CN108977546A - ncRNA在制备与静脉内平滑肌瘤病相关产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了ncRNA在制备静脉内平滑肌瘤病预防、诊断或治疗产品中的应用。本发明进一步公开了上述2种基因的试剂、试剂盒和药物。本发明通过转录组测序发现了2种与静脉内平滑肌瘤病的相关的基因，并研究其在静脉内平滑肌瘤病早期检测及早期治疗中的应用前景；为进一步研究静脉内平滑肌瘤病的病因发病机制，探索静脉内平滑肌瘤病早期防治的药物靶点提供了新的方向。

Description

ncRNA在制备与静脉内平滑肌瘤病相关产品中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，具体涉及ncRNA在制备与静脉内平滑肌瘤病相关产品中的应用。
背景技术
静脉内平滑肌瘤病(Intravenous leiomyomatosis，IVL)是一种罕见的具有独特特点的平滑肌源性肿瘤，多影响育龄女性，呈侵袭性在静脉系统内生长，可突入子宫或盆腔的静脉内，经髂静脉或卵巢静脉延伸、扩展至下腔静脉，约10％累及心脏，造成严重的循环障碍甚至出现晕厥或猝死，IVL的治疗主要依靠外科手术，如手术切除不彻底，术后可复发。
目前尚无准确的IVL发病率统计。随着医学技术的进步和人们认识的提高，其诊断病例数近年来有升高趋势。协和医院作为全国疑难杂病中心，具有多科协作的传统和综合优势，逐步形成了对IVL病例资源的富集。自2002底诊断首例IVL以来，吸引了全国各地转诊患者，诊断病例数逐年快速递增，并有继续升高的趋势。目前已对180余例IVL病患的约220例次手术标本进行了明确病理诊断，其中不乏范围广泛、累及心脏甚至到达肺部的病例。
由于缺乏特异性临床症状、疾病罕见认识不充分，存在较多漏诊、误诊。目前CT、MRI以及超声等影像学手段尚不能发现IVL早期病变，即便在侵入较大的静脉时也很难与子宫内膜间质肿瘤、子宫平滑肌肉瘤(Leiomyosarcoma，LMS)等其他肿瘤进行鉴别，目前尚无法对IVL进行术前明确诊断。IVL的组织学表现多样，各种平滑肌瘤的组织学形态均可以出现，单纯组织形态学有时很难与子宫平滑肌瘤(Leiomyoma，LM)等进行鉴别，其确诊目前主要依靠术后全面细致的病理取材发现侵入静脉内的肿瘤部分，而由于认识水平等因素，在术后病理诊断阶段仍然容易发生漏诊、误诊。特别是目前对累及脉管系统不明显、甚至尚未侵入静脉系统的IVL早期病变还没有特征性形态学特点或特异性标志物进行有效识别，并且随着妇产科微创手术的开展，对病理标本大体结构破坏较重、大大增加了病理医师大体取材时识别IVL的难度，甚至有时送检组织破碎不整、大体结构被完全破坏，无法识别IVL病变而明显增加误诊、漏诊风险。现有的研究成果还无法对IVL的预后进行预测，更缺乏指导治疗的特异性分子指标。因而探寻IVL分子特征成为准确诊断、早期诊断、及早合理防治的重点，具有非常重要的临床意义。特别是IVL主要发生在育龄妇女，如果能够利用特异性标志物在剔除甚至活检组织中进行诊断，对有保留生育要求的病人意义更加重大。
目前关于IVL的文献基本上都是描述性个案报道和关于临床病理情况的总结。由于病例罕见，缺乏对内在分子改变的研究，仅有2个研究小组做了初步遗传学研究。其中波士顿的一个研究小组2002年和2003年相继对2例IVL进行了核型分析研究，发现2例均具有der(14)t(12；14)(q15；q24)的遗传学异常[7,8]。2014年耶鲁大学的研究小组利用CGH的方法对9例IVL进行了研究，发现了不同的拷贝数变异。由于病例数量少、难以获得组织标本、所用方法的内在限制等原因，目前尚缺乏对IVL进行全面详尽、多角度的分子改变的研究。
人类基因组编码大量的小非编码蛋白质的RNA(ncRNA)转录物。已经描述了多种ncRNA类型，包括高丰度转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核RNA(snRNA)及与piwi相互作用的RNA(piRNA)(Amaraletal.,2008；Martens-Uzunova et al.,2013)。miRNA通过与靶mRNA结合而起到翻译阻遏物的作用，其中，miRNA在有足够的序列互补性的位点与靶mRNA结合(Ameres et al.,2007)，而高度丰富的细胞质Y RNA通过影响Ro蛋白的亚细胞定位而在RNA质量控制中起作用(Simetal.,2009)。除了在确定的亚细胞定位处沉默逆转录转座子的piRNA外，其它类型的ncRNA(包括siRNA和内源siRNA(endo-siRNA))都有成熟miRNA对mRNA翻译的抑制活性(Chuma和Pillai,2009)。miRNA活性依赖于在细胞质中的足够的丰度水平，以及与位于核内体膜(endosomal membrane)的RNA诱导的沉默复合物(RISC)的相互作用(Gibbings et al.,2009；Lee et al.,2009a)，而低丰度的miRNA对翻译抑制的影响较小。因此，某一miRNA水平的细微变化可能已经影响了细胞过程，而强烈的扰动可以引起疾病。除丰度外，与(RISC)蛋白质和RNA伴侣的相互作用及正确的亚细胞定位也是控制miRNA生理机能的相关因素(Mullokandov et al.,2012；Wee et al.,2012)。
因此，现有技术中需要诊断、治疗或抑制静脉内平滑肌瘤的更加有效的方法和产品。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于非编码RNA在制备与静脉内平滑肌瘤病相关产品中的应用。
本发明首先提供了ncRNA在制备与静脉内平滑肌瘤病相关产品中的应用。
