CN108976356A - 一种由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料及其制备和应用 - Google Patents

一种由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料及其制备和应用，该材料为二硒代二丙酸‑聚乙二醇酯‑b‑聚(N‑异丙基丙烯酰胺)共聚物，具体是采用二硒代二丙酸与聚乙二醇酯化后形成的含多个联硒键的结构与2‑溴异丁酰溴反应得到大分子引发剂，继而引发N‑异丙基丙烯酰胺发生原子转移自由基聚合而成，制备简便，条件温和。该材料在水溶液中自组装为胶束，且结构中所含联硒键和聚(N‑异丙基丙烯酰胺)可分别对癌变组织中的高浓度氧化、还原性物质和较高温度灵敏响应，解决了含硒药物载体合成难、水溶性差、难修饰等问题。该材料生物相容性好，在抑瘤试验中获得了良好效果，可作药物递送材料应用于癌症靶向治疗。

Description

一种由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料及 其制备和应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及到一种由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料及其制备方法，该材料具有多个温度、氧化还原响应位点且稳定性、生物相容性好，可应用于肿瘤治疗领域。
背景技术
目前，临床抗癌药物由于稳定性差、水溶性差、生物异质性分散等缺陷导致癌症的治疗效果大打折扣，因此可将疏水性药物包覆在具有药物增溶效果的双亲水嵌段共聚物胶束的内核中。但载药胶束在体循环过程中经体液稀释后，原有的胶束结构被破坏导致药物提前泄露，对正常组织的副作用大。另外，对癌变部位特有的生理信号响应缓慢、药物载体的稳定性差、生物相容性不尽人意是限制药物载体使用的重要因素。此前，文献报道的含硒药物递送材料制备困难、水溶性差、难修饰、分子量分布宽，因此将其引入药物递送材料相当困难。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料，其中含有多个对癌变组织的温度及其含有的超高浓度的谷胱甘肽和活性氧响应的位点，解决了传统含硒药物载体的缺陷，该材料水溶性好、稳定性和生物相容性好，可用于肿瘤的靶向治疗。
解决上述技术问题所采用技术方案的药物递送材料的结构式如下所示：
式中x为45或89，y为90～180的整数，m为5～10的整数；优选x为45或89，y为96～168的整数，m为7～10的整数。
上述由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料的制备方法由下述步骤组成：
1、制备二硒代二丙酸-聚乙二醇酯
将式I所示的3,3’-二硒代二丙酸、聚乙二醇2000或聚乙二醇4000、4-二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺体积比为1:1的混合溶剂中，在冰浴中活化1.5～3.5小时，然后加入N,N-二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液，在氮气氛围下温度反应20～28小时，反应结束后分离提纯，真空干燥至恒重，得到式II所示的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯。
2、制备大分子引发剂
将式II所示的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯溶于无水二氯甲烷，加入三乙胺、4-二甲氨基吡啶，在冰浴中活化1～2小时，然后加入2-溴异丁酰溴的二氯甲烷溶液，在氮气氛围下室温反应20～28小时，反应结束后分离提纯，得到式III所示的大分子引发剂。
3、制备二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物
将式III所示的大分子引发剂、N-异丙基丙烯酰胺溶于水与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中，并加入三(2-二甲氨基乙基)胺和溴化亚铜，进行“冷冻-抽真空-解冻”操作三次，室温反应20～28小时，反应结束后分离提纯，得到式IV所示的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物，即由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料。
上述步骤1中，所述的3,3’-二硒代二丙酸、聚乙二醇2000或聚乙二醇4000、4-二甲氨基吡啶、N,N-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1～1.1:1～1.1:1.5～2.5。
