CN108956794B - 生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法 - Google Patents

生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108956794B
CN108956794B CN201810359782.6A CN201810359782A CN108956794B CN 108956794 B CN108956794 B CN 108956794B CN 201810359782 A CN201810359782 A CN 201810359782A CN 108956794 B CN108956794 B CN 108956794B
Authority
CN
China
Prior art keywords
paclobutrazol
plant growth
growth regulators
benzyladenine
benzylaminopurine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810359782.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108956794A (zh
Inventor
崔冠峰
任昕昕
宋歌
王瑞花
王爱华
董林沛
侯小平
常靖
董颖
黄健
张云峰
魏春明
杜鸿雁
王芳琳
于忠山
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Original Assignee
Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC filed Critical Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Priority to CN201810359782.6A priority Critical patent/CN108956794B/zh
Publication of CN108956794A publication Critical patent/CN108956794A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108956794B publication Critical patent/CN108956794B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开生物体液中植物生长调节剂6‑苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法，包括如下步骤：(1)生物体液预处理；(2)植物生长调节剂的检测。本发明中生物体液中6‑苄基腺嘌呤和多效唑在血液及尿液中，在10μg/mL添加水平上，方法的回收率可达80％，精密度小于11％。生物体液中6‑苄基腺嘌呤、多效唑的GC‑MS方法的的检出限为0.3μg/mL，仪器检出限为0.5μg/mL。建立染毒动物模型，通过测定6‑苄基腺嘌呤和多效唑两种植物生长调节剂在染毒大鼠血液中浓度，验证方法的可靠性,为植物生长调节剂相关中毒案件的检验提供科学依据。

Description

生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测 方法
技术领域
本发明涉及法医药品分析领域。更具体地，涉及一种生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法。
背景技术
植物生长调节剂是用于调节植物生长发育的一类农药，可在植物体内传导至作用部位，以促进或抑制其生命过程中的某些环节，使之向符合人类的需要发展。随着农业现代化进程的加速推进，运用植物生长调节剂调控植物的生长发育和产量形成(即作物化学控制技术)，已经逐渐成为农业生产中不可缺少的重要措施。与传统农药相比,植物生长调节剂具有许多优越性，它能够调控基因的表达，实现作物生长的“人为”调控。国内外已经把植物生长调节剂的应用作为21世纪农业实现超产的主要措施之一。
6-苄氨基嘌呤、多效唑是近年来案件中常出现较多的植物生长调节剂。6-苄氨基嘌呤和多效唑的物化性质及药物性质总结如下：
1、6-苄氨基嘌呤
6-苄氨基嘌呤又名6-苄基腺嘌呤，英文名称6-Benzylaminopurine，简称6-BA，分子式为C12H11N5，分子量为225.2，熔点230-233℃，难溶于水，在醇中溶解度较大。