本发明中所述ncRNA选自转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、snoRNA、微小RNA(miRNA)、siRNA、小核(snRNA)、Y RNA、穹窿体RNA、反义RNA和piwiRNA(piRNA)。
优选的，所述ncRNA为HOXD-AS2和PGM5-AS1基因，所述HOXD-AS2和PGM5-AS1基因在静脉内平滑肌瘤病中表达上调。
优选的，所述预防、诊断或治疗产品包括检测试剂、基因芯片、试剂盒或药物。
优选的，所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测HOXD-AS2和/或PGM5-AS1基因转录水平的针对HOXD-AS2和/或PGM5-AS1基因的寡核苷酸探针。
优选的，所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
进一步地，本发明提供一种静脉内平滑肌瘤病检测制剂，所述检测制剂包括HOXD-AS2和/或PGM5-AS1基因的特异性引物和/或探针。
进一步地，本发明提供了一种静脉内平滑肌瘤病检测试剂盒，所述试剂盒包含特异性扩增静脉内平滑肌瘤病相关ncRNA的引物和说明书，所述静脉内平滑肌瘤病相关ncRNA是HOXD-AS2和/或PGM5-AS1基因。
优选的，所述特异性扩增HOXD-AS2基因引物具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述特异性扩增PGM5-AS1引物具有SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
优选的，所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBR Green荧光染料。
进一步地，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含HOXD-AS2抑制剂、PGM5-AS1抑制剂和药物可接受的辅料。
优选的，所述的抑制剂包括HOXD-AS2或PGM5-AS1核酸的反义RNA、siRNA、shRNA或HOXD-AS2或PGM5-AS1基因的功能抑制剂。
在本发明中，所述RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学研究方面具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易下调或沉默任何目的基因的表达。
为了确保基因能够被高效剔除或沉默，根据基因的ncRNA序列设计了siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则(Elbashir et.al 2001，Schwarz et.al2003，Khvorova et.al 2003，Reynolds et.al 2004，Hsieh et.al 2004，Ui-Tei et.al2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgram of WhiteheadInstitute(BingbingYuan et.al 2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITROGEN(winner of the 2004Frost&SullivanExcellence in Research Award，https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具的优点来设计用于筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对(NCBI BLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。
更进一步地，本发明提供了所述的抑制剂在制备预防或治疗静脉内平滑肌瘤病的药物组合物中的应用。
优选的，所述的药物组合物包括HOXD-AS2和/或PGM5-AS1抑制剂作为活性成分，和药学上可接受的载体。
优选的，所述药学上可接受的载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。
本发明的药物还可与其他治疗静脉内平滑肌瘤病的药物联用，多种药物联合使用可以大大提高治疗的成功率。
本发明的药物可以使用不同的添加剂进行制备，例如稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。
稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。
表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。
添加剂缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。
本发明的药物还可包括药学上可接受的涂层材料包括(但不限于)，快速分解涂层材料、染色剂、肠溶性聚合物、增塑剂、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散剂。常见快速分解涂层材料包括OPADRY；肠溶性聚合物包括甲基内烯酸聚合物、磷羟丙甲基纤维素苯二甲酸酯、羟丙甲基纤维素乙酸酯、羟丙甲基纤维素琥珀酸酯、羟甲乙基纤维素、乙酰磷苯二甲酸纤维素；增塑剂包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。
本发明药物的单位剂型可以使多种形式，代表性的剂型包括固体剂型如片剂、丸剂、粉剂、干粉剂、颗粒、胶囊等；液态剂型如溶液、悬浮液、乳状液、糖浆、酏剂等。
本发明所述药物可以通过任何途径给予受体，只要能达到目标组织，其可通过口服或非口服的多种途径，如口服给药、鼻内给药、腹腔内给药、肌内给药、皮下给药、皮内给药、肺内给药、直肠内给药、静脉内给药。