上述步骤2中，所述的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯与三乙胺、4-二甲氨基吡啶、2-溴异丁酰溴的摩尔比为1:1.5～2.5:1～1.1:1～1.5。
上述步骤3中，所述的大分子引发剂与N-异丙基丙烯酰胺、三(2-二甲氨基乙基)胺、溴化亚铜的摩尔比为1:200～400:1～1.5:1～1.5。
本发明的由药物递送材料在制备抗癌药物紫杉醇载药胶束中的应用，具体制备方法为：将药物递送材料与紫杉醇按照质量比4:1的比例溶于N,N-二甲基甲酰胺中并搅拌过夜，装入截留分子量为2000的透析袋中，置于蒸馏水中透析72小时，其间每3小时更换蒸馏水一次。结束后低速离心除去游离紫杉醇，收集上清液冷冻干燥得到具有多个氧化还原、温度响应位点的负载紫杉醇的载药胶束。
本发明的有益效果如下：
本发明制备了一种由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料，该材料可在水环境中自组装为稳定性好、粒径小、具有核壳结构的胶束。此外，通过物理包覆紫杉醇，获得了具有多个氧化还原、温度响应位点的紫杉醇载药胶束，在体循环过程中经过癌变组织所含的超高浓度谷胱甘肽的活性氧及高于正常组织的温度的协同刺激，实现了紫杉醇的可控定点靶向释放。细胞毒性实验和体内抑瘤实验结果证实，该材料具有好的生物相容性和稳定性，且具有显著的肿瘤治疗效果，可应用于肿瘤治疗领域。
本发明由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料的水溶性好，分子量分布窄，稳定性强，合成简便，条件温和。
附图说明
图1是实施例3制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物的核磁共振氢谱图。
图2是实施例3制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物的红外光谱图。
图3是实施例3制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯(曲线A)和二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物(曲线B)的凝胶渗透色谱曲线。
图4是实施例3制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物形成的胶束(曲线A)及其包载紫杉醇后形成载药胶束(曲线B)的临界胶束浓度分析图。
图5是实施例3制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物形成胶束的低临界溶液温度分析图。
图6是实施例3制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物形成的胶束经0mM谷胱甘肽(曲线(a))和10mM谷胱甘肽(曲线(b))、100μM双氧水(曲线(c))室温还原、氧化24小时后的粒径变化图。
图7是实施例3制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物所形成胶束的透射电子显微镜图片。
图8是实施例3制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物形成的胶束及其包载紫杉醇后形成载药胶束的细胞毒性图。
图9是紫杉醇的细胞毒性图。
图10是实施例3制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物包载紫杉醇后形成的载药胶束在pH 7.4PBS缓冲液37℃释放曲线(A)、含10mM谷胱甘肽的pH 5.6PBS缓冲液42℃释放曲线(B)、含100μΜ H2O2的pH 5.6PBS缓冲液42℃释放曲线(C)。
图11是负荷4T1肿瘤的Balb/c小鼠经紫杉醇(线A)、实施例3制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物形成的胶束(线B)、实施例3制备的载药胶束(线C)、0.9％生理盐水(对照组，线D)和PBS(对照组，线E)治疗的肿瘤体积与治疗时间关系图。
图12是负荷4T1肿瘤的Balb/c小鼠经紫杉醇(线A)、实施例3制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物形成的胶束(线B)、实施例3制备的载药胶束(线C)、0.9％生理盐水(对照组，线D)和PBS(对照组，线E)治疗的小鼠体重与治疗时间关系图。
图13是治疗后小鼠主要器官切片染色图(放大倍数：200倍)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、制备二硒代二丙酸-聚乙二醇酯