6-苄氨基嘌呤是一种人工合成的细胞分裂素,在植物体内含量甚微,但对植物的生长发育具有显著的影响,其主要作用是促进细胞的分裂和扩大,促进侧芽的发育,抑制衰老、保绿等,具有诱导同化物向施用部位定向运输的作用，广泛用在农业、果树和园艺作物从发芽到收获的各个阶段。6-苄氨基嘌呤属低毒类农药，LD50(口服)：大鼠(雄性)2965mg/kg，大鼠(雌性)1005mg/kg。
2、多效唑
多效唑，又名氟丁唑，英文名paclobutrazol，其化学名为：(2RS,3RS)-1-(4-氯苯基)-4,4-二甲基-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-戊-3-醇，分子式C15H2OClN3O，分子量为293.8，熔点165-166℃，易溶于水、甲醇。
这两种植物生长调节剂具有共同的特点：均为化学合成类农药，在生产上被作为生长促进剂广泛应用，尤其是可促进细胞分裂的“无根素”—6-苄氨基嘌呤，在豆芽生产过程中的添加滥用现象更为普遍。因此建立生物体液(血、尿)中两种植物生长调节剂的快速灵敏的检验方法，并利用简单的动物模型，反应其在血液中的代谢情况以解决案件中的检验难题，是法庭科学的实际工作中的现实需要。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种简便快速、灵敏度高、重现性好、结果准确可靠的生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法，包括如下步骤：
(1)生物体液预处理；
(2)植物生长调节剂的检测。
上述生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法，步骤(1)中，生物体液为血液或尿液。
上述生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法，步骤(1)中，6-苄氨基嘌呤和多效唑采用液-液萃取法。
上述生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法，步骤(1)中，所述液-液萃取法的萃取溶剂为环己烷、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、或氯仿和异丙醇按照体积比为3:1组成的混合溶液。
上述生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法，步骤(1)中，所述液-液萃取法包括如下步骤：取含6-苄氨基嘌呤和多效唑生物体液1mL，加入环己烷、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿和异丙醇按照体积比为3:1组成的混合溶液振荡提取，离心10min、转速为8000r/min，转移有机相至尖底玻璃试管中，重复提取一次，合并有机相，50℃空气流下挥干，残渣用100μL甲醇溶解定容留待GC-MS检测；或者过0.22μm的有机微孔滤膜，所得物即为液-液萃取法预处理液，留待GC-MS检测。
上述生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法，步骤(2)中，利用气相色谱质谱GC/MS检验方法检测含6-苄氨基嘌呤和多效唑生物体液中6-苄氨基嘌呤和多效唑含量时的色谱条件及质谱条件如下：
气相色谱条件：色谱柱：DB-5MS弹性石英毛细管柱，规格：30m×0.25mm×0.25μm；程序升温：80℃起始，保持2min，以30℃/min升至280℃，保持15min；进样口温度280℃；载气：氦气；流速：1mL/min；分流比：10:1；进样量1μL；
质谱条件：传输线温度200℃；离子源温度200℃；离子源：EI，电子轰击能量70eV；扫描方式：SCAN；扫描范围：40amu～450amu；溶剂延迟时间：2.5min。
上述生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法，含6-BA和多效唑生物体液保存在-20℃条件下，保存时间小于或等于1个月；经冷冻的含6-BA和多效唑体液，冻融后72h内进行检测。
本发明的有益效果如下：
(1)生物体液中6-苄基腺嘌呤和多效唑在血液及尿液中，在10μg/mL添加水平上，方法的回收率可达80％，精密度小于11％。
(2)生物体液中6-苄基腺嘌呤、多效唑的GC-MS方法的检出限为0.3μg/mL，仪器检出限为0.5μg/mL。
(3)建立染毒动物模型，通过测定6-苄基腺嘌呤和多效唑两种植物生长调节剂在染毒大鼠血液中浓度，验证方法的可靠性,为植物生长调节剂相关中毒案件的检验提供科学依据。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1 6-苄氨基嘌呤的化学结构；
