CN104784103B

CN104784103B - 基于寡聚氨基酸两亲分子可注射抗菌水凝胶

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Publication number: CN104784103B
Application number: CN201510146069.XA
Authority: CN
Inventors: 李志波; 万耀明; 王作宁
Original assignee: Qingdao University of Science and Technology
Current assignee: Qingdao University of Science and Technology
Priority date: 2015-03-31
Filing date: 2015-03-31
Publication date: 2017-09-05
Anticipated expiration: 2035-03-31
Also published as: CN104784103A

Abstract

本发明公开了一种基于寡聚氨基酸两亲分子抗菌水凝胶。该抗菌水凝胶，由两亲化合物与抗菌剂于溶剂中混匀静置而得；所述两亲化合物选自式I、式II、式III和式IV所示化合物中的至少一种。利用本发明方法，可将各类抗菌剂通过物理共混和原位凝胶的方式穿插于水凝胶网络之中。本发明提供的抗菌水凝胶的制备原材料均具有可良好的生物相容性和可生物降解性并且成本低廉，制备方法具有简单便捷、易于大量制备，以及得到的水凝胶具有可注射特点的优点，通过改变所包覆的抗菌剂种类可制备得到适应各种抗菌需求的可注射抗菌水凝胶，在生物医用及日常用品抗菌材料领域具有良好的应用前景。

Description

基于寡聚氨基酸两亲分子可注射抗菌水凝胶

技术领域

本发明属于材料领域，涉及一种基于寡聚氨基酸两亲分子抗菌水凝胶。

背景技术

随着社会现代化进程的推进与经济的快速发展，人类对生活质量的要求不断的提高，特别是对健康的重视程度越来越大，现有的生物医用材料已难满足人们不断增长的需求。与此同时，工业的迅速发展所带来的环境污染问题也越发严重，空气污秽不堪，河流、湖泊不复往日清澈透亮，各类细菌滋生，这些问题已严重的危害到了人们的健康生活。因而，开发一种环境友好的抗菌性生物材料，不管是在日常生活中还是医疗护理中都能够很好的保护人们不受各类病菌的侵害。

抗菌材料制品大致可分为两类：1、填充型，通过将抗菌剂与材料进行物理共混将具有抗菌作用的物质包覆其中；2、后加工型，通过喷涂、浸渍或化学反应的方式将抗菌剂赋予材料表面。而其中所用到的抗菌剂又可分为三类：1、无机抗菌剂，主要是利银、锌、铜等金属离子及其氧化物，他们可与细菌中的巯基、氨基发生作用而破坏蛋白质代谢起到抑菌作用；2、天然抗菌剂，如壳聚糖，可破坏细菌细胞膜而起到抑菌作用；3、合成高分子聚阳离子型抗菌剂，如聚季铵盐、聚双胍类等高分子，其抑菌机理与2类似。

在众多的抗菌材料中，抗菌水凝胶是其中一个很重要的分支，在医用辅料、药物释放、组织工程等领域具有很广泛的应用。传统的抗菌水凝胶多应用单一的抗菌剂与高分子材料混合制得，其使用范围有一定的局限性，难以满足医疗和日常生活当中所遇到的各种繁杂的抗菌需求，因而开发一种具有更为广谱使用范围的抗菌水凝胶材料来解决以上问题是非常迫切的。