将0.304g(1mmol)式I所示的3,3’-二硒代二丙酸(根据文献“Cheng,G.；He,Y.；Xie,L.；Nie,Y.；He,B.；Zhang,Z.；Gu,Z.Development of a reduction-sensitivediselenide-conjugated oligoethylenimine nanopaticulate system as a genecarrier.International Journal of Nanomedicine,2012,7,3991–4006”中公开的方法制备得到)、2g(1mmol)聚乙二醇2000、0.122g(1mmol)4-二甲氨基吡啶溶于10mL二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂(V二氯甲烷/VN,N-二甲基甲酰胺＝1/1)中，在冰浴中活化3小时；将0.4123g(2mmol)N,N-二环己基碳二亚胺溶于4mL二氯甲烷，并将该溶液滴入反应体系，在氮气氛围下室温反应24小时。反应结束后过滤除去不溶物，旋转蒸发滤液后在过量乙醚中沉淀3次，40℃真空干燥至恒重，得到式II-1所示的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯，产率68％，其重均分子量为Mw＝33942g mol-1，数均分子量Mn＝22069g mol-1，多分散指数＝1.538。
2、制备大分子引发剂
将2.2g(0.1mmol)式II-1所示的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯溶于10mL无水二氯甲烷中，并加入27.7μL(0.2mmol)三乙胺、6.1mg(0.1mmol)4-二甲氨基吡啶，在冰浴中活化1.5小时，将15μL(0.125mmol)2-溴异丁酰溴溶于3mL二氯甲烷，并将该溶液滴入反应体系，在氮气氛围下室温反应24小时。反应结束后过滤除去不溶物，旋转蒸发滤液后在过量乙醚中沉淀3次，40℃真空干燥至恒重，得到式III-1所示的大分子引发剂，产率50％。
3、制备二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物
将2.22g(0.1mmol)式III-1所示的大分子引发剂和2.264g(20mmol)N-异丙基丙烯酰胺溶于5mL由水、N,N-二甲基甲酰胺组成的混合溶剂(V水/VN,N-二甲基甲酰胺＝4/6)中，并加入26.73μL(0.1mmol)三(2-二甲氨基乙基)胺、14.4mg(0.1mmol)溴化亚铜，然后进行“冷冻-抽真空-解冻”操作三次，室温反应24小时。反应结束后，反应液经过中性三氧化二铝柱，所得液体旋转蒸发后在蒸馏水中透析72小时，冷冻干燥，得到式IV-1所示的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物，即由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料，产率31.2％，其重均分子量为Mw＝58512g mol-1，数均分子量Mn＝37312g mol-1，多分散指数＝1.576。
实施例2
1、制备二硒代二丙酸-聚乙二醇酯
该步骤只需用聚乙二醇4000替换实施例1步骤1中聚乙二醇2000，其他步骤与实施例1的步骤1相同，得到式II-2所示的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯，产率73％，其重均分子量为Mw＝47922g mol-1，数均分子量Mn＝29655g mol-1，多分散指数＝1.616。
2、制备大分子引发剂
该步骤用等摩尔式II-2所示的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯替换实施例1步骤2中式II-1所示的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯，其他步骤与实施例1步骤2相同，得到式III-2所示的大分子引发剂，产率43.3％。
3、制备二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物
该步骤用等摩尔式III-2所示的大分子引发剂替换实施例1步骤3中式III-2所示的大分子引发剂，其他步骤与实施例1步骤3相同，得到式IV-2所示的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物，即由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料，产率36.7％，其重均分子量为Mw＝45264g mol-1，数均分子量Mn＝40778g mol-1，多分散指数＝1.110。
实施例3
本实施例的步骤1、步骤2与实施例2相同。在步骤3中，N-异丙基丙烯酰胺的用量增加一倍，其他步骤与实施例2的步骤3相同，得到式IV-3所示的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物，即由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料，产率33.3％。
