CN108969769A - 同时负载青霉素和一氧化氮的聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学工程领域，公开了一种同时负载青霉素和一氧化氮的聚合物及其制备方法和应用。该聚合物的结构式如下所述。本发明选用树枝状阳离子含炔基的聚酰胺‑胺树枝状分子PAMAM作为NO供体，其独枝状结构以及结构中大量地仲胺，有利于NO的高效负载。另外，PAMAM同时含有大量伯胺基团，有利于高效负载青霉素，实现NO和PCN的高效负载。将壳聚糖接枝聚酰胺‑胺，可大大改善材料的生物相容性，同时壳聚糖长链对聚酰胺‑胺的高接枝率也极大地提高了NO和PCN的负载量；且同时负载青霉素和NO的聚合物的抗菌效果比单独的负载青霉素或NO的效果均要好，产生了协同作用。

Description

同时负载青霉素和一氧化氮的聚合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医学工程领域，特别涉及一种同时负载青霉素和一氧化氮的聚合物及其制备方法和应用。
背景技术
据2014年CHINET中国细菌耐药性监测结果报道，细菌耐药性仍呈增长趋势，多重耐药、广泛耐药和全耐药菌株的出现和日益增长，为抗感染治疗带来了挑战。抗生素耐药已成为全球关注的严重问题，也是科学界研究的热点问题。
近年来的研究成果揭示，抗生素的耐药问题除了与耐药菌株的大量产生有关外，还与致病菌在人体内以生物膜的方式生长密切相关。生物膜是细菌粘附在物体表面上形成的一种具有高度结构性的膜状复合物，其主要成分为细菌分泌的胞外基质和细菌菌体。生物膜对细菌起着强有力的保护作用，由于物理屏蔽作用和生物膜内特殊的生理环境以及β-内酰胺酶扩散受限而聚集，生物膜的形成显著增强了生物膜内细菌对抗生素、化学杀菌剂以及机体免疫系统的抵抗能力(MicrobialPathogenesis2015,80:39-49)。
近年来研究发现，一氧化氮(NO)是使细菌生物膜消散的主要信号分子，能使细菌转变为对抗生素抵抗力弱的浮游状态(CurrPharmDesign2015,21:31-42)。NO因其高效抑菌及不易产生耐药性等特性，在抗菌领域显示出重要的应用前景。Dongsik Park等(AdvancedHealthcare Materials 2016,5:2019-2024)制备了可释放NO的聚多巴胺空心纳米微球，用于抗菌方面的研究，NO负载量为0.296μmol/mg。HasanNurhasni等(International Journalof Nanomedicine 2015，10 3065-3080)制备了可持续释放NO的PLGA微球用于伤口抗感染促愈合方面研究，NO负载量为0.04μmol/mg。然而目前将NO负载于载体材料上直接用于抗菌应用研究，尚存在载药量低、抑菌效果不明显、载体材料的安全性存疑等问题，影响了其在抗菌中的应用。此外，临床中较多研究显示，青霉素类抗生素仍在各类抗生素应用中占有较大的比例，其为广谱抗生素，其对于患者的治疗效果较佳。但如上述所示，生物膜中β-内酰胺酶的扩散受到细菌胞外基质的限制，因而浓度相对较高，β-内酰胺酶可水解青霉素的β-内酰胺环而使药物失效，可有效地抵抗青霉素的抗菌作用(MicrobialDrugResistance2016,23:147-56)。
因此，如何得到能解决生物膜产生的抗生素耐药的抗菌材料，便成了当前生物医学工程领域亟待解决的重要课题。迄今为止，能同时实现青霉素和一氧化氮高负载的聚合物材料及其应用尚未见报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种同时负载青霉素和一氧化氮的聚合物，该聚合物材料生物相容性良好，拥有大量仲胺基团，可实现NO和PCN的高效负载，在抗菌方面显示出重要应用前景。
本发明另一目的在于提供上述同时负载青霉素和一氧化氮的聚合物的制备方法。
本发明再一目的在于提供上述同时负载青霉素和一氧化氮的聚合物在抗菌方面的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种同时负载青霉素和一氧化氮的聚合物，其结构式如下所示：
一种上述的同时负载青霉素和一氧化氮的聚合物的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)CS-PAMAM负载青霉素(CS-PAMAM-PCN)的合成
将青霉素溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)后，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)室温搅拌1～3h后，加入壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺CS-PAMAM继续反应12～24h，反应结束后将所得反应液用透析袋进行透析2～3天，冻干得到产物青霉素修饰的壳聚糖接枝3代树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM-PCN)；
