CN108977500A - ctDNA建库试剂盒和建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子基因学领域，具体涉及一种ctDNA建库试剂盒和建库方法；包括发卡接头A、双链接头B和引物组；所述发卡接头A包括接头A1和接头A2，接头A1和接头A2的序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，且接头A2的3′端用生物素修饰；所述双链接头B包括接头B1和接头B2，接头B1和接头B2的序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；所述引物组包括扩增引物和接头引物，扩增引物的序列号为SEQ ID NO.5，接头引物的序列为SEQ ID NO.6‑7；本发明提供的试剂盒灵敏度高，能提高ctDNA测序通量和测序准确性。
Description
技术领域
本发明属于分子基因学领域，具体涉及一种ctDNA建库试剂盒和建库方法。
背景技术
ctDNA，即循环肿瘤DNA，是体内循环肿瘤细胞和肿瘤组织在细胞代谢时留在血浆中的残留物。科学研究发现，利用测序技术对ctDNA进行高通量分析，即可根据基因突变信息来指导抗肿瘤药物选用、疗效评估、预后判断，甚至早期发现和早期诊断。然而，血浆中的ctDNA浓度极低，且多为小片段分子，提取困难，丢失量大，检测灵敏度低，这为测序文库的制备带来了挑战。目前市场上ctDNA建库的方法是在双链DNA末端补平加A，然后再加接头进行扩增。然而，由于ctDNA的高度片段化特点，导致部分ctDNA无法补平加接头，造成了ctDNA的损耗，使一些基因突变位点无法被检测到，限制了检测灵敏度。
申请号为CN201710116455.3的专利申请，试图通过单链连接酶解连接接头决上述问题，虽然提高了一定的检测灵敏度，但是单链连接酶对单链DNA分子具有很强的环化作用，并且单链连接酶连接时对DNA单链末端存在碱基偏好性由强到弱依次为T>A>G>C，从而影响了检测灵敏度，因此仍然需要更加行之有效的方案以弥补现有技术的不足。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种高灵敏性的ctDNA建库的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种ctDNA建库试剂盒，包括发卡接头A、双链接头B和引物组；
所述发卡接头A包括接头A1和接头A2，接头A1和接头A2的序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，且接头A2的3′端用生物素修饰；
所述双链接头B包括接头B1和接头B2，接头B1和接头B2的序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
所述引物组包括扩增引物和接头引物，扩增引物的序列号为SEQ ID NO.5，接头引物的序列为SEQ ID NO.6-7。
所述SEQ ID NO.1-7所示的引物如下表所示：
上述技术方案产生的有益效果在于：上述试剂盒提供了构建ctDNA文库需要的接头和特异性引物，可高效的制备用于illumina等测序平台的ctDNA文库，提高ctDNA测序通量和测序准确性。
本发明的另一个目的是利用上述试剂盒构建ctDNA文库的方法，包括如下步骤：
(1)提取游离ctDNA片段；
(2)对ctDNA片段进行去磷酸化与变性反应；
(3)将步骤(2)中的产物和T4DNA连接酶、发卡接头A混合进行接头连接反应，并进行纯化；
(4)将步骤(3)中的产物和引物混合进行退火和延伸反应，并进行纯化；
(5)将步骤(4)中的产物和T4DNA连接酶、双链接头B混合进行接头连接反应，并进行纯化、洗脱；
(6)将步骤(5)中的产物和接头引物混合进行PCR扩增，得到ctDNA文库。
DNA文库制备是高通量测序的核心环节，文库的产量与质量直接决定了测序数据的产量与质量。
附图说明
图1是本发明的建库方法原理图；
具体实施方式
为进一步说明本发明公开的技术方案，以下通过2个实施例来说明：
实施例1：ctDNA建库试剂盒
本发明提供了一种ctDNA建库试剂盒产品，在试剂盒中包括有：
用于连接和标识变性后的单链ctDNA的发卡接头A，所述发卡接头A包括接头A1和接头A2，且接头A2的3′端用生物素修饰；
用于连接单链ctDNA和发卡接头A或双链接头B的T4DNA连接酶和用于T4DNA连接酶的缓冲液；
用于连接双链ctDNA的双链接头B，所述双链接头B包括接头B1和接头B2；
用于扩增ctDNA的扩增引物CL130和用于扩增文库分子以进行文库检测的接头引物IS7和IS8：
其中，所述发卡接头A由如下方法制得：
对如下体系进行PCR，95℃反应10s，然后以0.1℃/s降温到14℃，得到双链接头A。
所述双连接头B由如下方法制得：
对如下体系进行PCR，95℃反应10s，然后以0.1℃/s降温到14℃，得到双链接头B。
反应体系如下：
所述试剂盒还包括如下试剂：
缓冲A液(50ml):
缓冲B液(50ml):
严谨性洗脱缓冲液(50ml):
49.5ml 灭菌蒸馏水
250μl 20％(wt/vol)SDS
250μl 20×SSC buffer；
终止液(100μl):