如图1所示，HOCH2 CH2 S–和HOCH2 CH2S–中亚甲基化学位移分别在2.75和3.12、3.29ppm，1.14、4.01、6.46、1.36、1.73ppm处为聚(N-异丙基丙烯酰胺)中的特征峰，3.67、4.27ppm为聚乙二醇特征峰，上述特征峰证明由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料成功合成。
如图2所示，526和840cm-1处的特征峰分别为–C–Se键和Se–Se键的弯曲振动峰，3290和3444cm-1处的特征峰依次归属于聚(N-异丙基丙烯酰胺)重复单元中–N–H的伸缩振动和3,3’-二硒代二丙酸中羟基的特征峰，聚乙二醇中–C–H的伸缩振动峰位于2881cm-1，酯羰基和酰胺羰基在1732和1649cm-1，1544cm-1处是聚(N-异丙基丙烯酰胺)中–C–N的吸收峰，1112cm-1的吸收峰属于聚乙二醇中–C–O伸缩振动，综上所述，进一步证明由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料已成功制备。
如图3所示，本实施例制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯和二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物经凝胶渗透色谱检测，两者的保留时间相继减小，说明二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物成功合成；曲线呈正态分布，峰型呈单峰，在全部保留时间内无肩峰，证明所得产物纯度可靠。积分可知，本实施例制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物的重均分子量为Mw＝65323g mol-1，数均分子量Mn＝48639g mol-1，多分散指数＝1.343。
实施例4
实施例3制备的由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料在制备抗癌药物紫杉醇载药胶束中的应用
将40mg二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物和10mg紫杉醇溶于10mLN,N-二甲基甲酰胺，然后逐滴加入蒸馏水直到溶液变浑浊。将溶液移入截留分子量为10000的透析袋并在蒸馏水中室温透析72小时，期间定期更换蒸馏水。结束后，低速离心除去未包覆的紫杉醇，收集上清液冷冻干燥，得到包覆紫杉醇的载药胶束，其载药量、包覆率如表1所示。
表1实施例3制备的药物递送材料形成的胶束相关物理化学参数
由表1得知，实施例3制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物胶束的Zeta电位为-24.93±0.66mV，绝对值在20～30mV间，具有良好的稳定性。通过物理包覆紫杉醇，载药胶束的载药量和包覆率分别为13.67％和54.63％，说明该材料药物负载能力强，包覆率高。
如图4所示，实施例3制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物自组装形成的胶束临界胶束浓度为49.70mg L-1(曲线A)，药物包覆至疏水内核后，临界胶束浓度减小为9.21mg L-1，说明包覆药物后聚合物更易形成胶束，稳定性更强，在药物载体进入人体参与体循环时，更能够经得起体液的稀释，保持原有胶束形貌不变，避免药物的过早泄露对正常组织造成损伤，最终实现药物在病灶部位的靶向释放。
如图5所示，实施例3制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物形成胶束的低临界溶液温度为38.05℃，高于人体正常体温，与癌变组织温度接近。药物载体处于人体正常组织时，聚(N-异丙基丙烯酰胺)内核较为疏松，药物不受外力可储存在核内；当载体处于病灶部位时(体温约为40℃)，聚(N-异丙基丙烯酰胺)内核收紧，将其内部的药物挤压出来，释放至病变组织。因此，该材料可满足在温度刺激下药物定点靶向释放的需求。
如图6所示，当实施例3制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物形成的胶束粒径为127nm，经10mM谷胱甘肽室温还原24小时后，联硒键被还原为硒醇，硒醇比联硒键的亲水性强，因此胶束的亲水壳层溶胀作用更强，胶束粒径增大至254.3nm。胶束经100μM双氧水氧化24小时后，联硒键断裂为硒酸，胶束粒径减小至86.9nm。综上所述，该材料在氧化、还原物质刺激下联硒键断裂，具有氧化还原响应性。
如图7所示，实施例3制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物在水溶液中可自组装为聚(N-异丙基丙烯酰胺)为核、二硒代二丙酸-聚乙二醇酯为壳的胶束，胶束粒径约为60nm，小于200nm，在进入人体后可直接经过经毛细血管进入病变组织的细胞内，引起药物的被动靶向，因此，该药物载体材料粒径小，具有良好的应用基础。