(2)同时负载青霉素和NO的壳聚糖接枝3代树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM-PCN/NONOate)的合成
将步骤(1)中冻干后的青霉素修饰的壳聚糖接枝3代树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM-PCN)加入到干燥处理后的无水甲醇和四氢呋喃共混溶剂中，然后再加入甲醇钠继续溶解稳定30～60min后放置于高压反应釜密封，用氮气排除反应釜内的空气，然后通入NO气体室温下反应3～7天，反应结束后将所得反应产物取出纯化即得最终产物同时负载青霉素和NO的壳聚糖接枝3代树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM-PCN/NONOate)。
步骤(1)中所述的壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺CS-PAMAM的合成参考中国公开文本“CN201711008528.3-一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子及其制备方法和应用”。
步骤(1)中所述的壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺、青霉素、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的摩尔比为1：1～10：1～10：1～10；步骤(1)中所述的干燥的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的用量以10mL的N,N-二甲基甲酰胺对应加入1～5g青霉素计；
步骤(1)中所述的搅拌是为了是原料充分混合，因此不用对搅拌速度进行限定，本领域常规使用的搅拌速度均可。
步骤(1)中所述的透析用透析袋的截留分子量为2000～5000；
步骤(2)中所述的青霉素修饰的壳聚糖接枝3代树枝状聚酰胺-胺和甲醇钠的质量比为1:1～2；
步骤(2)中所述的无水甲醇和四氢呋喃共混溶剂是指无水甲醇和四氢呋喃的体积比为1：0.5～2；所述的混合溶剂的用量以每10ml的无水甲醇对应加入1～2g的青霉素修饰的壳聚糖接枝3代树枝状聚酰胺-胺计；
步骤(2)中所述的用氮气排除反应釜内的空气是指用20psi～50psi的高纯氮气维持反应釜10min～20min以排除反应釜内的空气。
步骤(2)中所述的通入NO气体反应是指通入80psi～120psi的NO气体；
步骤(2)中反应结束后，为安全起见用20～50psi的高纯氮气将NO排出并继续维持30～60min后再打开反应釜；
步骤(2)中所述的纯化是指将所得反应产物用无水乙醚沉降洗涤2～3次，然后过滤并在50～80℃的真空干燥箱中干燥12～48h即得最终产物；
步骤(2)中所述的最终产物优选被保存在-4～-20℃的干燥箱中。
步骤(1)～(2)中未指明温度的均指室温，所述的室温均指25～35℃；
步骤(1)～(2)中所述的干燥的N,N-二甲基甲酰胺的制备方法按照以下操作步骤：将氢化钙加入到N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌6～24h，然后减压蒸馏，得到无水N,N-二甲基甲酰胺，所述氢化钙的加入量以每500mLN,N-二甲基甲酰胺中加入1～2g计；
步骤(1)～(2)所述无水甲醇的制备方法按照以下操作步骤：将氢化钙加入到甲醇中，搅拌6～24h，然后常压蒸馏，得到无水甲醇，所述氢化钙的加入量以每500mL甲醇中加入1～2g计；
上述的同时负载青霉素和一氧化氮的聚合物在制备抗菌药物的应用。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明选用树枝状阳离子含炔基的聚酰胺-胺树枝状分子PAMAM作为NO供体，其独枝状结构以及结构中大量地仲胺，使得树枝状分子在NO的负载方面存在优势，其仲胺基团密度高，有利于NO的高效负载。另外，PAMAM同时含有大量伯胺基团，有利于高效负载青霉素，实现NO和PCN的高效负载。
(2)壳聚糖生物相容性好，具有抗菌性能，可增强材料的抗菌效果；
(3)将壳聚糖接枝聚酰胺-胺，可大大改善材料的生物相容性，同时壳聚糖长链对聚酰胺-胺的高接枝率也极大地提高了NO和PCN的负载量；