图2多效唑的化学结构；
图3 6-BA标准工作曲线；
图4多效唑标准工作曲线；
图5空白血样6-BA的提取离子流图；
图6添加血样中6-BA的提取离子流图；
图7空白尿样6-BA的提取离子流图；
图8添加尿样中6-BA的提取离子流图；
图9空白血样多效唑的提取离子流图；
图10添加血样中多效唑的提取离子流图；
图11空白尿样多效唑的提取离子流图；
图12添加尿样中多效唑的提取离子流图；
图13 6-BA质谱图；
图14多效唑质谱图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
第一部分生物体液中6-苄氨基嘌呤多效唑检测方法
一、实验部分
1实验材料
1.1药品与试剂
6-苄基腺嘌呤购自Dr.Ehrenstorfer公司(德国)，纯度99.0％；
多效唑购自Dr.Ehrenstorfer公司(德国)，纯度99.0％；
甲醇(色谱纯，Fisher Scientific公司)；
乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、(分析纯，北京化学试剂公司)；
0.22μm过滤膜(北京八方公司)；
去离子水经Millipore simplicity纯水系统制备。
1.2生物样品
空白人全血购自北京市红十字血液中心；
空白尿采自一周内未服用任何药物的健康志愿者。
1.3标准溶液的配制
1.3.1储备液的配制：
6-苄氨基嘌呤储备液的配制：精确称取6-苄氨基嘌呤标准品10mg于10mL容量瓶中，加少量甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/mL的6-苄氨基嘌呤储备液，4℃冰箱中保存，备用。
多效唑储备液的配制：精确称取多效唑标准品10mg于10mL容量瓶中，加少量甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/mL的多效唑储备液，4℃冰箱中保存，备用。
1.3.2工作液的配制：
单一标准工作液的配置：移取各标准储备液一定量，稀释成浓度为100μg/mL、50μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL的6-苄氨基嘌呤的单一标准工作溶液、以及多效唑的单一标准工作溶液，避光4℃冰箱中保存。
混合标准物质工作液：移取一定量的标准物质储备液稀释成6-苄氨基嘌呤和多效唑浓度均为100μg/mL、50μg/mL 10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL浓度的6-苄氨基嘌呤和多效唑的混合标准系列溶液，避光4℃冰箱中保存。
1.4仪器及参考条件
岛津2010GC-NPD，2010GC-MS(日本)；
BP210s电子天平(德国Sartorius公司)；
Millipore SimLicity纯水净化系统(法国)；
Scientific Industries漩涡振荡器(USA)；
SORVALL高速冷冻离心机(德国)；
EYELA高速振荡器(日本)；
DSY-Ⅱ自动快速浓缩仪(北京精华苑科技有限公司)；
EYELA CUTE MIXER CM100振荡器(日本京东)；
10～100μL，10～1000μL自动移液枪(德国Eppendorf)。
2样品的制备方法
本发明用液-液萃取法对血液、尿液中植物生长调节剂的不同溶剂的萃取效率进行了比较，具体操作如下：
取血或尿液1mL，乙酸乙酯振荡提取，高速离心(8000r/min，10min)，转移有机相至尖底玻璃试管中，重复提取一次，合并有机相，50℃空气流下挥干，残渣用100μL甲醇溶解定容，供GC-MS分析；或过0.22μm的有机微孔滤膜后，供GC-MS分析。
3仪器参考条件
3.1气相色谱质谱条件(GC/MS)条件：
色谱条件：
a)色谱柱：DB-5MS弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；
b)程序升温：80℃起始，保持2min，以30℃/min升至280℃，保持15min；
c)进样口温度280℃；
d)载气：He；
e)流速：1mL/min；
f)分流比：10:1；
g)进样量1μL。
质谱条件：
h)离子源温度200℃；
i)离子源：EI，电子轰击能量70eV；
j)扫描方式：SCAN；
k)扫描范围：40amu～450amu；
l)溶剂延迟时间：2.5min。
4、方法的确证
4.1液液萃取-气相色谱质谱检验方法