为了证明本发明的有益效果，发明人采用实施例3制备的由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料进行了各种实验，具体实验情况如下：
1、细胞毒性实验
将实施例3制备的由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料形成的胶束及其物理包覆紫杉醇后所得载药胶束配制成浓度为100～500μg mL-1的胶束溶液，将紫杉醇配制成浓度为13.67～68.35μg mL-1溶液。
采用MTT分析法检测实施例3制备的由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料形成的胶束及其物理包覆紫杉醇后所得载药胶束、紫杉醇的细胞毒性，具体测试方法为：将肝癌细胞HCT116细胞株接种至含10％胎牛血清的DMEM培养基上并在5％CO2湿润环境37℃培养，待细胞生长至指数阶段后按照5×104/孔的密度接种在96孔板并用200μL含有10％胎牛血清的DMEM培养液在5％CO2氛围下37℃培养24小时，然后用新鲜的含有200μL不同浓度胶束或紫杉醇的DMEM培养液替换现有培养基并继续培养48小时。结束后，细胞用PBS冲洗三次，180μL DMEM培养基和MTT原液(5mg mL-1)加入96孔板，继续培养4小时。取150μLDMSO加入培养基后震荡10分钟。将接种在DMEM培养基且在同样条件下培养后的HCT116细胞作为对照组。溶液吸光度用通用酶标仪(Bio-Rad laboratories(UK)Ltd.)在570nm处读取，每孔结果检测六次并表示为平均值±S.D.值。细胞存活率按照如下公式计算：
细胞存活率(％)＝(OD待测样/OD对照样)×100％
OD对照样：不加胶束的光密度
OD待测样：加入实施例3制备的由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料形成的胶束或其物理包覆紫杉醇后所得的载药胶束后所得数值。
如图8所示，实施例3制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物形成的胶束培养细胞48小时后，细胞活性均在90％以上，说明空白胶束无毒性，生物相容性好。由于人结肠癌细胞中含有谷胱甘肽和活性氧，导致载药胶束中药物有一定释放，对癌细胞的生长有抑制作用。游离紫杉醇对细胞的抑制效果最为明显，如图9所示，紫杉醇半抑制浓度(IC50)为9.44μg mL-1，在杀死癌细胞的同时对正常细胞也会有严重的副作用。所以，该载药胶束可确保游离药物的定点释放，使其全部作用于癌变部位。
2、药物释放实验
将采用实施例3制备的由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料负载紫杉醇后形成的载药胶束在模拟人体正常组织和肿瘤部位生理条件下下进行体外释放，具体实施方法为：将4mg实施例3制备载药胶束分别用4mLpH 7.4或5.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(PBS)溶解，装入截留分子量为2000的透析袋，置于200mL含对应pH值PBS中，在释放开始时向透析外液中不加或加入10mM谷胱甘肽或100μM双氧水以模拟癌变组织生理微环境。在间隔时间内取一定量透析外液并补充等量同pH值的PBS，测试取出液体在210nm处的紫外吸光度。测试结果见图10。
如图10所示，实施例3制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物物理包覆紫杉醇后形成的载药胶束在pH 7.4PBS缓冲液37℃时释放量仅为33.15％，证明药物载体基本不会对人体正常组织造成损伤，很好的规避了游离紫杉醇的副作用；载药胶束在含有10mM谷胱甘肽的pH 5.6PBS缓冲液42℃(高于低临界溶液温度)释放时，最终的释放量达到58.11％，在含有100μM双氧水的pH 5.6PBS缓冲液42℃释放时最终释放量达到59.17％。在温度和氧化、还原性物质的协同刺激下，药物的最终释放量均远高于在模拟正常组织生理条件下的释放量，因此，该药物载体避免了游离药物对正常组织的副作用，同时在癌变组织特有生理信号的刺激下实现了药物的定点靶向释放。
3、体内抑瘤试验
将小鼠乳腺癌细胞4T1接种至含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基上，在含5％CO2的湿润氛围下37℃培养。雄性Balb/c小鼠(体重：20±2g)在55％湿度的氛围下室温饲养。将负荷4T1肿瘤的小鼠分为五组，每组三只，按照紫杉醇浓度为5mg kg-1的剂量在第0、3、6、9、12、15天时分别静脉注射游离紫杉醇，实施例3制备的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物形成的胶束溶液及载药胶束溶液，0.9％生理盐水、缓冲溶液作为对照组。治疗期间每三天测定一次肿瘤体积和小鼠体重。在肿瘤体积达到100mm3时开始治疗，肿瘤体积根据如下公式计算：体积＝(长度×宽度2)/2，在治疗结束后，收集六组小鼠的心、肝、脾、肺、肾，将其浸泡在福尔马林中一段时间后用石蜡固化，随后切割为5μm厚的切片并用苏木精和伊红染色。用光学显微镜拍摄组织照片进行病理学分析。