(4)本发明得到的同时负载青霉素和NO的聚合物的抗菌效果比单独的负载青霉素或NO的效果均要好，产生了协同作用。
附图说明
图1为实施例1所得CS-PAMAM、实施例5所得CS-PAMAM-PCN、实施例8所得的CS-PAMAM-PCN/NONOate的红外光谱图。
图2为实施例11中CS-PAMAM-PCN/NONOate在不同时间下的NO累积释放量图；
图3为实施例12中不同材料的杀菌效果图，其中1代表未加任何抗菌材料的空白组，2代表添加了实施例2所得的CS-PAMAM的实验组，3代表添加了实施例5所得的CS-PAMAM-PCN的实验组，4代表添加了实施例8所得的CS-PAMAM/NONOate的实验组，5代表添加了实施例8所得的CS-PAMAM-PCN/NONOate的实验组。
图4为实施例13中不同浓度的CS-PAMAM-PCN/NONOate的细胞毒性检测图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。
以下实施例中所述的壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺CS-PAMAM参考中国公开文本“CN201711008528.3-一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子及其制备方法和应用”制备得到。干燥的CS-PAMAM是指将CS-PAMAM置于真空干燥箱中，40～80℃条件下干燥12～48小时。
以下实施例中干燥的CS-PAMAM-PCN是指将CS-PAMAM-PCN置于真空干燥箱中，40～80℃条件下干燥12～48小时。
以下实施例中所述的N,N-二甲基甲酰胺为无水N,N-二甲基甲酰胺，无水N,N-二甲基甲酰胺的制备方法按照以下操作步骤：将氢化钙加入到N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌6～24h，然后减压蒸馏，得到无水N,N-二甲基甲酰胺，所述氢化钙的加入量以每500mLN,N-二甲基甲酰胺中加入1～2g计；
以下实施例中所使用的无水甲醇的制备方法按照以下操作步骤：将氢化钙加入到甲醇中，搅拌6～24小时，然后常压蒸馏，得到无水甲醇，所述氢化钙的加入量以每500mL甲醇中加入1～2克计；
以下实施例中未指明温度的均指室温，所述的室温均指5～35℃；
实施例1
参考中国公开文本“CN201711008528.3-一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子及其制备方法和应用”的实施例4制备得到壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM)。
实施例2
参考中国公开文本“CN201711008528.3-一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子及其制备方法和应用”的实施例5制备得到壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM)。
实施例3
参考中国公开文本“CN201711008528.3-一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子及其制备方法和应用”的实施例6制备得到壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM)。
实施例4
将青霉素溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)后，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)室温25℃搅拌1h后，加入实施例1中制备得到的壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM)继续反应12h，反应结束后将所得反应液用透析袋进行透析2天，冻干得到青霉素(PCN)修饰的壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM-PCN)；所述壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和青霉素(PCN)的摩尔比为1:1：1:1；所述的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)以每10毫升中加入1g青霉素(PCN)计；所述的透析用的透析袋的截留分子量为2000；
实施例5