98μl 0.5M EDTA(pH8.0)
2μl Tween20；
TE缓冲液(50ml):
49.4ml 灭菌蒸馏水
500μl 1M Tris-Hcl(PH8.0)
100μl 0.5M EDTA(PH8.0)；
TET缓冲液(50ml):
在使用中为了更加进一步增加试剂盒的便易性，在试剂盒中还可以添加如下成分：10×T4RNA ligation buffer，2％Tween，Fast AP，PEG-8000(50％)，T4DNA ligase，100mM ATP，5×Klenow reaction buffer，dNTP mix(25mM each)，Extension primerCL130(100μM)，1％Tween-20，10×T4DNA ligation buffer，PEG-4000(50％)，Library，Mix。
实施例2：
一种ctDNA建库的方法，包括如下步骤：
(1)提取游离ctDNA片段
根据QIAGEN公司提供的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(50)试剂盒的使用说明书，使用该试剂盒对血浆中游离的ctDNA进行提取，得到ctDNA。
(2)对ctDNA片段进行去磷酸化与变性反应
向PCR管中加入如下成分：
使用PCR仪，先37℃反应10min，然后95℃反应2min；
取出PCR管，迅速将其放入到冰水混合物中，冰浴至少1min，取出后离心，室温保存，得到去磷酸化与变性后的ctDNA。
(3)将步骤(2)中的产物和发卡接头A混合进行接头连接反应，并进行纯化
向PCR管中加入如下成分：
使用PCR仪，先37℃反应1h，然后95℃反应1min；
连接产物在-20℃下保存；
通过涡流悬浮磁珠，向1.5ml离心管中转移12μl磁珠；
用磁力架固定磁珠，移去上清液，用500μl的磁珠缓冲液分两次冲洗磁珠(每次250μl)；
使用PCR仪，连接产物在95℃下反应1min；
迅速对连接产物冰浴至少1min，取出离心；
将连接产物转移至含有磁珠的离心管中，室温旋转20min，离心；
用磁力架固定磁珠，移去上清液，磁珠依次用200μl的缓冲A液和缓冲B液冲洗。
(4)将步骤(3)中的产物和引物混合进行退火和延伸反应，并进行纯化
用磁力架固定磁珠，移去上清液，加入如下成分，操作过程中通过涡流悬浮磁珠；
将上述体系置于65℃的恒温金属浴中热处理2min，再冰浴1min；
加入2μl的Klenow fragment，混匀，37℃的恒温金属浴中热处理27min，取出离心；
用磁力架固定磁珠，移去上清液，用200μl的缓冲A液冲洗一次；
将磁珠重悬在100μl的严谨性洗脱缓冲液中，然后将该体系置于45℃的恒温金属浴上热处理3min；
用磁力架固定磁珠，移去上清液，用200μl的缓冲B液冲洗一次。
(5)将步骤(4)中的产物和双链接头B混合进行接头连接反应，并进行纯化、洗脱
用磁力架固定磁珠，移去上清液，加入如下成分，操作过程中通过涡流悬浮磁珠；
对上述体系震荡混匀，加入2μl T4DNA Ligase，混匀，室温反应30min；
用磁力架固定磁珠，移去上清液，用200μl的缓冲A液冲洗一次；
将磁珠重悬在100μl的严谨性洗脱缓冲液中，然后将该体系置于45℃的恒温金属浴上热处理3min；
用磁力架固定磁珠，移去上清液，用200μl的缓冲B液冲洗一次；
用磁力架固定磁珠，移去上清液，向体系中加入25μl的TET buffer，操作过程中用涡流保持磁珠悬浮；
将上述体系转移到0.2ml的PCR管中，离心；
使用PCR仪，使上述体系在95℃下反应1min；
迅速将上述体系放转移至96孔的磁力架上；并将上清液转移到0.2ml的PCR管中。
(6)将步骤(5)中的产物和接头引物混合进行PCR扩增，得到ctDNA文库
向PCR管中加入如下成分：
使用PCR仪，反应程序如下：
(7)测序
通过illumina测序仪对PCR产物进行测序，证明了本发明的可行性。
序列表
<110>安徽安科生物工程(集团)股份有限公司
<120>ctDNA建库的试剂盒和建库方法
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
pho-AGATCGGAAG[C3Spacer]10[TEG-biotin] (TEG =triethylene glycol spacer) 10
<210> 2
<211> 10
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
SpacerC12-AA[SpacerC12]CTTCCGATCTNNNNNN-AmC6 10
<210> 3
<211> 11
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 3
CGACGCTCTTC-ddC (ddC = dideoxycytidine) 11
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 4
[Phosphate]GGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAG*T*G*T*A(*=phosphothioate linkage) 29
