诱导肺泡上皮细胞发生上皮间质转化，刺激成纤维细胞增殖，促进肌成纤维细胞形成以及胶原的产生。其中主要是以依赖Smad的方式发挥作用，TGF-β1与肺成纤维细胞膜上的TGF-βⅠ型受体(TGF-βRⅠ)、TGF-βⅡ型受体(TGF-βRⅡ)结合形成三聚体复合物，细胞内TGF-β1的下游信号通路Smads家族蛋白信号转导通路被激活，Smad2、3被磷酸化，活化的Smad2、3与TGF-βRⅠ受体分离转而同Smad4结合形成三聚体，共同迁移到细胞核，间接或直接与靶基因结合以调节TGF-β1因子的转录活性。同时激活核内ECM成分如纤维黏连蛋白、胶原等启动子的活性，从而促进ECM成分的合成。

盐酸安罗替尼，是一种新型小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，能够有效抑制VEGFR、PDGFR、FGFR、c-Kit等激酶，具有抗肿瘤血管生成和抑制肿瘤生长的作用，2018年5月获CFDA批准上市，用于治疗晚期非小细胞肺癌。截至目前，尚无盐酸安罗替尼可减缓肺纤维化的相关报道。盐酸安罗替尼的结构式如下：

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提供一种盐酸安罗替尼的新用途，即盐酸安罗替尼在制备治疗肺纤维化疾病药物中的应用。

进一步的，所述盐酸安罗替尼是在制备治疗特发性肺纤维化药物中的应用。

进一步的，所述盐酸安罗替尼可抑制TGF-β1/Smad3信号通路。

进一步的，所述盐酸安罗替尼的动物实验用量为3mg/kg，细胞实验用药浓度为100nmol/l、200nmol/l或300nmol/l。

本发明还提供一种药物组合物，包含盐酸安罗替尼及盐酸安罗替尼在药学上可接受的盐、酯、水合物或它们的组合以及辅料。

进一步的，所述药物组合物选自片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、气雾剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂、注射剂、糖浆剂、酒剂、酊剂、露剂、膜剂或它们的组合。

进一步的，所述药物组合物的给药方式包括口服、注射、植入、外用、喷雾、吸入或它们的组合。

进一步的，所述药物组合物是采用常规或特殊制剂工艺制备而成的。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

本发明提供了一种盐酸安罗替尼的新用途，即盐酸安罗替尼在制备治疗肺纤维化疾病药物中的应用。本发明中盐酸安罗替尼对肺纤维化有良好的功效，无不良反应，可减缓博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化，为治疗、缓解或改善肺纤维化疾病提供良好的应用前景。

附图说明

图1为荧光素酶报告基因检测(Luciferase assay)法检测盐酸安罗替尼抑制TGF-β1/Smad3信号表达的结果；

图2为蛋白质印迹法(Western Blot)检测盐酸安罗替尼抑制TGF-β1诱导的Smad3磷酸化结果；

图3为盐酸安罗替尼给药组小鼠体重变化图；

图4为盐酸安罗替尼改善博来霉素诱导后小鼠肺功能参数图；

图5为盐酸安罗替尼减少博莱霉素诱导后小鼠肺部胶原含量(*，p<0.05，即统计学上具有显著性差异)；

图6为盐酸安罗替尼减少博莱霉素诱导后小鼠肺纤维化面积。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例一：在小鼠胚胎肺成纤维细胞系(NIH3T3)中，盐酸安罗替尼梯度依赖性抑制TGF-β1/Smad3信号通路。

萤光素酶基因检测法(Luciferase assay)：利用实验室已成功构建的稳定转染TGF-β1/Smad3信号通路报告基因质粒的CAGA-NIH3T3细胞系检测盐酸安罗替尼对TGF-β1/Smad3信号通路的影响。待CAGA-NIH3T3细胞汇合度达80％左右时将其铺于96孔板内，待96孔板中的细胞达到80％左右则将含有10％FBS的DMEM换成含1‰FBS的DMEM。适当时间后，将原培养基弃掉，加盐酸安罗替尼(浓度为100nmol/l、200nmol/l、300nmol/l)和TGF-β1(5ng/ml)共同刺激18h。弃掉原培养基，用PBS洗后加入细胞裂解液，每孔50μl，加后震摇30min。将上述裂解液转至白板对应孔中，每孔转35μl，转后加入40μl底物进行检测，检测结果如图1所示，结果显示盐酸安罗替尼可以梯度依赖性抑制TGF-β1/Smad3信号通路的表达。

蛋白质印迹法(Western blot)：当NIH3T3细胞汇合度达到80％～90％时，加入盐酸安罗替尼(浓度为100nmol/l、300nmol/l)作用2h后，加入TGF-β1(5ng/ml)刺激30min。使用蛋白裂解液提取蛋白质，然后样品加入适量4×Loading buffer，100℃煮3min，SDS-PAGE电泳后电转移至PVDF膜上。5％脱脂奶粉室温封闭2h，分别加入1：1 000p-Smad3、1：2000GAPDH一抗，4℃反应过夜，TBST洗涤3次，每次10min，加入1∶3 000辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2h，TBST洗涤3次，每次10min，利用化学发光成像仪得到曝光条带，如图2所示，结果显示盐酸安罗替尼可梯度依赖性抑制TGF-β1诱导的Smad3磷酸化。