将青霉素溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)后，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)室温35℃搅拌3h后，加入实施例2中制备得到的壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM)继续反应24h，反应结束后将所得反应液用透析袋进行透析3天，冻干得到青霉素(PCN)修饰的壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM-PCN)；所述壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和青霉素(PCN)的摩尔比为1:5：5:5；所述的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)以每10毫升中加入3g青霉素(PCN)计；所述的透析用的透析袋的截留分子量为3000。
实施例6
将青霉素溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)后，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)室温15℃搅拌2h后，加入实施例3中制备得到的壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM)进行继续反应18h，反应结束后将所得反应液用透析袋进行透析2天，冻干得到青霉素(PCN)修饰的壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM-PCN)；所述壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和青霉素(PCN)的摩尔比为1:10:10:10；所述的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)以每10毫升中加入5g青霉素(PCN)计；所述的透析用的透析袋的截留分子量为5000。
实施例7
将实施例4得到的一定浓度干燥的CS-PAMAM-PCN和实施例1得到的干燥的CS-PAMAM在相同条件下，分别溶于相同体积的无水甲醇和四氢呋喃混合溶液中，溶解5min加入甲醇钠继续溶解稳定30min后放置于高压反应釜密封并检测气密性。高纯氮气维持反应釜(20psi)10min排除反应釜内的空气，然后通入NO气体(80psi)室温下反应3天。反应结束后，NO被20psi的高纯氮气排出并继续维持30min后打开反应釜，取出反应产物。用无水乙醚沉降洗涤2次，真空干燥，得最终产物CS-PAMAM-PCN/NONOate和CS-PAMAM/NONOate，低温保存于干燥器内。所述CS-PAMAM-PCN：甲醇钠质量比＝1:1；所述CS-PAMAM：甲醇钠质量比＝1:1；所述无水甲醇与四氢呋喃体积比为1:0.5；所述无水甲醇的使用量以每10ml无水甲醇对应溶解1gCS-PAMAM-PCN或1gCS-PAMAM计；所述低温保存温度范围为-4℃。
实施例8
将实施例5得到的一定浓度干燥的CS-PAMAM-PCN和实施例2得到的干燥的CS-PAMAM在相同条件下，分别溶于相同体积的无水甲醇和四氢呋喃混合溶液中，溶解30min加入甲醇钠继续溶解稳定60min后放置于高压反应釜密封并检测气密性。高纯氮气维持反应釜(50psi)20min排除反应釜内的空气，然后通入NO气体(120psi)室温下反应7天。反应结束后，NO被50psi的高纯氮气排出并继续维持60min后打开反应釜，取出反应产物。用无水乙醚沉降洗涤3次，真空干燥，得最终产物CS-PAMAM-PCN/NONOate和CS-PAMAM/NONOate，低温保存于干燥器内；所述CS-PAMAM-PCN：甲醇钠质量比＝1:2；所述CS-PAMAM：甲醇钠质量比＝1:2；所述无水甲醇与四氢呋喃体积比为1:2；所述无水甲醇的使用量以每10ml溶解2gCS-PAMAM-PCN或2gCS-PAMAM计；所述低温保存温度范围为-20℃；
实施例9
将实施例6得到的一定浓度干燥的CS-PAMAM-PCN和实施例3得到的干燥的CS-PAMAM在相同条件下，分别溶于相同体积的无水甲醇和四氢呋喃混合溶液中，溶解25min加入甲醇钠继续溶解稳定45min后放置于高压反应釜密封并检测气密性。高纯氮气维持反应釜(25psi)15min排除反应釜内的空气，然后通入NO气体(100psi)室温下反应5天。反应结束后，NO被30psi的高纯氮气排出并继续维持45min后打开反应釜，取出反应产物。用无水乙醚沉降洗涤2次，真空干燥，得最终产物CS-PAMAM-PCN/NONOate和CS-PAMAM/NONOate，低温保存于干燥器内；所述CS-PAMAM-PCN：甲醇钠质量比＝1:1.5；所述CS-PAMAM：甲醇钠质量比＝1:1.5；所述无水甲醇与四氢呋喃体积比为1:1；所述无水甲醇的使用量以每10ml溶解2gCS-PAMAM-PCN或2gCS-PAMAM计；所述低温保存温度范围为-20℃。