如图11所示，以5mg kg-1的剂量将紫杉醇注射入小鼠体内后，载药胶束(线C)的肿瘤抑制效果明显。经过游离紫杉醇(线A)和空白胶束(线B)治疗后肿瘤体积增加，证明紫杉醇具有一定的系统毒性。对照组小鼠经过0.9％生理盐水(线D)和PBS(线E)治疗后，肿瘤体积增加最为明显，因此，载药胶束有效地改善了游离药物的系统毒性，抗癌效果较游离药物更好。
如图12所示，紫杉醇(线A)治疗的小鼠体重略有增长，由于空白胶束中含有微量元素硒，空白胶束(线B)治疗的小鼠体重增幅较大，载药胶束(线C)治疗后的小鼠体重增长最快，说明该载体负载的药物已尽数作用于病灶部位，缓解了游离药物的副作用。用0.9％生理盐水(线D)和PBS(线E)治疗的小鼠随着治疗的进行，日益消瘦，呈现出恶病质症状。
如图13所示，载药胶束治疗后的小鼠主要器官中未见明显异常，紫杉醇治疗组的小鼠心脏表现出一定损伤，说明紫杉醇具有心脏毒性，因此，该载药胶束缓解了游离紫杉醇的副作用，并使药物定点靶向作用于癌变部位。

Claims (7)

1.一种由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料，其特征在于该药物递送材料的结构式如下所示：
式中x为45或89，y为90～180的整数，m为5～10的整数。
2.根据权利要求1所述的药物递送材料，其特征在于：所述x为45或89，y为96～168的整数，m为7～10的整数。
3.一种权利要求1所述的由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料的制备方法，其特征在于它是由下述步骤组成：
(1)制备二硒代二丙酸-聚乙二醇酯
将式I所示的3,3’-二硒代二丙酸、聚乙二醇2000或聚乙二醇4000、4-二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺体积比为1:1的混合溶剂中，在冰浴中活化1.5～3.5小时，然后加入N,N-二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液，在氮气氛围下温度反应20～28小时，反应结束后分离提纯，真空干燥至恒重，得到式II所示的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯；
(2)制备大分子引发剂
将式II所示的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯溶于无水二氯甲烷，加入三乙胺、4-二甲氨基吡啶，在冰浴中活化1～2小时，然后加入2-溴异丁酰溴的二氯甲烷溶液，在氮气氛围下室温反应20～28小时，反应结束后分离提纯，得到式III所示的大分子引发剂；
(3)制备二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物
将式III所示的大分子引发剂、N-异丙基丙烯酰胺溶于水与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中，并加入三(2-二甲氨基乙基)胺和溴化亚铜，进行“冷冻-抽真空-解冻”操作三次，室温反应20～28小时，反应结束后分离提纯，得到式IV所示的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物，即由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料。
4.根据权利要求3所述的药物递送材料的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的3,3’-二硒代二丙酸、聚乙二醇2000或聚乙二醇4000、4-二甲氨基吡啶、N,N-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1～1.1:1～1.1:1.5～2.5。
5.根据权利要求3所述的药物递送材料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的二硒代二丙酸-聚乙二醇酯与三乙胺、4-二甲氨基吡啶、2-溴异丁酰溴的摩尔比为1:1.5～2.5:1～1.1:1～1.5。
6.根据权利要求3所述的药物递送材料的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的大分子引发剂与N-异丙基丙烯酰胺、三(2-二甲氨基乙基)胺、溴化亚铜的摩尔比为1:200～400:1～1.5:1～1.5。
7.权利要求1所述的由联硒键连接的温度、氧化还原敏感型药物递送材料在制备抗癌药物紫杉醇载药胶束中的应用。
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