有益效果
本发明通过转录组测序发现了2种与静脉内平滑肌瘤病的相关的基因，并研究其在静脉内平滑肌瘤病早期检测、预防或治疗中的应用前景；为进一步研究静脉内平滑肌瘤病的病因发病机制，探索静脉内平滑肌瘤病早期防治的药物靶点提供了新的方向。
附图说明
图1为本发明HOXD-AS2和PGM5-AS1基因在RT-PCR中的IVL病例组中的表达水平。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法。
本发明的发明人对5例IVL新鲜组织样本及5例自身正常平滑肌对照的新鲜组织样本进行全转录组测序，结合生物信息学方法进行筛选，挑选出候选HOXD-AS2和PGM5-AS1基因，现有研究中并没有HOXD-AS2和PGM5-AS1基因与IVL相关的报道，进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，证实了HOXD-AS2和PGM5-AS1基因在IVL表达上调，其相关产品可用于预防、诊断或治疗IVL相关疾病。
在本发明的上下文中，“HOXD-AS2基因”包括HOXD-AS2基因以及HOXD-AS2基因的任何功能等同物的多核苷酸。HOXD-AS2基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中HOXD-AS2基因(Gene ID:100506783)RNA序列具有70％以上同源性序列。
在本发明的上下文中，“PGM5-AS1基因”包括PGM5-AS1基因以及PGM5-AS1基因的任何功能等同物的多核苷酸。PGM5-AS1基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中PGM5-AS1基因(Gene ID:572558)RNA序列具有70％以上同源性序列。
实施例1样品的收集和样品资料的整理
获取自2016年3月至2017年5月于北京协和医院接受IVL手术的5例患者的静脉内平滑肌瘤的新鲜组织样本和5例自身正常平滑肌对照的新鲜组织样本。所有患者术前均未接受化疗或放疗，术前已取得患者的知情同意，并通过伦理委员会审核。
样本处理：所有样本均经病理学检查证实，编号后置-80℃低温冰箱保存。
实施例2样本RNA提取
采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
①加入Trizol，室温保存5分钟；
②加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；
③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；
④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mL Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；
⑥RNA完整性及纯度检测
完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：1.2％胶；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15min)检测完整性。RNA样本中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度：OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA样品，OD260/OD280比值(10mM Tris,ph7.5)在2.0左右。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris,ph7.5溶液中测定出的OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，在水溶液中所测定读数可能在1.5-1.9之间，但这并不代表RNA不纯。
浓度：去一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度(ng/μL)＝OD260×n(稀释倍数)×40。
实施例3RNA-seq测序文库构建与质检
1、数据质量评估
cDNA文库的构建及测序，委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成。10个样品的测序数据经过测序错误率检查、GC含量分布检查及原始数据过滤，获得后续分析使用的clean reads，数据汇总。通常认为RNA-seq数据进行不同文库间的基因差异表达分析，库总读段数至少为10M，数据整体GC含量保持在40％-60％，Q30在80％以上则为合理。本次测序所获数据中clean bases占7.2G以上，Q2碱基占95.18％以上，Q3碱基占89.15％以上，GC含量在样本间保持稳定，在54.29％-56.80％之间，说明整体测序质量良好，满足下游分析质量需求。
2、比对结果分析
将10个样品的clean reads用STAR软件比对到参考基因组序列，平均每个样品的比对率达到92.51％以上，Uniquely mapping rate是指比对到基因组单一位置的reads数占总clean reads数的百分比，只有Uniquely mapped reads才能用于表达量统计，本研究中参考基因组单一位点的平均比对率为76.956％。
3、定量结果分析
3.1定量结果说明
本研究一共测了10个样本，每个样本平均产出6Gb数据。将测序reads比对到参考基因组并重构转录本之后，根据FPKM表达量计算得到10个样品中所有的基因的表达水平。随后，我们用bowtie将reads比对到基因上，每个样本平均检测到11552个基因。