按照“2.1液液萃取法”对样品进行处理，按照“3.1气相色谱质谱分析条件”进行仪器检测，对方法进行方法论证。包括方法的专属性、灵敏度、回收率、精密度等指标。
4.1.1标准工作曲线
用移液器精确吸取标准工作液适量，用甲醇稀释定容成最终浓度为1、5、10、50、100μg/mL的标准工作液，各取1μL分别进样，每个样品平行进样三次，用6-BA的定量离子(225)和多效唑的定量离子(236)的峰面积(Y)对标准浓度(X)进行线性回归，求得6-BA的的回归方程为y＝13369x-34074 R2＝0.999，多效唑的回归方程为y＝20858x-18952 R2＝0.999，工作曲线见图3、4。结果表明此两种植物生长调节剂在1～100μg/mL浓度范围内有着良好的线性关系。
4.1.2方法专属性
取空白血或尿，加入一定量的6-BA和多效唑标准溶液，按照“2.1液液萃取方法”进行样品制备，“3.1气相色谱质谱分析条件”进行分析检测，同时做空白血的对照试验，将二者的图谱进行比较(见图5至图12)。结果在6-BA和多效唑时间段内，空白血及尿均未出现明显的色谱峰，表明生物体液中内源性杂质不会对此两种植物生长调节剂的的测定造成干扰，说明本发明建立的方法具有较高的专属性。
4.1.3方法的回收率
用标准加入法进行回收率实验，取空白的血样、尿样，分别加入一系列浓度的6-BA和多效唑混合标准工作液，使其在每一种样品中6-BA和多效唑的添加浓度均分别为1、5、10μg/mL，每一样品每一浓度平行3份，按照“2.1液液萃取方法”进行样品制备，“3.1气相色谱质谱分析条件”进行分析检测，以测得的添加各样品中两种植物生长调节剂的定量离子的峰面积与对照品相同浓度峰面积的比值来计算回收率，结果见表1。
表1生物检材中添加植物生长调节剂的平均回收率(％)n＝3
Figure GDA0001737046600000071
4.1.4方法线性考察
取空白的血样、尿样，分别加入适量的6-BA、多效唑标准液，使6-BA、多效唑在每一种样品中的添加浓度均分别为1、5、10、50、100μg/mL，每一样品每一浓度平行3份，按照“2.1液液萃取方法”进行样品制备，“3.1气相色谱质谱分析条件”进行分析检测，以测得的添加各样品中两种植物生长调节剂的定量离子的峰面积为纵坐标(Y)，以样品中添加两种植物生长调节剂的浓度为横坐标(X)，进行线性回归，求得线性回归方程，结果如下：
血液中6-BA:y＝31353x-38125 R2＝0.999
尿液中6-BA:y＝11689x+18301 R2＝0.997
血液中多效唑:y＝12115x+38684 R2＝0.997
尿液中多效唑:y＝83639x+15998 R2＝0.999
以上结果表明，该方法对血液、尿液样本中的6-BA和多效唑在1μg～100μg/mL范围内有着良好的线性关系。
4.1.5方法的精密度
用标准溶液加入法对方法的精密度进行考察。取空白的血样、尿样，加入适量的6-BA、多效唑标准液，使6-BA、多效唑在每一种样品中的添加浓度均分别为1、5、10μg/mL，每一样品每一浓度平行3份，按照“2.1液液萃取方法”进行样品制备，“3.1气相色谱质谱分析条件”进行分析检测，每份样品平行进样3次，连续测定三天，计算各组分峰面积的标准偏差，得到日内精密度与日间精密度(见表2、3)。结果表明6-BA日内精密度介于3.42～5.85％之间，日间精密度介于4.87～8.33％之间，多效唑日内精密度介于4.41～9.31％之间，日间精密度介于4.91～10.29％之间，说明该方法的重现性良好。
表2尿液样品中添加植物生长调节剂的精密度实验n＝3
Figure GDA0001737046600000072
Figure GDA0001737046600000081
表3血液样品中添加植物生长调节剂的精密度实验n＝3
Figure GDA0001737046600000082
4.1.6方法的灵敏度
依据“2.1液液萃取方法”进行样品制备，“3.1气相色谱质谱分析条件”进行分析检测，以信噪比3/1计，该方法的最小检出限为0.3μg/mL，以信噪比10/1计，该方法的最小定量限为0.5μg/mL。
一、结果与讨论
2.1样品制备方法选择
2.1.1液-液萃取方法
萃取溶剂的选择：液-液萃取中最关键的步骤是萃取溶剂的选择，它会直接影响到萃取效果，尤其是对于中性药毒物。本发明对环己烷、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿:异丙醇(体积比3:1)五种萃取溶剂，在中性条件下对尿液中添加6-BA和多效唑进行了比较(对1mL含6-BA和多效唑10μg/mL的水样进行萃取，每种溶剂平行3份)，结果如表4表明二氯甲烷对多效唑的萃取效果较好而乙酸乙酯对6-BA的萃取效果较好，二氯甲烷作萃取溶剂二者共同的萃取溶剂较为理想，但由于二氯甲烷比重较大，萃取后有机溶剂在试管底部，不易进行操作，而且提取过程中很容易发生乳化，因此本发明选用乙酸乙酯做萃取溶剂。