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 5
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 34
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 6
ACACTCTTTCCCTACACGAC 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 7
GTGACTGGAGTTCAGACGTGT 21
Claims (9)
1.一种ctDNA建库试剂盒，其特征在于，包括发卡接头A、双链接头B和引物组；
所述发卡接头A包括接头A1和接头A2，接头A1和接头A2的序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，且接头A2的3′端用生物素修饰；
所述双链接头B包括接头B1和接头B2，接头B1和接头B2的序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
所述引物组包括扩增引物和接头引物，扩增引物的序列号为SEQ ID NO.5，接头引物的序列为SEQ ID NO.6-7。
2.根据权利要求1所述的ctDNA建库试剂盒，其特征在于，还包括用于连接ctDNA和发卡接头A或双链接头B的T4 DNA连接酶和用于T4 DNA连接酶的缓冲液。
3.一种ctDNA建库的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取游离ctDNA片段；
(2)对ctDNA片段进行去磷酸化与变性反应；
(3)将步骤(2)中的产物和T4 DNA连接酶、发卡接头A混合进行接头连接反应，并进行纯化；
(4)将步骤(3)中的产物和引物混合进行退火和延伸反应，并进行纯化；
(5)将步骤(4)中的产物和T4 DNA连接酶、双链接头B混合进行接头连接反应，并进行纯化、洗脱；
(6)将步骤(5)中的产物和接头引物混合进行PCR扩增，得到ctDNA文库。
4.根据权利要求3所述的ctDNA建库的方法，其特征在于，还包括(7)对ctDNA文库进行测序。
5.根据权利要求3所述的ctDNA建库的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的反应体系为：ctDNA 20μl，10×T4 RNA ligation buffer 8μl，2％Tween 2μl，Fast AP 1μl，灭菌水14.6μl；反应程序为：37℃10min，95℃2min。
6.根据权利要求3所述的ctDNA建库的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的反应体系为：PEG-8000(50％)32μl，发卡接头A(10μM)1μl，T4 DNA ligase 1μl，100mM ATP 0.4μl；反应程序为：37℃1h，95℃1min。
7.根据权利要求3所述的ctDNA建库的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的反应体系为：灭菌水39.1μl，5×Klenow reaction buffer 5μl，dNTP mix(25mM each)0.4μl，Extension primer CL130(100μM)1μl，1％Tween-20 2.5μl。
8.根据权利要求3所述的ctDNA建库的方法，其特征在于，所述步骤(5)中的反应体系为：灭菌水73.5μl，10×T4 DNA ligation buffer 10μl，PEG-4000(50％)10μl，Tween 20(1％)2.5μl，双链接头B 2μl。
9.根据权利要求3所述的ctDNA建库的方法，其特征在于，所述步骤(6)中的反应体系为：灭菌水7.5μl，IS7 1μl，IS8 1μl，Libary 3μl，Mix 12.5μl；反应程序为：95℃预变性10min，95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s、40个循环，72℃延伸5min。
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| CN108166068A (zh) * | 2018-01-02 | 2018-06-15 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 一种新型dna建库试剂盒及其应用 |
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| HE CHENG等: "Analysis of ctDNA to predict prognosis and monitor treatment responses in metastatic pancreatic cancer patients", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER》 * |
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