对每个样本分别进行基因水平或转录本水平定量，再合并得到所有样本的表达矩阵，第一列为基因或转录本ID，其余列为各样本的原始readcount值。
3.2表达水平分布
RNA-seq的基因表达值通常用RPKM或FPKM表示。RPKM用于单端测序，FPKM用于双端测序，先对测序深度进行校正，再对基因或转录本的长度进行校正。
3.3相关性分析
我们要求生物学重复样品间R2至少要大于0.8，否则需要对样品做出合适的解释，或者重新进行实验。根据各样本所有基因的表达值(RPKM或FPKM)，计算组内及组间样本的相关性系数，绘制成热图，可直观显示组间样本差异及组内样本重复情况。样本间相关性系数越高，其表达模式越为接近。
4、差异结果分析
基因差异分析的输入数据为基因定量中得到的原始readcount数据。本研究采用DESeq2软件对正常组及INL组进行对比分析，筛选正常组与IVL组。最终共筛选出4748个差异表达基因，经过聚类分析、GO功能富集和KEGG信号通路功能富集分析，发明人筛选到IVL标记物为HOXD-AS2和PGM5-AS1基因，所述基因在IVL中为上调基因。
实施例4 IVL患者样本中HOXD-AS2和/或PGM5-AS1基因表达情况
1.实验材料
获取自2010年1月至2018年4月于我院接受IVL手术的35例患者的静脉内平滑肌瘤新鲜样本组织、20例相对正常的新鲜样本。所有患者术前均未接受化疗或放疗，术前已取得患者的知情同意，并通过伦理委员会审核。
样本处理：所有样本均经病理学检查证实，编号后置-80℃低温冰箱保存。
2.样本RNA的提取
参照实施例2。
3.逆转录合成cDNA
3.1第一链cDNA合成试剂盒(RevertAid Premium Reverse Transcriptase)(Thermo Scientific TMEP0733)
3.2 cDNA第一链合成
(1)在冰浴的nuclease-free PCR管中加入以下试剂：
total RNA XμL
Random Primerp(dN)6(100pmol) 1μL
dNTP Mix(0.5mM final concentration)) 1.0μL
Rnase-free ddH2O 定容至14.5μL
(2)轻轻混匀后离心3～5s，反应混合物在65℃温浴5min后，冰浴2min，然后离心3～5s。
(3)将试管冰浴，再加入下列试剂：
4.0μL 5*RT Buffer
0.5μL Thermo Scientific RiboLock RNase Inhibitor(20U)
1.0μL RevertAid Premium Reverse Transcriptase(200U)
(4)轻轻混匀后离心3～5s
(5)在PCR仪上按照下列条件进行反转录反应
①25℃孵育10min
②cDNA合成50℃ 30min
③终止反应85℃ 5min，处理后，置于冰上放置
(6)将上述溶液-20℃保存。
4.Real-Time PCR
引物设计
采用在线引物设计软件Primer-BLAST设计引物，在NCBI数据库中利用各基因的ncRNA序列设计引物，内参选GAPDH，引物设计后由上海生工公司合成。具体引物序列如下：
表1 Real-Time PCR引物序列
操作过程如下：
(一)反应体系：用Power Green PCR MasterMix进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃3min预反应，进行45个循环(95℃3s，60℃30s)的扩增反应。
表2 Real-Time PCR反应体系
组分 加入量
2×mix 10μL
上游引物(10μM) 0.4μL
下游引物(10μM) 0.4μL
模板 2μL
加入灭菌蒸馏水 至20μL
(二)样品Real-Time PCR检测
将各样品cDNA 10倍稀释后取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
5.实验结果
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高。样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增。根据qRT-PCR的相对定量公式，比较2种基因在IVL病例组和对照组中的表达水平。结果如图1显示：qRT-PCR扩增结果稳定，HOXD-AS2和PGM5-AS1基因在IVL病例组中的表达水平分别为对照组织的1.79、2.1倍。该结果也证明了转录组测序得到的差异基因HOXD-AS2和PGM5-AS1在IVL高表达的结果，为基因快速早期筛查IVL提供了可能。
实施例5检测试剂盒的制作
基于实施例4得到的引物，组装本发明所述用于IVL检测的试剂盒，所述试剂盒包括特异扩增HOXD-AS2和PGM5-AS1基因的引物对如表1所示；具体为：
1、试剂盒一包括特异性扩增HOXD-AS2的引物对：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；
2、试剂盒二包括特异性扩增PGM5-AS1的引物对：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；
3、试剂盒三包括特异性扩增HOXD-AS2和PGM5-AS1的引物对：SEQ ID NO:1和SEQID NO:2以及SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；
本发明的试剂盒还包括特异扩增管家基因(GAPDH)的引物对：SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示；还包括SYBR Green聚合酶链式反应体系，如PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs。所述PCR缓冲液的成分为25mM KCl，2.5mM MgCl2，200mM(NH4)2SO4。通过对引物浓度和退火温度的优化，最终确定反应体系如表3所示：