表4不同萃取溶剂的选择(n＝3)
Figure GDA0001737046600000083
2.2分析条件的选择
2.2.1气相色谱质谱条件的选择：
气相色谱质谱，最大的优势是有固定的谱库(NIST)，可对未知物进行排查，6-BA和多效唑的质谱图与NIST谱库里的相一致见图13、14)。在本发明中，通过优化升温程序，使目标物尽可能的与杂质分开，得到了良好的效果。
二、结论
本发明建立了生物体液中6-BA、多效唑的液-液萃取前处理方法和气相色谱质谱方法。所建立的方法回收率高、重现性好、提取产物较干净。添加的平均回收率在80％以上，方法简便快速、灵敏度高、重现性好、结果准确可靠，为进一步研究6-BA、多效唑的染毒动物实验及稳定性考察提供了技术手段。本发明方法可满足涉及此两种植物生长调节剂中毒案件的检测。
第二部分稳定性考察
植物生长调节剂6-BA、多效唑在不同的介质及不同的储存条件下放置过久其含量可能发生变化，为保证定量的准确，必须对植物生长调节剂6-BA、多效唑的稳定性进行考察。在毒物分析中从现场检材的提取到送实验室检验，需要经历一定的时间段，由于植物生长调节剂6-BA、多效唑本身的理化性质及生物样品中一些内源性物质的作用，可能导致植物生长调节剂6-BA、多效唑在生物检材中发生分解。所以检材存放的条件和时间对植物生长调节剂6-BA、多效唑的浓度有很大的影响，本发明对两种植物生长调节剂6-BA、多效唑在不同溶剂和血液样本中的稳定性进行了考察。
一、试剂、材料与仪器(同前)
二、实验部分
2.1溶液中稳定性考察
分别配制含10、50、100μg/mL 6-BA和多效唑的甲醇溶液，每一浓度各3份，密封，置于4℃冰箱中保存，放置0、1、2、3、4周后，按“第一部分3分析方法”对样品进行分析，每次结果与浓标新稀释后的相同浓度的作比较，此两种植物生长调节剂在1、2、3、4周的测定结果相互间差异无统计学意义(P>0.05)，说明两种植物生长调节剂的甲醇溶液在4℃冰箱中1月内具有稳定性。
2.2提取样品反复冻融的稳定性的考察
用空白血或空白尿的提取液，配置20μg/mL的两种药物溶液3份，-20℃保存，放置24、48、72h后，按“第一部分3.1分析方法”对样品反复进行分析，(分析完样品密封保存，待下一时间点分析)，每次分析结果与标准品进行比较，结果两种药物在72小时的测定结果相互间差异无统计学意义(P>0.05)，说明两种植物生长调节剂在提取样品溶液中72h内具有稳定性。
2.3两种植物生长调节剂在血液、尿液中稳定性的考察
准备1mL血液及尿若干份于塑料试管中，向每份中添加1μg的6-BA和1μg的多效唑两种标准物质，6-BA和多效唑合并添加为一组将其分成2份，每份中有5组、每组3样本，分别于常温及-20℃冰箱中保存，在放置的第0、7、14、21、30天，按液液萃取气相色谱质谱法对6-BA和多效唑进行检验，每次检测需有新配制新鲜血液样本平行操作，并以新配制血液样本计算被测样本中的含量。设定第0天的样品的检测量为100％，每次的检测量按照起初值的百分比来计。结果在-20℃冰箱中保存的样本中两种植物生长调节剂的含量无明显变化。
三、结论
1、6-BA和多效唑的甲醇溶液在4℃冰箱中1月内具有良好的稳定性。
2、含6-BA和多效唑生物体液经冷冻后，72h内反复冻融不影响含量。
3、含6-BA和多效唑生物体液在-20℃条件下保存1月，其含量不会发生明显变化。
第三部分动物实验
一、材料
1.1仪器
同第一部分。
1.2试剂
除生理盐水外，其余均同第一部分。
1.3动物
实验用Wistar雄性大鼠，体重500g±20g，购于华富康生物科技股份有限公司。适应性喂养2天。饲养环境：温度17℃，湿度45％～65％，通风换气良好，光照合理，笼具和垫料卫生、无毒，喂营养颗粒饲料和高压消毒灭菌水。
1.4药物配制
精确称取6-BA和多效唑一定量，充分溶解于生理盐水中，混匀，配制成浓度均为2.5mg/mL的6-BA和多效唑混合溶液，置4℃冰箱保存；
2.动物实验方法
2.1 6-BA和多效唑灌胃给药模型及检材的采集
健康Wistar雄性大鼠6只，实验前禁食12h，自由饮水。其中1只做空白对照，其余5只以35mg/kg剂量灌胃给予6-BA和多效唑混合溶液，于3h将大鼠处死，取血、尿，采用液液萃取，气相色谱质谱进行分析。
2.2 6-BA和多效唑样品检测
取灌服6-BA、多效唑大鼠血或尿液1mL，于15mL塑料离心管中，6mL乙酸乙酯振荡提取，高速离心(8000r/min，10min)，转移有机相至尖底玻璃试管中，重复提取一次，合并有机相，50℃空气流下挥干，残渣用100μL甲醇溶解定容，供GC-MS分析。