实施例10
取实施例1所得CS-PAMAM、实施例5所得CS-PAMAM-PCN、实施例8所得的CS-PAMAM-PCN/NONOate通过溴化钾压片法进行红外光谱表征，结果如图1所示，对于CS-PAMAM-PCN而言，我们发现在1780cm-1和1688cm-1处分别为β-内酰胺和酰胺基中(νC＝O)特征吸收峰，3046cm-1、1607cm-1和1496cm-1为苯环的特征吸收峰，1373cm-1和2969cm-1为(ν-C(CH3)2-)特征吸收峰，证明PCN已经成功修饰到CS-PAMAM结构上；另外相比较于CS-PAMAM-PCN而言，我们发现CS-PAMAM-PCN/NONOate在1250cm-1处出现明显的NONOate特征峰，从而证明了CS-PAMAM-PCN/NONOate的成功制备。
实施例11
取10mg实施例8所得CS-PAMAM-PCN/NONOate产物加入到10mL PBS缓冲液的透析袋内，两端扎口放入45mL离心管内，并向离心管内注入10mL PBS缓冲液。在37℃恒温摇床内，每隔一段时间取50μL注入到96孔板中。
在酸性条件下，NO与重氮盐磺胺发生重氮反应，并生成重氮化合物，后者进一步与萘基乙烯基二胺发生耦合反应，生成一种红色偶氮化合物，故本实验采用Griess试剂方法来检测NO释放。
所述PBS缓冲液的制备：取19mL磷酸二氢钾(0.2mol/L)和81mL磷酸氢二钠(0.2mol/L)相互混合；所述每隔一段时间取其透析袋外的溶液100μL的时间间隔为：1h，2h，3h，5h，7h，9h，12h，18h进行取点置于96孔板中，并依次滴加GriessⅠ，Ⅱ液后，溶液变为粉红色、玫瑰红色表示有亚硝酸盐还原，反应为阳性。在无光的条件下稳定15min后会观察到紫色或紫红色出现。然后用酶标仪测定其540nm处的吸收强度。图2为CS-PAMAM-PCN/NONOate在不同时间下的NO累积释放量图，从图2中可以看出，CS-PAMAM-PCN/NONOate在PBS(pH7.4)缓冲液中，持续释放18h左右，NO累积释放量达到1.17μmol/mg(NO累积释放量的计算依据文献“Advanced Functional Materials,2018,1707440；Chemical EngineeringJournal,2018,DOI:10.1016/j.cej.2018.04.159”要求购买一氧化氮浓度检测盒(格里斯试剂-上海碧云天)，制备NO浓度标准曲线得到)，这样的结果与Dongsik Park等(AdvancedHealthcare Materials 2016,5:2019-2024)制备了可释放NO的聚多巴胺空心纳米微球(NO累计释放量为0.297μmol/mg)以及HasanNurhasni等(International Journal ofNanomedicine 2015，10 3065-3080)制备了可持续释放NO的PLGA微球(NO累计释放量为0.04μmol/mg)等相比较，我们发现CS-PAMAM-PCN作为NO载体材料能够实现相对较高的NO负载量。
实施例12
称取实施例5所得CS-PAMAM-PCN、实施例2所得CS-PAMAM、实施例8所得的CS-PAMAM/NONOate和CS-PAMAM-PCN/NONOate各1mg溶解于1mL生理盐水，并向其中加入50μL(吸光度OD600＝0.1)金黄色葡萄球菌(ATCC29213)，于试管中培育4h后，各取100μL菌液稀释涂布于琼脂平板上继续培养12h，同时设置不加任何杀菌材料的空白组，不同材料的杀菌效果图如图3所示，其中1代表未加任何抗菌材料的空白组，2代表添加了实施例2所得的CS-PAMAM的实验组，3代表添加了实施例5所得的CS-PAMAM-PCN的实验组，4代表添加了实施例8所得的CS-PAMAM/NONOate的实验组，5代表添加了实施例8所得的CS-PAMAM-PCN/NONOate的实验组。相比于CS-PAMAM、CS-PAMAM-PCN和CS-PAMAM/NONOate，实施例8所得的共同负载PCN和NO的CS-PAMAM-PCN/NONOate具有更明显的抑菌效果，说明产生了协同作用。从图3中我们发现与空白组和CS-PAMAM相比较，NO和PCN的引入对细菌的杀伤效果明显增强，且将PCN与NO共同负载到CS-PAMAM材料上之后，对于细菌的杀伤效果发生了巨大的变化，杀伤效果均高于任何单一负载NO的CS-PAMAM/NONOate或单一负载PCN的CS-PAMAM-PCN，这一结果充分的说明了同时负载青霉素和NO的聚合物的抗菌效果比单独的负载青霉素或NO的效果均要好，产生了协同作用。