表3 PCR反应体系
组分 加入量
SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μL
上游引物(10μM) 0.5μL
下游引物(10μM) 0.5μL
模板cDNA 2.0μL
加入灭菌蒸馏水 至25μL
最佳反应条件为：95℃预变性5min，(95℃变性15sec，60℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40个循环，72℃延伸15min。
为方便使用，试剂盒还可包含对照：HOXD-AS2和PGM5-AS1基因的正常cDNA样本。
取受检者生物学样本，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从生物学样本中提取RNA，使用试剂盒中试剂，按照最佳反应体系与条件进行PCR反应，使用试剂盒中正常cDNA作为Real-Time PCR定量检测中的对照cDNA，检测受试者生物学样本中HOXD-AS2和/或PGM5-AS1基因的表达量相对正常cDNA的表达量变化。
本发明的试剂盒的价值在于通过最精简和特异的引物对检测基因的表达情况，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高诊断IVL的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导早期诊断和更有效的个体化治疗。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国医学科学院北京协和医院
<120> ncRNA在制备与静脉内平滑肌瘤病相关产品中的应用
<130> p18058
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaatgtagg ggagcagccg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgcctagtg gattacagca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcagagtcg gagaagagtc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agacggcttc agtggttgtc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatgggcagc cgttaggaaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcgcccaata cgaccaaatc 20

Claims (10)

1.ncRNA在制备静脉内平滑肌瘤病预防、诊断或治疗产品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ncRNA选自转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、snoRNA、微小RNA(miRNA)、siRNA、小核(snRNA)、Y RNA、穹窿体RNA、反义RNA和piwiRNA(piRNA)。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述ncRNA为HOXD-AS2和PGM5-AS1基因，所述HOXD-AS2和PGM5-AS1基因在静脉内平滑肌瘤病中表达上调。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述预防、诊断或治疗产品包括检测试剂、基因芯片、试剂盒或药物。
5.一种静脉内平滑肌瘤病检测制剂，其特征在于，所述检测制剂包括HOXD-AS2和/或PGM5-AS1基因的特异性引物和/或探针。
6.一种静脉内平滑肌瘤病检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性扩增静脉内平滑肌瘤病相关ncRNA的引物和说明书，所述静脉内平滑肌瘤病相关ncRNA是HOXD-AS2和/或PGM5-AS1基因。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增HOXD-AS2基因引物具有SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述特异性扩增PGM5-AS1引物具有SEQIDNO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
8.如权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBR Green荧光染料。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含HOXD-AS2抑制剂、PGM5-AS1抑制剂和药物可接受的辅料。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述的抑制剂包括HOXD-AS2或PGM5-AS1核酸的反义RNA、siRNA、shRNA或HOXD-AS2或PGM5-AS1基因的功能抑制剂。
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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