CN108956838A - 农产品中氨基葡萄糖含量的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种农产品中氨基葡萄糖含量的检测方法，依次包括样品前处理、样品的衍生化处理、标准品的衍生化处理、高效液相色谱分析等步骤。本发明采用1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮（PMP）作为柱前衍生化试剂衍生处理农产品和标准品，利用C18柱于250nm处检测氨基葡萄糖，再根据标准品出峰时间和峰面积通过内标法对照计算出农产品中氨基葡萄糖含量。本发明能准确方便测定农产品中氨基葡萄糖含量。

Description

农产品中氨基葡萄糖含量的检测方法
技术领域
本发明涉及一种农产品中氨基葡萄糖含量的检测方法。
背景技术
氨基葡萄糖是广泛存在于虾、蟹、昆虫、蝇蛆等甲壳动物和软体动物的外壳，也存在于微生物和真菌的细胞壁。氨基葡萄糖是动物纤维素的最基本单位，也是人体细胞的重要组分。人体摄入氨基葡萄糖可以活化细胞，修复受损细胞，防止细胞突变，带正电荷的氨基结合人体细胞液中的H+，能调节细胞间液的酸碱平衡，也可以吸附血管壁带负电荷的沉积物，预防高血压和动脉硬化，因此科学家们将其称之为人体所必需的生命第六要素。
氨基葡萄糖活性极强，易氧化，在植物体中主要以盐酸氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖两种形式存在。盐酸氨基葡萄糖能提高骨与软骨组织的代谢功能与营养，亦能改善及增强滑膜液的粘稠度，增加滑膜液合成，提供关节润滑功能，可阻断骨关节炎的病理过程，防治疾病进展，改善关节活动功能，缓解关节疼痛，抑制及消退关节变性形成。N-乙酰氨基葡萄糖是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位，是合成双歧因子的重要前提，在生物体内具有许多重要生理功能，主要用于临床增强人体免疫系统的功能，抑制癌细胞或纤维细胞的过度生长，对癌症和恶性肿癌起到抑制和治疗作用；对于各种炎症，能起到有效的治疗，对骨关节炎及关节疼痛也有治疗作用。
人们从日常膳食中能汲取的氨基葡萄糖含量微乎其微，因此需要氨基葡萄糖含量更丰富的食物。提高农作物内的氨基葡萄糖含量，可以提高农产品的营养价值，有利于人们生活质量的提高，这也是绿色农产品、健康食品的发展趋势。
实践证明，农产品吸收氨基葡萄糖后其营养成分、食用口感大幅提高。例如西瓜在喷施含氨基多糖硒肥料后，影响西瓜口感和品质的主要指标β-胡萝卜素提高86％，果糖提高36％，总糖量提高22％，抗癌物质硒元素从无到有含量达到200μg/kg。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能准确方便测定农产品中氨基葡萄糖含量的检测方法。
本发明的技术解决方案是：
一种农产品中氨基葡萄糖含量的检测方法，其特征是：依次包括下列步骤：
(1)样品前处理：将农产品粉碎打浆或打浆后加水，收集浆液或滤液；然后将浆液或滤液经旋转蒸发仪减压蒸发浓缩，浓缩至干后加水溶解，留取稀释液；
(2)样品的衍生化处理
取所述稀释液，加NaOH溶液混匀，进一步加-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液，放入恒温水浴锅中反应，然后冷却至室温后加入盐酸溶液以中和氢氧化钠，并加入双蒸水混匀；再加入氯仿，涡旋，去除氯仿有机相，最后吸取上层水相溶液，过滤，备用；
(3)标准品的衍生化处理
取标准品样液，照上述样品的衍生化处理步骤操作；最后收集水相溶液经过滤后作为液相分析的对照品溶液；
(4)高效液相色谱分析
分析色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；以0.1mol/L磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相；检测器为可变波长检测器；检测波长为250nm；分别记录标准品及样品：标准品＝1：1的色谱图，按内标法以峰面积计算样品中氨基葡萄糖含量。
步骤(1)中“将农产品粉碎打浆或打浆后加水，收集浆液或滤液”的具体方法是：对蔬果类农产品直接粉碎机打浆，再加水离心，取上清溶液；
对粮食类农产品经粉碎机粉碎后加水并过滤、离心，并进一步用硅藻土过滤，收集滤液；
步骤(1)中“将浆液或滤液经旋转蒸发仪减压蒸发浓缩，浓缩至干后加水溶解，留取稀释液”的具体方法是：
将收集的蔬果类农产品上清溶液或粮食类农产品滤液，放于烧瓶内，利用旋转蒸发仪减压蒸发浓缩，蒸发温度设定为40℃，待烧瓶内样品浓缩至干，加入蒸馏水，充分溶解圆底烧瓶内容物，留取稀释液，待用。