实施例13
取实施例8所制备得到的CS-PAMAM-PCN/NONOate经过滤灭菌后按照一定的浓度梯度(0.05、0.1、0.25、0.5、1mg/mL)加入到融合度达70％的大鼠成纤维细胞(南方医科大学动物实验中心提供)中共培养，同时设置不加CS-PAMAM-PCN/NONOate的空白对照组。24h后，采用CCK8比色法测定材料的细胞毒性，结果如图4所示，实验发现实施例8所制备得到的CS-PAMAM-PCN/NONOate表现出良好的生物相容性，在浓度达到1mg/ml时，细胞仍保持良好的生物相容性，细胞仍保持80％以上的存活率，图4结果证实，同时负载NO和青霉素的CS-PAMAM显示出良好的生物相容性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种同时负载青霉素和一氧化氮的聚合物，其特征在于其结构式如下所示：
其中，m为80～90的整数；n为10～20的整数，圆点·代表
2.一种权利要求1所述的同时负载青霉素和一氧化氮的聚合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)CS-PAMAM负载青霉素的合成
将青霉素溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐室温搅拌1～3h后，加入壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺CS-PAMAM继续反应12～24h，反应结束后将所得反应液用透析袋进行透析2～3天，冻干得到产物青霉素修饰的壳聚糖接枝3代树枝状聚酰胺-胺；
(2)同时负载青霉素和NO的壳聚糖接枝3代树枝状聚酰胺-胺的合成
将步骤(1)中冻干后的青霉素修饰的壳聚糖接枝3代树枝状聚酰胺-胺加入到干燥处理后的无水甲醇和四氢呋喃共混溶剂中，然后再加入甲醇钠继续溶解稳定30～60min后放置于高压反应釜密封，用氮气排除反应釜内的空气，然后通入NO气体室温下反应3～7天，反应结束后将所得反应产物取出纯化即得最终产物同时负载青霉素和NO的壳聚糖接枝3代树枝状聚酰胺-胺。
3.根据权利要求2中所述的同时负载青霉素和一氧化氮的聚合物的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺、青霉素、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：1～10：1～10：1～10；步骤(1)中所述的干燥的N,N-二甲基甲酰胺的用量以10mL的N,N-二甲基甲酰胺对应加入1～5g青霉素计。
4.根据权利要求2中所述的同时负载青霉素和一氧化氮的聚合物的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的透析用透析袋的截留分子量为2000～5000。
5.根据权利要求2中所述的同时负载青霉素和一氧化氮的聚合物的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的青霉素修饰的壳聚糖接枝3代树枝状聚酰胺-胺和甲醇钠的质量比为1:1～2；
步骤(2)中所述的无水甲醇和四氢呋喃共混溶剂是指无水甲醇和四氢呋喃的体积比为1：0.5～2；所述的混合溶剂的用量以每10ml的无水甲醇对应加入1～2g的青霉素修饰的壳聚糖接枝3代树枝状聚酰胺-胺计。
6.根据权利要求2中所述的同时负载青霉素和一氧化氮的聚合物的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的用氮气排除反应釜内的空气是指用20psi～50psi的高纯氮气维持反应釜10min～20min以排除反应釜内的空气；
步骤(2)中所述的通入NO气体反应是指通入80psi～120psi的NO气体。
7.根据权利要求2中所述的同时负载青霉素和一氧化氮的聚合物的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的纯化是指将所得反应产物用无水乙醚沉降洗涤2～3次，然后过滤并在50～80℃的真空干燥箱中干燥12～48h即得最终产物。
8.根据权利要求2中所述的同时负载青霉素和一氧化氮的聚合物的制备方法，其特征在于：
步骤(1)～(2)中未指明温度的均指室温，所述的室温均指25～35℃。
9.根据权利要求1所述的同时负载青霉素和一氧化氮的聚合物在制备抗菌药物的应用。
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