实施例二：盐酸安罗替尼减缓博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化。

动物模型制备：雄性C57BL/6J，(周龄8-10周)野生型小鼠，以10％水合氯醛按0.5ml/100g给予小鼠腹腔注射麻醉，气管内有创注射2U/Kg博莱霉素。具体实施方式如下：麻醉小鼠后称重记录，将小鼠固定于操作台，颈部用70％酒精消毒，用手术刀在小鼠颈部垂直划开大约1cm长创口，利用显微镊分离组织暴露气管，将注射器经气管软骨环间隙朝向心端刺入气管，然后按2U/kg的计量缓慢注入与其体重相适应体积的博莱霉素生理盐水溶液，立即将动物直立并左右旋转，使药液在肺内均匀分布。空白对照组注射同体积的生理盐水(0.9％Nacl)。

分组给药：盐酸安罗替尼治疗是指在博莱霉素处理第7-14天时，每天通过灌胃给予小鼠3mg/kg盐酸安罗替尼，以相应溶剂生理盐水作为对照，博莱霉素处理14天后检测肺胶原含量及纤维化严重程度。

肺功能检测：在博来霉素注射第14天时，10％水合氯醛按腹腔注射麻醉小鼠(0.5ml/100g)，取仰卧位固定于操作台，剪开颈部皮毛，暴露气管，并钝性分离气管，于气管近头部处剪一切口，将插管的气管接头处插入气管，并用棉线固定，转移小鼠至体描仪平台，连接呼吸机与气管接头，记录小鼠的用力肺活量(FVC)、0.1秒用力呼气量(FEV0.1)、肺动态顺应性(Cydn)等肺功能指标的变化，如图4所示，检测结果显示盐酸安罗替尼给药后，FVC、FEV0.1、Cydn有所增加，证明该药可改善博来霉素小鼠的肺功能。

肺胶原含量检测：即羟脯氨酸含量测定，是指在博莱霉素注射第14天处死小鼠，分离小鼠右肺，放入5ml安培瓶，120℃烘箱烘干，盐酸水解后调整PH至6.5-8.0，过滤残渣，加入PBS调整总体积为10ml，取50μL样品，加入350μL去离子水，加入200μL氯胺T(ChloramineT)溶液室温孵育20分钟，加入200μL高氯酸(perchloric acid)室温孵育5分钟，加入200μL对二甲氨基苯甲醛(P-DMAB)65℃孵育20分钟。取200μL至96孔板中测定样品570nm的吸光值，利用标准品读数绘制标准曲线，进而根据标准曲线所得公式求得所测样品羟脯氨酸浓度Cs。按以下公式换算为全部右肺所含羟脯氨酸的量W:W＝Cs×8(所测样品稀释倍数)×10(样品总体积)。

博莱霉素(2U/Kg)处理小鼠诱导肺纤维化发生后，灌胃给予小鼠3mg/kg盐酸安罗替尼或相对应的溶剂生理盐水，小鼠在博莱霉素处理14天后取肺组织观察纤维化严重程度，造模对照试剂为生理盐水。盐酸安罗替尼组小鼠自给药后体重开始缓慢回升(见图3)，且与给予生理盐水的小鼠相比，肺功能有所改善(见图4)。此外，盐酸安罗替尼组小鼠的肺组织中羟脯氨酸含量明显降低(表1，图5)，这说明盐酸安罗替尼能够减轻博莱霉素所诱导的胶原含量。对小鼠肺组织切片进行H&E染色(图6A所示，标尺:100μm)，并对肺组织切片进行纤维化的定量统计(图6B，*，p<0.05，即统计学上具有显著性差异。)，发现盐酸安罗替尼组的小鼠肺纤维化程度和肺纤维化面积均明显低于生理盐水组小鼠(图6)。

表1盐酸安罗替尼抑制博莱霉素诱导的羟脯氨酸含量(微克/右肺)

对照组	博来霉素组	盐酸安罗替尼组
			273.72±10.26	395.58±18.62	301.65±17.57384

表2盐酸安罗替尼抑制博莱霉素诱导的肺纤维化(百分比)

博来霉素组	盐酸安罗替尼组
		36.88±8.92	6.67±0.83

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.盐酸安罗替尼在制备治疗肺纤维化药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述盐酸安罗替尼是在制备治疗特发性肺纤维化药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述盐酸安罗替尼可抑制TGF-β1/Smad3信号通路。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述盐酸安罗替尼的动物实验用量为3mg/kg，细胞实验用药浓度为100nmol/l、200nmol/l或300nmol/l。

5.一种药物组合物，其特征在于：包含盐酸安罗替尼及盐酸安罗替尼在药学上可接受的盐、酯、水合物或它们的组合以及辅料。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物选自片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、气雾剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂、注射剂、糖浆剂、酒剂、酊剂、露剂、膜剂或它们的组合。

7.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的给药方式包括口服、注射、植入、外用、喷雾、吸入或它们的组合。

8.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物是采用常规或特殊制剂工艺制备而成的。