步骤(2)的具体方法是：取所述稀释液，置于离心管中；先向离心管内加入0.6mol/L的NaOH溶液,混匀；再向离心管中加入0.4mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液，混匀；将离心管放入60℃的恒温水浴锅中反应100min；拿出离心管冷却至室温；再向离心管内加入0.3mol/L的盐酸溶液以中和氢氧化钠，然后加入双蒸水混匀，再加入氯仿，涡旋3min，去除氯仿有机相；过0.45μm水系滤膜，备用。
农产品中糖分含量丰富，品种较多，农产品是否含有氨基葡萄糖存在与否，农产品中的氨基葡萄糖以何种化合物形式存在，农产品中氨基葡萄糖的具体含量是多少，采用常规的195nm氨基柱测定氨基葡萄糖含量难以将目的峰与杂峰分离开来；本发明采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)作为柱前衍生化试剂衍生处理农产品和标准品，利用C18柱于250nm处检测氨基葡萄糖，再根据标准品出峰时间和峰面积通过内标法对照计算出农产品中氨基葡萄糖含量。本发明能准确方便测定农产品中氨基葡萄糖含量。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是实施例1中标准品图谱(盐酸氨基葡萄糖+乙酰氨基葡萄糖)；
图2是对照组西瓜图谱；
图3是试验A组西瓜图谱；
图4是试验B组西瓜图谱；
图5是试验C组西瓜图谱；
图6是实施例2中标准品图谱(盐酸氨基葡萄糖+乙酰氨基葡萄糖)；
图7是对照组玉米图谱；
图8是对照组玉米+标准品图谱；
图9是试验组玉米图谱；
图10是试验组玉米+标准品图谱。
具体实施方式
实施例1：称取西瓜50g，置于研钵中充分捣碎，分装至2mL离心管内12000rpm离心10min，吸取上清。将收集的上清溶液，吸取10mL于50mL圆底烧瓶内，利用旋转蒸发仪减压蒸发浓缩，待圆底烧瓶内样品浓缩至干，加入2mL蒸馏水，充分溶解圆底烧瓶内容物。
量取25μL的溶液，置于2mL的离心管中；先向离心管内加入0.6mol/L的NaOH溶液25μL,混匀；再向离心管中加入0.4mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液50μL，混匀30s。将离心管放入60度的恒温水浴锅中反应100min；拿出离心管冷却至室温；再向离心管内加入0.3mol/L的盐酸溶液50μL以中和氢氧化钠，然后加入双蒸水850μL混匀。再加入1mL氯仿，涡旋3min，低速离心机以4000r/min，离心5min，去除氯仿有机相，自加入氯仿起重复2次，过0.45μm水系滤膜。
精密量取25μL标准品样液，照上述样品的衍生化处理步骤操作；最后收集水相溶液经0.45μm水系滤膜过滤后作为液相分析的对照品溶液。
分析色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；以0.1mol/L磷酸盐缓冲液(Ph6.7)-乙腈(83:17)为流动相；流速为1mL/min；柱温为30℃；检测器为可变波长检测器；检测波长为250nm；进样体积为20μL；检测时间为90min,分别记录标准品及样品：标准品＝1：1的色谱图。按内标法以峰面积计算样品中氨基葡萄糖含量(见附图1至图5)。
根据出峰时间所对应的峰面积计算样品中氨基葡萄糖及乙酰氨基葡萄含量，已知样品进行了5倍浓缩，故在计算浓度时应除以浓缩倍数。
表1 西瓜氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖浓度检测结果
表1说明：标准品为盐酸氨基葡萄糖与乙酰氨基葡萄糖标准混合液，浓度各为1mg/ml；对照组为常规种植方式处理的西瓜样品溶液；三组试验组分别为三种不同种植方式处理的西瓜样品溶液，分别为实验组A喷施氨基葡萄水溶肥、实验组B氨基葡萄糖水溶肥水肥一体化与喷施结合、实验组C氨基葡萄糖水溶肥根施与喷施结合。
实施例2：将冷冻过的玉米样品解冻后拨粒粉碎机粉碎处理得玉米渣，称重150g，加水300g，玻棒搅匀，放入搅拌子，于磁力搅拌器上室温搅拌0.5h，经纱布过滤后得玉米液。将玉米液经离心机离心(转速5000r/min，时间10min)，再进硅藻土过滤得滤液。
吸取21mL滤液(分两次加入11ml，10ml)于50mL圆底烧瓶内，利用旋转蒸发仪减压蒸发浓缩(水浴温度65℃，真空度-0.09MPa)，待圆底烧瓶内样品浓缩至干，加入3mL蒸馏水，充分溶解圆底烧瓶内容物。