发明内容

本发明的目的是提供一种一种基于寡聚氨基酸两亲分子抗菌水凝胶。

本发明提供的抗菌水凝胶，由两亲化合物与抗菌剂于溶剂中混匀静置而得；

所述两亲化合物选自式I、式II、式III和式IV所示化合物中的任意一种；

所述式I和式II中，R为H或

所述式III中，R′为-OH或

所述式IV中，R″为-OH或

m均为10、12、14或16，

n均为2～30的自然数，具体可为2-5的自然数，更具体可为3；

x均为1或2，

y均为2、3、4、5或6，

k均为1、2或3。

具体的，所述式I所示化合物为式V或式VIII所示化合物：

上述抗菌水凝胶中，所述抗菌剂选自聚阳离子型化合物、无机纳米金属颗粒和小分子抗菌药物中的至少一种；

其中，所述聚阳离子型化合物具体为聚α-赖氨酸、聚ε-赖氨酸、聚季铵盐类、聚季膦盐类、聚双胍盐类或壳聚糖；

所述聚阳离子型化合物的分子量为1,000Da–1,000,000Da，具体为5,000Da–50,000Da，更具体为10,000Da；

所述无机纳米金属颗粒具体为如下金属元素或其氧化物的纳米颗粒：银、锌、铜或钛；所述无机纳米金属颗粒的粒径为5nm-100nm；

所述小分子抗菌药物具体为青霉素类、头孢霉素类或氯霉素类药物；

所述溶剂为水、醇或盐的水溶液；所述盐的水溶液具体为生理盐水、细胞培养基、磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液或硼酸盐缓冲溶液。

所述两亲化合物与抗菌剂的质量比为1：0.10-5，具体可为1：0.128、1：0.64、1：1、1：1.28；

所述两亲化合物在所述抗菌水凝胶中的质量百分含量为0.05％-10％，具体可为1％。

所述静置步骤中，时间为30min～24h，具体可为2h。经过静置，即可自发形成自支撑的水凝胶网络结构，而具有抑菌性的聚阳离子型化合物、无机纳米金属颗粒或小分子抗菌药物则被包覆于水凝胶的网络结构之中。

本发明提供的制备所述抗菌水凝胶的方法，包括如下步骤：按照配比将前述两亲化合物与所述抗菌剂混合后在所需条件下进行静置，得到所述抗菌水凝胶。

另外，上述本发明提供的抗菌水凝胶由于具有剪切变稀的特性，因而可以作为一种可注射抗菌水凝胶，该抗菌水凝胶在制备抗菌产品中的应用，也属于本发明的保护范围。其中，所述抗菌为长效抗菌或短效抗菌；所述产品为药物或敷料；所述菌具体可为大肠杆菌。

具体的，可根据不同的抗菌需求，使用不同种类的抗菌剂与两亲分子进行共混制备得到具有相应抗菌功能的抗菌水凝胶：

(1)选用聚阳离子型化合物与两亲分子共混制备得到的抗菌水凝胶，由于聚阳离子被包覆和穿插于水凝胶网络之中并且被局限于水凝胶网络之中，从而可以减少聚阳离子抗菌剂的扩散，达到长效抗菌的效果，可应用于长效抗菌需求的场合；

(2)选用无机纳米金属颗粒与两亲分子共混制备得到的抗菌水凝胶，由于分散于水凝胶网络中的纳米金属颗粒可以实现有效的扩散，从而可以用作短期高效抗菌水凝胶；

(3)选用小分子抗菌药物与两亲分子共混制备得到的抗菌水凝胶，由于抗菌药物的抗菌特异性或广谱性，可用做医疗手术中特定场合下的伤口处理的抗菌水凝胶敷料等。所述的可注射抗菌水凝胶，其特征在于，可以简便的通过注射的方法将其铺展于需要进行抗菌处理的表面或内部，可用作医疗手术中的伤口表面抗菌水凝胶敷料等。

该抗菌水凝胶也可以简便的通过注射的方法将其铺展于需要进行抗菌处理的表面或内部，可用作日常生活中的一般性抗菌水凝胶等。

本发明提供的基于寡聚氨基酸两亲分子抗菌水凝胶，其制备方法所用原材料均具有可良好的生物相容性和生物降解性并且成本低廉，制备方法具有简单便捷、易于大量制备的优点，通过改变所包覆的抗菌剂种类可制备得到适应各种抗菌需求的抗菌水凝胶，在生物医用及日常用品抗菌材料领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1为不同聚ε-赖氨酸比例的水凝胶在15小时内对密度为10⁶CFU/ml大肠杆菌的生长的抑制情况。