气相色谱质谱条件：色谱柱：DB-5MS弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温：80℃起始，保持2min，以30℃/min升至280℃，保持15min；进样口温度280℃；载气：He；流速：1mL/min；分流比：10:1；进样量1μL。质谱条件：传输线温度200℃；离子源温度200℃；离子源：EI，电子轰击能量70eV；扫描方式：SCAN；扫描范围：40amu～450amu；溶剂延迟时间：2.5min。
3.结果
3.1工作曲线
分别在空白大鼠血、尿中加6-BA和多效唑标准品，使其浓度分别为0.5，1，5，10，50μg/mL，按照2.1.1方式进行检测，以目标物的浓度为横坐标(X)，以其定量离子峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，求得回归方程:
血中6-BA回归方程：Y＝40517X-37107 R2＝0.997
尿中6-BA回归方程：Y＝11463X+51227 R2＝0.998
血中多效唑回归方程：Y＝79854X+59720 R2＝0.999
尿中多效唑回归方程：Y＝11297X+16481 R2＝0.996
3.2专属性实验
取空白大鼠的血液各1mL，加入一定量的6-BA和多效唑标准溶液，按照2.2方法进行样品制备及检测，同时做空白对照，将二者的图谱进行比较，结果表明均无内源性杂质对两种植物生长调节剂的测定造成干扰。
3.3两种植物生长调节剂给药后大鼠血、尿中含量
取动物实验所得血液、尿液样本，按照2.2方法进行样品制备及检测，以保留时间结合特征离子峰(6-BA、多效唑)进行定性，以标准曲线法进行定量。大鼠血液、尿液样本中植物生长调节剂浓度见表5。
表5植物生长调节剂在大鼠血、尿中的浓度(n＝5)
Figure GDA0001737046600000111
Figure GDA0001737046600000121
4结论
本发明主要是通过进行动物实验，验证检验方法的可行性。给药后，在血液、尿液等检材中均检出了两种植物生长调节剂。此外，本实验给药量分别为35mg/kg，远低于两种植物生长调节剂的LD50，证明在因投毒、误服植物生长调节剂导致死亡的实际案件中对血液、尿液等检材进行检验是可行的。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (3)

1.生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）生物体液预处理；生物体液为血液或尿液；6-苄氨基嘌呤和多效唑采用液-液萃取法；所述液-液萃取法的萃取溶剂为环己烷、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷或体积比为3:1的氯仿和异丙醇组成的混合溶液；
（2）植物生长调节剂的检测：利用气相色谱质谱GC/MS检验方法检测含6-苄氨基嘌呤和多效唑生物体液中6-苄氨基嘌呤和多效唑含量时的色谱条件及质谱条件如下：
气相色谱条件：色谱柱：DB-5MS 弹性石英毛细管柱，规格：30m×0.25mm×0.25µm；程序升温：80℃起始，保持2min，以30℃/min升至280℃，保持15min；进样口温度280℃；载气：氦气；流速：1mL/min；分流比：10:1；进样量1µL；
质谱条件：传输线温度200℃；离子源温度200℃；离子源：EI，电子轰击能量70eV；扫描方式：SCAN；扫描范围：40amu～450amu；溶剂延迟时间：2.5min。
2.根据权利要求1所述生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述液-液萃取法包括如下步骤：取含6-苄氨基嘌呤和多效唑生物体液1mL，加入环己烷、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷或体积比为3:1的氯仿和异丙醇组成的混合溶液振荡提取，离心10min、转速为8000r/min，转移有机相至尖底玻璃试管中，重复提取一次，合并有机相，50℃空气流下挥干，残渣用100μL甲醇溶解定容留待GC-MS检测；或者过0.22μm的有机微孔滤膜，所得物即为液-液萃取法预处理液，留待GC-MS检测。
3.根据权利要求1所述生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法，其特征在于，含6-苄氨基嘌呤和多效唑生物体液保存在-20℃条件下，保存时间小于或等于1个月；经冷冻的含6-苄氨基嘌呤和多效唑体液，冻融后72h内进行检测。