量取50μL的溶液，置于5mL的离心管中；先向离心管内加入0.6mol/L的NaOH溶液50μL，混匀；再向离心管中加入0.4mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液100μL，混匀30s。将离心管放入60℃的恒温水浴锅中衍生反应100min；拿出离心管冷却至室温；再向离心管内加入0.3mol/L的盐酸溶液100μL以中和氢氧化钠，然后加入双蒸水1700μL混匀。再加入2mL氯仿，涡旋3min，静止5min，去除氯仿有机相，自加入氯仿起重复2次，过0.45μm水系滤膜。
精密量取50μL标准品样液，照上述样品的衍生化处理步骤操作；最后收集水相溶液经0.45μm水系滤膜过滤后作为液相分析的对照品溶液。
分析色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；以0.1mol/L磷酸盐缓冲液(Ph6.7)-乙腈(83:17)为流动相；流速为1mL/min；柱温为30℃；检测器为可变波长检测器；检测波长为250nm；进样体积为20μL(标准品进样体积为10μL)；检测时间为90min，分别记录标准品、供试品(样品：标准品＝1：1)的色谱图。按内标法以峰面积计算样品中氨基葡萄糖含量(见附图6至图10)。
根据出峰时间所对应的峰面积计算样品中氨基葡萄糖及乙酰氨基葡萄糖含量，已知样品进行了5倍浓缩，故在计算浓度时应除以浓缩倍数。
表2 玉米氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖浓度检测结果
表2说明：标准品为盐酸氨基葡萄糖与乙酰氨基葡萄糖标准混合液，浓度各为1mg/ml；对照组为常规种植方式处理的玉米样品溶液；对照组+标准品为常规种植方式处理的玉米样品溶液与盐酸氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖标准混合液按1：1混合；试验组为喷施氨基葡萄糖水溶肥种植出的玉米样品溶液；试验组+标准品为喷施氨基葡萄糖水溶肥种植出的玉米样品溶液与盐酸氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖标准混合液按1：1混合。

Claims (3)

1.一种农产品中氨基葡萄糖含量的检测方法，其特征是：依次包括下列步骤：
（1）样品前处理：将农产品粉碎打浆或打浆后加水，收集浆液或滤液；然后将浆液或滤液经旋转蒸发仪减压蒸发浓缩，浓缩至干后加水溶解，留取稀释液；
（2）样品的衍生化处理
取所述稀释液，加NaOH 溶液混匀，进一步加-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液，放入恒温水浴锅中反应，然后冷却至室温后加入盐酸溶液以中和氢氧化钠，并加入双蒸水混匀；再加入氯仿，涡旋，去除氯仿有机相，最后吸取上层水相溶液，过滤，备用；
（3）标准品的衍生化处理
取标准品样液，照上述样品的衍生化处理步骤操作；最后收集水相溶液经过滤后作为液相分析的对照品溶液；
（4）高效液相色谱分析
分析色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；以0.1mol/L磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相；检测器为可变波长检测器；检测波长为250nm；分别记录标准品及样品：标准品=1：1的色谱图，按内标法以峰面积计算样品中氨基葡萄糖含量。
2.根据权利要求1所述的农产品中氨基葡萄糖含量的检测方法，其特征是：步骤（1）中“将农产品粉碎打浆或打浆后加水，收集浆液或滤液”的具体方法是：对蔬果类农产品直接粉碎机打浆，再加水离心，取上清溶液；
对粮食类农产品经粉碎机粉碎后加水并过滤、离心，并进一步用硅藻土过滤，收集滤液；
步骤（1）中“将浆液或滤液经旋转蒸发仪减压蒸发浓缩，浓缩至干后加水溶解，留取稀释液”的具体方法是：
将收集的蔬果类农产品上清溶液或粮食类农产品滤液，放于烧瓶内，利用旋转蒸发仪减压蒸发浓缩，蒸发温度设定为40℃，待烧瓶内样品浓缩至干，加入蒸馏水，充分溶解圆底烧瓶内容物，留取稀释液，待用。
3. 根据权利要求1所述的农产品中氨基葡萄糖含量的检测方法，其特征是：步骤（2）的具体方法是：取所述稀释液，置于离心管中；先向离心管内加入0.6mol/L 的NaOH 溶液, 混匀；再向离心管中加入0.4mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液，混匀；将离心管放入60℃的恒温水浴锅中反应100min；拿出离心管冷却至室温；再向离心管内加入0.3 mol/L的盐酸溶液以中和氢氧化钠，然后加入双蒸水混匀，再加入氯仿，涡旋3min，去除氯仿有机相；过0.45μm 水系滤膜，备用。
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