图2为聚ε-赖氨酸比例为1：1.28的水凝胶在24小时内分别对密度为10⁶CFU/ml、10⁷CFU/ml、10⁸CFU/ml大肠杆菌的生长的抑制情况。

图3为式Ⅴ所示化合物¹H-NMR谱图。

图4为式Ⅴ所示化合物制备的不同浓度水凝胶材料的流变曲线。

图5为式Ⅴ所示化合物制备的水凝胶材料的流变回复曲线。

图6为式Ⅴ所示化合物对L929小鼠成纤维细胞的24小时细胞毒性实验结果。

图7为式Ⅷ所示化合物¹H-NMR谱图。

图8为式Ⅷ所示化合物制备的不同浓度水凝胶材料的流变曲线。

图9为式Ⅷ所示化合物制备的水凝胶材料的流变回复曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

下述实施例所用归属式I的式V所示化合物是按照如下方法制备而得：

(1)取10克γ-苄基-L-谷氨酸酯和5克三光气加入反应瓶中，在氮气保护条件下用200毫升的四氢呋喃将两者溶解，升温至50℃反应4小时，体系由浑浊变澄清，抽干溶剂，得淡黄色固体，用四氢呋喃和正己烷对其重结晶三次，得到白色针状晶体8.93克，产率80.47％。

(2)该步骤的开环聚合反应在氮气保护下的反应瓶中进行：取3克步骤(1)的白色产物，溶于60毫升四氢呋喃中，配制成50毫克/毫升的溶液。快速加入0.42克的十二胺。该体系中，步骤(1)得到的白色产物与十二胺的摩尔分数比为3:1。然后该体系在40℃下反应12小时。反应结束后，将反应液转移到单口瓶中，用旋转蒸发仪把反应液浓缩至100毫克/毫升。将反应液加入到大量的正己烷中，通过离心得到白色固体。产物质量2.38克，产率78.12％。

根据NMR谱图计算出其聚合度即氨基酸单元数为3，即n＝3。

(3)该步骤的反应在氮气保护下的反应瓶中进行：取2克步骤(2)的白色产物，溶于20毫升N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，配制成100毫克/毫升的溶液。加入9.13克乙醇胺和3.55克2-羟基吡啶。此体系中，谷氨酸单元、乙醇胺和2-羟基吡啶的摩尔份数比为1:20:5。此体系于45℃下反应72h，反应完毕后，浓缩反应液，用大量的乙醚沉淀，得黄色油状液体。将此黄色油状液体溶于水中，透析24h，冻干，得白色固体产物。产物质量0.61g，产率37％。该产物的¹H-NMR谱图如图3所示。由图可知，该产物结构正确，为目标化合物。

(4)将步骤(3)得到的白色固体以0.05％的质量分数溶解于水，经过几个小时的静置即可得到稳定的水凝胶；或将步骤(3)得到的白色固体以0.1％的质量分数溶解于生理盐水中，经过几个小时的静置即可得到稳定的生理盐水水凝胶。

式Ⅴ所示基于聚氨基酸的两亲分子水凝胶在不同浓度条件下其储能模量和损耗模量如图4所示，由此图可知，随着两亲分子的浓度增加凝胶强度也逐渐增强，说明我们可以通过改变两亲分子的浓度来调控水凝胶的强度；式Ⅴ所示基于聚氨基酸的两亲分子水凝胶在0.5％浓度下其凝胶的回复曲线如图5所示，在强剪切破坏后的水凝胶在15分钟内即可恢复到之前强度的90％以上，说明此水凝胶材料具有很好的剪切变稀以及快速恢复的特性，是一种良好的可注射水凝胶材料。

式Ⅴ所示的基于聚氨基酸两亲分子的细胞毒性实验

选取小鼠成纤维细胞L929作为实验对象，培养基选用1640培养基并加10％的FBS和1％的双抗，将式Ⅸ所示聚氨基酸两亲分子以一定的浓度溶解于上述培养基中，并以换液的方式将两亲分子溶液加至细胞已贴壁生长良好的细胞培养板中(每孔细胞密度约为1*10⁵)，在含5％CO₂的气氛、37℃无菌培养箱中培养24小时，通过CCK-8方法表征了该材料的24小时对L929细胞的细胞毒性情况。