CN201810359782.6A 2018-04-20 2018-04-20 生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法 Active CN108956794B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810359782.6A CN108956794B (zh) 2018-04-20 2018-04-20 生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810359782.6A CN108956794B (zh) 2018-04-20 2018-04-20 生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108956794A CN108956794A (zh) 2018-12-07
CN108956794B true CN108956794B (zh) 2021-04-13

Family

ID=64498784

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810359782.6A Active CN108956794B (zh) 2018-04-20 2018-04-20 生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108956794B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109655555A (zh) * 2019-02-15 2019-04-19 中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种测定豆芽中6-苄基腺嘌呤的方法
CN113219100A (zh) * 2021-05-18 2021-08-06 河北医科大学 生物体液中6-苄基腺嘌呤的检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103044427A (zh) * 2013-01-04 2013-04-17 湖南尔康制药股份有限公司 一种药用级腺嘌呤精制纯化方法
KR20130039215A (ko) * 2011-10-11 2013-04-19 대한민국(국립농산물품질관리원장) 아세토니트릴을 이용한 콩나물의 잔류농약 분석방법
CN106053703A (zh) * 2016-08-17 2016-10-26 刘思洁 一种同时检测食品中多种植物生长调节剂的方法
CN106383180A (zh) * 2016-08-19 2017-02-08 中华人民共和国日照出入境检验检疫局 蚕蛹中多种农残的检测方法
CN106404972A (zh) * 2016-03-14 2017-02-15 浙江省检验检疫科学技术研究院 气相色谱串联质谱/质谱法同时测定豆芽中6种植物生长调节剂残留的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130039215A (ko) * 2011-10-11 2013-04-19 대한민국(국립농산물품질관리원장) 아세토니트릴을 이용한 콩나물의 잔류농약 분석방법
CN103044427A (zh) * 2013-01-04 2013-04-17 湖南尔康制药股份有限公司 一种药用级腺嘌呤精制纯化方法
CN106404972A (zh) * 2016-03-14 2017-02-15 浙江省检验检疫科学技术研究院 气相色谱串联质谱/质谱法同时测定豆芽中6种植物生长调节剂残留的方法
CN106053703A (zh) * 2016-08-17 2016-10-26 刘思洁 一种同时检测食品中多种植物生长调节剂的方法
CN106383180A (zh) * 2016-08-19 2017-02-08 中华人民共和国日照出入境检验检疫局 蚕蛹中多种农残的检测方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Fast-atom Bombardment Mass Spectrometry for Mapping of Endogenous Methylated Purine Bases in Urine Extracts;Brunetta Porcelli 等;《RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY,》;19971231;第11卷;第398-404页 *