式Ⅴ所示的基于聚氨基酸的两亲分子的细胞毒性实验结果如图6所示，即使在0.25毫克/毫升的高浓度条件下细胞存活率可达70％，说明该类材料具有良好的生物相容性，可用作生物医用材料。

归属式I的式Ⅷ所示化合物是按照如下方法制备而得：

(1)取10克β-苄基-L-天冬氨酸酯和5.33克三光气加入反应瓶中，在氮气保护条件下用200毫升的四氢呋喃将两者溶解，升温至50℃反应4小时，体系由浑浊变澄清，抽干溶剂，得淡黄色固体，用四氢呋喃和正己烷对其重结晶三次，得到白色针状晶体9.56克，产率85.62％。

(2)该步骤的聚合反应在氮气保护下的反应瓶中进行：取3克步骤(1)的白色产物，溶于60毫升四氢呋喃中，配制成50毫克/毫升的溶液。快速加入0.97克的十六胺。该体系中，步骤(1)得到的白色产物与十六胺的摩尔分数比为3:1。然后该体系在40℃下反应12小时。反应结束后，将反应液转移到单口瓶中，用旋转蒸发仪把反应液浓缩至100毫克/毫升。将反应液加入到大量的正己烷中，通过离心得到白色固体。产物质量2.83克，产率82.32％。

根据NMR谱图计算出其聚合度即天冬氨酸单元数为3，即n＝3。

(3)该步骤的反应在氮气保护下的反应瓶中进行：取2克步骤(2)的白色产物，溶于20毫升N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，配制成100毫克/毫升的溶液。加入8.55克乙醇胺和3.33克2-羟基吡啶。此体系中，天冬氨酸单元、乙醇胺和2-羟基吡啶的摩尔份数比为1:20:5。此体系于45℃下反应72h，反应完毕后，浓缩反应液，用大量的乙醚沉淀，得黄色油状液体。

将此黄色油状液体溶于水中，透析24h，冻干，得白色固体产物。产物质量1.05g，产率63.12％。

根据图7所示NMR谱图计算其胺解率为100％，且所得产物结构正确，为目标化合物。

(4)将步骤(3)得到的白色固体以0.8％的质量分数溶解于水，经过几个小时的静置即可得到稳定的水凝胶。

图8为式Ⅷ所示基于聚氨基酸的两亲分子制备的不同浓度水凝胶材料的流变曲线。由此图可知，随着两亲分子的浓度增加凝胶强度也逐渐增强，说明我们可以通过改变两亲分子的浓度来调控水凝胶的强度；

图9为式Ⅷ所示基于聚氨基酸的两亲分子制备的水凝胶材料的流变回复曲线。在强剪切破坏后的水凝胶在不到15分钟内即可恢复到之前强度的90％以上，说明此水凝胶材料具有很好的剪切变稀以及快速恢复的特性，是一种良好的可注射水凝胶材料。

实施例1、式V所示化合物包覆聚ε-赖氨酸抗菌水凝胶的制备及其抗菌性能测试

(1)将式V所示化合物与分子量为10,000Da的聚ε-赖氨酸分别按照1：0.128、1：0.64的质量比例进行混合，混合均匀后得到两者的混合物；

(2)所述混合物以两亲分子质量分数为1％比例完全溶解于纯水中，得到混合物水溶液；

(3)所述混合物水溶液加入培养皿中室温下静置1小时，即可自发在皿底部形成一层水凝胶薄层；

(4)在水凝胶表面加入10⁶CFU/ml的大肠杆菌，培养15小时，通过测试相应样品的OD_620nm值表征了以上2种比例的样品抑菌率，分别为41％，62％。

实施例2、式VIII所示化合物包覆聚ε-赖氨酸抗菌水凝胶的制备及其抗菌性能测试

(1)将式VIII所示化合物与分子量为10,000Da的聚ε-赖氨酸分别按照1：0.128、1：0.64、1：1.28的质量比例进行混合，混合均匀后得到两者的混合物；

(3)所述混合物水溶液加入培养皿中室温下静置2小时，即可自发在皿底部形成一层水凝胶薄层；

(4)在水凝胶表面加入10⁶CFU/ml的大肠杆菌，培养15小时，见图1，通过测试相应样品的OD_620nm值表征了以上3种比例的样品抑菌率，分别为31％，50％，74％。

实施例3、式VIII所示化合物包覆聚ε-赖氨酸抗菌水凝胶的制备及其抗菌性能测试

(4)在水凝胶表面加入10⁶CFU/ml的大肠杆菌，培养24小时，通过测试相应样品的OD_620nm值表征了以上3种比例的样品抑菌率，分别为17％，29％，93％。

实施例4、式VIII所示化合物包覆聚ε-赖氨酸抗菌水凝胶的制备及其抗菌性能测试

(4)在水凝胶表面加入10⁷CFU/ml的大肠杆菌，培养24小时，通过测试相应样品的OD_620nm值表征了以上3种比例的样品抑菌率，分别为6％，19％，49％。

实施例5、式VIII所示化合物包覆聚ε-赖氨酸抗菌水凝胶的制备及其抗菌性能测试

(1)将式VIII所示化合物与分子量为10,000Da的聚ε-赖氨酸按照1：1.28比例进行混合，混合均匀后得到两者的混合物；

(4)在水凝胶表面分别加入10⁶CFU/ml、10⁷CFU/ml、10⁸CFU/ml的大肠杆菌，培养24小时，见图2，通过测试相应样品的OD_620nm值表征了样品对3种密度的大肠杆菌的抑菌率，分别为93％，49％，22％。

Claims

1.一种抗菌水凝胶，由两亲化合物与抗菌剂于溶剂中混匀静置而得；

所述式I和式II中，R为H或

所述式III中，R′为-OH或

所述式IV中，R″为-OH或

m均为10、12、14或16，

n均为2～30的自然数，

x均为1或2，

y均为2、3、4、5或6，

k均为1、2或3。

2.根据权利要求1所述的抗菌水凝胶，其特征在于：所述抗菌剂选自聚阳离子型化合物、无机纳米金属颗粒和小分子抗菌药物中的至少一种；

其中，所述聚阳离子型化合物的分子量为1,000Da–1,000,000Da；

所述无机纳米金属颗粒的粒径为5nm-100nm；

所述溶剂为水、醇或盐的水溶液。

3.根据权利要求2所述的抗菌水凝胶，其特征在于：所述聚阳离子型化合物为聚α-赖氨酸、聚ε-赖氨酸、聚季铵盐类、聚季膦盐类、聚双胍盐类或壳聚糖；

所述无机纳米金属颗粒为如下金属元素或其氧化物的纳米颗粒：银、锌、铜或钛；

所述小分子抗菌药物为青霉素类、头孢霉素类或氯霉素类药物；

所述盐的水溶液为生理盐水、细胞培养基、磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液或硼酸盐缓冲溶液。

4.根据权利要求1或2所述的抗菌水凝胶，其特征在于：所述两亲化合物与抗菌剂的质量比为1：0.10-5；

所述两亲化合物在所述抗菌水凝胶中的质量百分含量为0.05％-10％。

5.根据权利要求1或2所述的抗菌水凝胶，其特征在于：所述静置步骤中，时间为30min～24h。

6.一种制备权利要求1-5中任一所述抗菌水凝胶的方法，包括如下步骤：按照配比将权利要求1-5中任一所述两亲化合物与所述抗菌剂混合后在进行所述静置，得到所述抗菌水凝胶。

7.权利要求1-5中任一所述抗菌水凝胶在制备抗菌产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述抗菌为长效抗菌或短效抗菌；

所述产品为药物或敷料。