GC/MS 检测血中的6-苄基腺嘌呤;崔冠峰 等;《第三届全国质谱分析学术报告会》;20171231;第362页第3段 *
GC/MS检测"无限水"中的6-苄基腺嘌呤;王鹏 等;《刑事技术》;20141031(第5期);第56页第1.1、1.2节 *
QuEChERS法结合气相色谱-串联质谱法测定果蔬中14种植物生长调节剂;姜楠 等;《中国卫生检验杂志》;20170731;第27卷(第13期);第1867-1871页 *
崔冠峰 等.GC/MS 检测血中的6-苄基腺嘌呤.《第三届全国质谱分析学术报告会》.2017,第362页第3段. *
苹果、番茄、玉米中7种植物生长调节剂的气相色谱-串联质谱检测方法;徐宜宏 等;《农药》;20140228;第53卷(第2期);第113-115页 *
西瓜中4种植物生长调节剂残留的分析方法研究;陆益民 等;《分析测试学报》;20110228;第30卷(第2期);第186-189页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108956794A (zh) 2018-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111323509B (zh) 一种基于代谢组全局分析的植物性别鉴定方法
CN108760949B (zh) 生物体液中植物生长调节剂乙烯利的检测方法
CN108956794B (zh) 生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法
CN103472155A (zh) 气相色谱法检测稻谷中9种有机磷农药残留量
CN107703238A (zh) 一种同时测定丹参中6种内源激素含量的hplc方法
Kushnareva et al. Selection of an optimal method for screening the collection of narrow-leaved lupine held by the Vavilov Institute for the qualitative and quantitative composition of seed alkaloids
MacDougall et al. Estimation of boron in plant tissue
CN112326817B (zh) 一种鉴别茴香蜂蜜的方法
CN117214327A (zh) 一种蜂蜜中正己醇、正庚醇和雪松醇的检测方法及其应用
CN113419009A (zh) 一种氟噻虫砜代谢物的液相色谱串联质谱测定方法
CN110470768B (zh) 一种测定水质中吡嘧磺隆、三唑磷、丁草胺残留量的方法
CN109385489A (zh) 一种OsSUT3基因高量表达水稻种质筛选的PCR方法
CN113419008B (zh) 一种氟噻虫砜代谢物的合相色谱串联质谱测定方法
CN113759047B (zh) 人参中皂苷含量的检测方法及园参和野山参的鉴别方法
CN104020240A (zh) 一种离体鱼类性腺内类固醇类性激素的检测方法
CN110954615A (zh) 一种利用特征代谢物的植物性别鉴定方法
CN111239295A (zh) 分散固相萃取结合液相色谱串联质谱检测增产胺的方法
CN109298110A (zh) 离子色谱与电感耦合等离子体质谱仪联用测定食品中有机汞的方法
CN105987978B (zh) 一种同时测定香加皮中7种化合物含量的方法
CN108107135A (zh) 测定可食用花卉中农药残留量的前处理方法及其定量方法和试剂盒
Gorelova et al. Research on Creation of Methods for Determining Betulin in Birch Bark Processing Products Using HPLC
Lin et al. Determination of fungaltoxin residues in bergamot pear by UPLC-MS/MS
Pu et al. Analysis on inorganic elements in Carthami Flos from different locations by ICP-AES method
CN117949576A (zh) 一种同时检测松杉灵芝菌丝体中13种三萜化合物的方法
CN118465163A (zh) 基于QuEChERS-色谱法土壤中砜吡草唑残留量测定方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant