CN108956736B

CN108956736B - 基于电聚合对巯基苯胺膜制备己烯雌酚分子印迹电化学传感器的方法及其应用

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Publication number: CN108956736B
Application number: CN201810450634.5A
Authority: CN
Inventors: 高文惠; 赵玲钰; 高林
Original assignee: Hebei University of Science and Technology
Current assignee: Hebei University of Science and Technology
Priority date: 2018-05-11
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2038-05-11
Also published as: CN108956736A

Abstract

本发明公开了一种基于电聚合对巯基苯胺膜制备己烯雌酚分子印迹电化学传感器的方法，包括依次进行的玻碳电极预处理、多壁碳纳米管修饰电极、纳米金修饰电极、功能单体自组装与模板分子预组装、电聚合对巯基苯胺膜、模板分子洗脱等步骤，以有机相为聚合电解质溶剂，提高了聚合物薄膜中结合位点的数量和选择性能，有利于模板分子与功能单体形成稳定的主客体化合物，使模板分子能够在聚合物网状结构中保持良好的刚性结构并且形成具有记忆效应的空腔，制备方法简单、易于控制，传感器选择性强、稳定性好、灵敏度高、成本低。本发明适用于动物源性食品、饲料和其他样品中己烯雌酚残留的分析检测。

Description

基于电聚合对巯基苯胺膜制备己烯雌酚分子印迹电化学传感器的方法及其应用

技术领域

本发明属于分子印迹技术、超分子化学、电化学分析领域，涉及一种分子印迹电化学传感器的制备方法及其应用，具体地说是基于电聚合对巯基苯胺膜制备己烯雌酚分子印迹电化学传感器的方法及其应用。

背景技术

己烯雌酚（Diethylstilbesrtol）是一种人工合成的非甾醇体雌激素，诞生于20世纪40年代，其药理和功效与天然雌激素雌二醇有所相同，因此在医药领域倍受青睐，主要作为口服激素类药物用于治疗雌激素低下，以及体内雌激素失调所引起女性生理疾病，还可治疗前列腺癌症并有促进五大营养素的代谢功能；此外，己烯雌酚用做动物饲料添加剂，可促进动物生长，减少脂肪囤积，增加蛋白含量，尤其在刺激鱼类生长、维持鱼类正常代谢方面作用显著，因此被广泛用于畜牧养殖及渔业。20世纪70年代，人们在进一步了解己烯雌酚作用的同时，逐渐认识到己烯雌酚对人体的副作用，人们发现己烯雌酚会通过食物链在人体内富集，会破坏人体生理平衡，导致儿童性早熟、女性经期紊乱，己烯雌酚还会在饮用水中残留，人体会通过此类饮用水长期摄入微量己烯雌酚会造成致畸致癌，例如致胎儿畸形、诱发乳腺癌甚至影响下一代生殖健康。除此之外，长期摄入微量的己烯雌酚会引发肾脏肝脏疾病，并会增加哮喘发病率，极大地损害人类身体健康。所以建立一种快速、灵敏的己烯雌酚残留检测方法具有重要意义。

目前，常用于己烯雌酚残留检测的方法主要是色谱法及色谱-质谱联用法，但其存在处理时间长、操作繁琐、运行成本高、选择性差、有机溶剂用量大等缺点，而分子印迹电化学传感器克服了上述缺陷，具有操作简单、成本低，选择性强、稳定性好、传质快等优点，有望实现对己烯雌酚残留的快速、灵敏检测。目前，以己烯雌酚为模板分子，对巯基苯胺为功能单体制备分子印迹电化学传感器并将其应用到实际样品检测中未见报道。

分子印迹技术(molecular imprinting technology, MIT)是指为获得在空间构型和结合位点上与某一目标化合物完全匹配的高分子聚合物的制备技术，属于超分子化学中主客体化学的范畴，是高分子化学、生物化学等多学科的前沿科学。近年来，将分子印迹技术与电化学快速分析相结合制备分子印迹电化学传感器成为了研究热点。分子印迹聚合物敏感材料具有耐高温、高压、酸、碱和有机溶剂，可用化学方法合成，可多次重复使用，易于保存等优点。将分子印迹聚合物成功地固定在转换器表面是制备分子印迹电化学传感器关键的一步。

分子印迹电化学传感器常用的制备方法有原位引发聚合法、涂膜法、电化学聚合法。然而电化学聚合法因其成膜快速，膜与转换器结合紧密、膜厚可控的优点成为研究最多的一种方法。电聚合法是将印迹电极放入含有模板分子和功能单体的支持电解质溶液中，功能单体通过氧化、还原在电极表面生成正离子或负离子自由基，自由基通过缩合反应生成聚合物，而与此同时模板分子借助于和功能单体分子间的相互作用力将具有选择识别性位点引入聚合膜中，进而制备出分子印迹电化学传感器。电化学聚合法包括恒电位沉积法、循环伏安法、恒电流沉积法。恒电位沉积法目前主要应用于壳聚糖的沉积试验中，有一定的局限性；与之相反，循环伏安法被广泛地应用于电化学传感器的制备过程中，并且在聚合的过程中可以通过选择不同类型的功能单体或者调节电解质溶液的pH值的方法制备出带有电活性和非电活性的印迹聚合物薄膜。目前，人们多采用功能单体与模板分子在裸电极表面直接进行电聚合，这时就会受到功能单体分子结构中所含极性官能团个数少和种类少的局限性，进而影响聚合膜的稳定性和选择性。

多壁碳纳米管是日本科学家在1991年发现的具有纳米结构碳的多层管状物，多被看做几层和十几层的石墨片围绕一中心轴螺旋而成，因其独特的结构和性质被应用于电极的修饰，以增加修饰电极导电性及表面积；纳米金颗粒具有良好的导电性及稳定的生物相容性，自组装单分子膜（self-assembled monolayers，SAMs）是指活性分子通过化学键自发吸附在异相界面上而形成的有序分子组装体系，其主要基于长链有机分子在基底表面的强烈化学键合作用和有机分子链间相互作用。硫金体系的自组装制备简单容易成膜，稳定性与有序性好。目前基于碳纳米管及纳米金同时修饰电极，以对巯基苯胺为功能单体的己烯雌酚分子印迹电化学传感器的制备尚未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题，是提供一种基于电聚合对巯基苯胺膜制备己烯雌酚分子印迹电化学传感器的方法，它包括依次进行的多壁碳纳米管（MWCNTs）修饰电极、纳米金（AuNPs）修饰电极、功能单体自组装与模板分子预组装、电聚合对巯基苯胺膜、模板分子洗脱等步骤，首次以己烯雌酚为模板分子，对巯基苯胺为功能单体，并结合纳米修饰与自组装技术，增强了电极比表面积及导电性，以有机相为聚合电解质溶剂，增大了模板分子在聚合液中的比例，提高了聚合物薄膜中结合位点的数量和选择性能，有利于模板分子与功能单体形成稳定的主客体复合物，使模板分子能够在聚合物网状结构中保持良好的刚性结构并且形成具有记忆效应的空腔，该制备方法简单、易于控制，制备的分子印迹电化学传感器稳定性好，灵敏度高，成本低，响应快。

本发明的另外一个目的是，提供了上述基于电聚合对巯基苯胺膜制备己烯雌酚分子印迹电化学传感器的应用，它可用于动物源性食品及其他食品中己烯雌酚残留的快速检测。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种基于电聚合对巯基苯胺膜制备己烯雌酚分子印迹电化学传感器的方法，它按照如下的步骤顺序进行：

（1）玻碳电极预处理

将玻碳电极抛光并洗涤，然后将电极置于0.5mol/L的H₂SO₄溶液中，循环扫描；取出电极冲洗后，氮气吹干，置于电活性探针溶液中循环扫描，直至得到稳定的循环伏安响应，得到具有活性的电极；

（2）多壁碳纳米管修饰电极

取0.0200g MWCNTs加入到10mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，磁力搅拌10min后超声分散30min，得到2g/L的浅黑色MWCNTs-DMF分散液，与相同体积的20g/L CS-1%CH₃COOH溶液混合，组成CMWCNTs修饰剂。用微量进样器吸取10μL CMWCNTs修饰剂（分两次，每次5μL）滴涂到（1）中玻碳电极表面，自然晾干，即得到CMWCNTs修饰电极；

（3）纳米金修饰电极

将（2）中得到的电极浸于含有0.6g/L氯金酸水合物（HAuCl₄·4H₂O）的0.1mol/LH₂SO₄溶液中，在-0.2V恒定电位下沉积300～600s后取出电极，依次用超纯水和无水乙醇冲洗，然后室温下自然晾干，最终得到多壁碳纳米管与纳米金修饰玻碳电极（AuNPs-CMWCNTs/GCE）；

（4）功能单体自组装与模板分子预组装

将（3）中得到的AuNPs-CMWCNTs/GCE浸入到50mmol/L p-ATP乙醇溶液中，室温下放置24h，p-ATP与AuNPs通过Au-S键结合，完成自组装后，将电极浸于5mmol/L DES乙醇溶液中，室温下放置5h，然后取出依次用超纯水、无水乙醇除去物理吸附的DES，氮气吹干，得到DES与p-ATP修饰电极（DES/p-ATP/AuNPs-CMWCNTs/GCE）；

（5）电聚合对巯基苯胺膜

将上述处理后的电极置于聚合液中，在-0.3～1.2V的电位区间、扫描速度为0.05～0.1V/s时，循环扫描得到嵌有模板分子的致密不导电的聚对巯基苯胺膜印迹电极，氮气吹干；

所述聚合液为含有功能单体和模板分子的四丁基高氯酸铵乙醇溶液，其中四丁基高氯酸铵乙醇溶液的浓度为50mmol/L；

所述的功能单体为对巯基苯胺，模板分子为己烯雌酚；其中，功能单体的摩尔浓度为8～12mmol/L；模板分子与功能单体的摩尔浓度比值为1:8～12；

（6）模板分子的洗脱

将上述电极置于50%乙醇-0.1mol/L硫酸混合溶液中浸泡洗脱后，得己烯雌酚分子印迹电化学传感器。

作为本发明的限定：

所述的步骤（5）中，循环扫描的圈数为10～25圈。

所述的步骤（6）中，50%乙醇-0.1mol/L硫酸混合溶液是由体积比为1:1的50%乙醇与0.1mol/L硫酸配制而得，洗脱时间为6～12min。

所述的步骤（1）中，电活性探针为铁氰化钾/亚铁氰化钾，电活性探针溶液是由5mmol/L 铁氰化钾/亚铁氰化钾与1mol/L 氯化钾溶液按照体积比1:1配制而得。

所述的步骤（1）中，玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm的Al₂O₃粉在麂皮或其它抛光布上抛光。

所述的步骤（5）中，模板分子与功能单体的摩尔浓度比值为1:8～1:12。

本发明还有一种限定，所述的步骤（1）中，在电活性探针溶液中循环扫描时的电位区间为-0.2～0.8V、扫描速度为0.01～0.1V/s；差分脉冲伏安扫描时的电位区间为-0.2～0.6V、扫描速度为0.01～0.1V/s。

本发明还提供了上述己烯雌酚分子印迹电化学传感器的应用，它用于选择性吸附己烯雌酚和双烯雌酚。

作为本发明应用的一种限定，它应用于动物源性食品及其他样品中己烯雌酚残留的分析检测。

由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：

①该传感器首次采用对巯基苯胺功能单体进行电聚合，并结合纳米修饰与自组装技术，增强了电极比表面积及导电性，以有机相为聚合电解质溶剂，增大了模板分子在聚合液中的比例，提高了聚合物薄膜中结合位点的数量和选择性能，有利于模板分子与功能单体形成稳定的主客体化合物，使模板分子能够在聚合物网状结构中保持良好的刚性结构，并且形成具有记忆效应的空腔；

②制备的传感器选择性强，稳定性好，灵敏度高，成本低，响应快；

③本发明与其它的己烯雌酚检测技术相比，操作过程简单，成本低，耗时短，选择性强，灵敏度高，稳定性好，响应快；

本发明提供的己烯雌酚分子印迹电化学传感器适用于动物源性食品及其他样品中己烯雌酚残留的分析检测。

本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。

附图说明

图1为实施例1中己烯雌酚分子印迹电化学传感器制备过程示意图；

图2为壳聚糖（CS）修饰剂浓度-电流示意图；

图3为纳米金电沉积液中氯金酸浓度-电流示意图；

图4为纳米金电沉积到修饰电极示意图；

图5为纳米金电沉积时间-电流示意图；

图6为电极修饰效果的表征（a-GCE; b-CMWCNTs/GCE；c-AuNPs-CMWCNTs/GCE）；

图7为电聚合时原料的浓度-电流示意图；

图8为分子印迹电极制备过程中循环伏安曲线（聚合1到10圈）；

图9为印迹传感器的模板洗脱时间-电流示意图；

图10为不同电极在电活性探针溶液中的差分脉冲伏安曲线(a-GCE; b-AuNPs-CMWCNTs/GCE；c-p-ATP、DES修饰电极；d-DES/GCE；e-MIP/GCE; f- MIP/GCE再吸附);

图11为己烯雌酚分子印迹电化学传感器选择性研究柱状图（A：己烯雌酚，B：双烯雌酚，C：雌二醇，D：双酚A，E：四环素）；

图12为印迹传感器在电活性探针溶液中对不同浓度己烯雌酚的DPV响应曲线图；

图13为己烯雌酚印迹传感器线性关系曲线图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业渠道得到。

实施例1 己烯雌酚分子印迹电化学传感器的一种制备方法

本实施例中己烯雌酚分子印迹电化学传感器的一种制备方法，如图1所示，按照如下的步骤顺序依次进行：

（11）玻碳电极预处理

将玻碳电极依次用0.5μm、0.3μm、0.05μm的Al₂O₃粉在麂皮上抛光，用超纯水冲洗后在无水乙醇和超纯水中超声洗涤，然后将电极置于0.5mol/L的H₂SO₄溶液中，循环扫描；

取出电极冲洗后，置于电活性探针溶液中，其中，电活性探针为铁氰化钾/亚铁氰化钾，电活性探针溶液为5mmol/L铁氰化钾/亚铁氰化钾与1mol/L氯化钾溶液按照体积比1:1配制而得；

在-0.2～0.8V的电位区间、以0.05V/s扫描速度循环扫描，直至得到稳定的循环伏安响应，即对称可逆的循环伏安峰（峰电流比为1:1，峰电位差小于90mV），得到具有活性的电极；

（12）多壁碳纳米管修饰电极

取0.0200g CMWCNTs加入到10mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，磁力搅拌10min后超声分散20～30min，得到2g/L的浅黑色MWCNTs-DMF分散液，与相同体积的20g/L CS-1%CH₃COOH混合溶液，组成CMWCNTs修饰剂。用微量进样器吸取10μL CMWCNTs修饰剂（分两次，每次5μL）滴涂到（11）中玻碳电极表面，自然晾干，即得到CMWCNTs修饰电极；

（13）纳米金修饰电极

将（12）中得到的电极浸于含有0.6g/L氯金酸水合物（HAuCl₄·4H₂O）的0.1mol/LH₂SO₄溶液中，在-0.2V恒定电位下沉积300～600s后取出电极，依次用超纯水和无水乙醇冲洗，然后室温下自然晾干，最终得到多壁碳纳米管与纳米金修饰玻碳电极（AuNPs-CMWCNTs/GCE）；

（14）功能单体自组装与模板分子预组装

将（13）中得到的AuNPs-CMWCNTs/GCE浸入到50mmol/L p-ATP乙醇溶液中，室温下放置24h，p-ATP与AuNPs通过Au-S键结合，完成自组装后，将电极浸于5mmol/L DES乙醇溶液中，室温下放置5h，然后取出依次用超纯水、无水乙醇除去物理吸附的DES，氮气吹干，得到DES与p-ATP修饰电极（DES/p-ATP/GCE）；

（15）电聚合对巯基苯胺膜

将上述处理后的电极置于聚合液中，在-0.3～1.2V的电位区间、扫描速度为0.05～0.1V/s时，循环扫描10圈得到嵌有模板分子的致密不导电的聚对巯基苯胺膜印迹电极，氮气吹干；

所述聚合液为含有功能单体和模板分子的四丁基高氯酸铵乙醇溶液，其中,四丁基高氯酸铵乙醇溶液的浓度为50mmol/L；

所述的功能单体为对巯基苯胺，模板分子为己烯雌酚；其中，功能单体的摩尔浓度为10mmol/L；模板分子与功能单体的摩尔浓度比值为1:8；

（16）模板分子的洗脱

本实施例所制备的传感器选择性强，即只能特异性吸附己烯雌酚和双烯雌酚，稳定性好、灵敏度高、成本低、响应快，制备步骤简单、易于控制，与其它己烯雌酚检测技术相比，操作过程简单、成本低、耗时短。

实施例2-6 己烯雌酚分子印迹电化学传感器的制备方法

本实施例分别为己烯雌酚分子印迹电化学传感器的一种制备方法，制备步骤及技术参数与实施例1相同，不同之处仅在于：制备过程中相应的技术参数不同，具体结果见表1。

表1 制备过程的技术参数表

上述实施例2-6中步骤（x1）（x=2-6）和步骤（x2）（x=2-6）中循环扫描的电位区间均为-0.3～1.2V;其中多壁碳纳米管与纳米金修饰电极的方法与用量均与实施例1中相同。

实施例2-6中所制备的传感器选择性强、稳定性好、灵敏度高、成本低、响应快，制备步骤简单、易于控制，与其它的己烯雌酚检测技术相比，操作过程简单、成本低、耗时短。

实施例7 羧基化多壁碳纳米管修饰条件选择实验

为了达到多壁碳纳米管的最佳修饰效果，本实施例对多壁碳纳米管分散试剂及修饰剂的使用剂量进行了研究。其中对MWCNTs分散效果良好的试剂DMF与具有良好交联作用的壳聚糖相结合，将MWCNTs-DMF分散液与CS-1%CH₃COOH溶液等体积混合，得到CMWCNTs修饰剂，将适量CMWCNTs修饰剂滴涂到电极表面，CMWCNTs能够均匀分布。

为了使CMWCNTs修饰剂能够稳定的粘附在玻碳表面且不影响CMWCNTs的催化作用，本实施例对CS-1%CH₃COOH溶液中CS的浓度进行研究。如图2所示，分别比较了200mg、300mg、400mg、500mg、600mg CS在20mL CS-1%CH₃COOH中的溶解性及与2g/L的MWCNTs-DMF分散液混合后对电极的修饰效果。结果表明，当CS使用量小于400mg时修饰层粘附性不佳易脱落；当CS使用量超过400mg时，修饰剂在电极表面不易晾干，且修饰层较厚影响到电流响应；当CS使用量为400mg时修饰层能够牢固的粘附到电极表面且CMWCNTs能够均匀分布，将修饰电极采用循环伏安法进行表征，表征曲线氧化还原峰电流强度增加，且接近于1:1，将修饰好的电极长时间放置，表征曲线响应电流几乎不发生变化，稳定性好，因此选择CS-1%CH₃COOH溶液中CS的使用量为400mg，即浓度为20g/L。

本实施例对修饰剂的用量进行优化，采用修饰剂等量分次滴涂的方法对电极进行修饰。每次滴涂均用微量移液器移取5μL修饰剂滴涂到玻碳电极表面，自然晾干后，采用循环伏安法表征。结果表明，峰电流随修饰次数的增加而增大，当修饰次数超过2次时峰电流不再增大，继续滴涂，由于修饰层厚度增大影响到电子转移，峰电流有减小趋势。因此试验选用10μL（分两次滴涂，每次5μL）为最佳修饰剂量。

实施例8 纳米金修饰条件优化实验

本实施例首先对电聚合液中HAuCl₄·4H₂O的浓度进行优化，分别比较了电聚合液中HAuCl₄·4H₂O为0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L时，沉积相同时间后采用差分脉冲伏安法考察峰电流变化情况，结果如图3所示，随着HAuCl₄·4H₂O浓度的增加，峰电流强度逐渐增大，当浓度超过0.6g/L峰电流强度不再增加，因此本实施例选择含0.6g/L HAuCl₄·4H₂O的0.1mol/L H₂SO₄溶液作为电沉积液。

为进一步验证纳米金在-0.2V电位下沉积于电极表面，试验采用H₂SO₄作为探针，将沉积后的电极置于0.5mol/L H₂SO₄溶液中，在-1.0V～1.0V范围内扫描，如图4所示，电极在0.76V电位下有明显的还原峰出现，表明在电极表面已经沉积了某种粒径的金颗粒，然后试验用相同的方法研究沉积时间对电极响应峰电流的影响。电沉积时间与金纳米粒子粒径有关，沉积时间过长，纳米金颗粒会在电极表面形成团簇；时间过短，金纳米粒子增敏效果不明显。试验分别选择电沉积时间100s、200s、300s、400s、500s、600s进行研究，不同沉积时间与电极在0.5mol/L H₂SO₄溶液中峰电流关系如图5所示。由图可以看出，随电沉积时间的增加，电极响应峰电流逐渐增强，当电沉积时间大于400s后，电极响应电流不再增大，且有减小趋势，表明随着金纳米颗粒数目的增加导致电极比表面积的增大，峰电流响应值随之增加；当电沉积时间增加到400s时，响应峰电流值达到最大，此时沉积在电极表面的纳米金颗粒分布均匀，粒径适当；当沉积时间继续增大，响应峰电流值不增反减，原因有可能是因为沉积时间超过最佳时间，金纳米颗粒开始出现团簇，导致电极比表面积减小，影响电流响应。

实施例9 电极修饰效果的研究

本实施例对多壁碳纳米管及纳米金颗粒修饰过的电极进行表征，如图6所示。裸电极在铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液中循环伏安法扫描，扫描曲线如图6a，由图可以看出探针离子Fe³⁺/Fe⁴⁺在电极表面发生氧化还原反应，呈现一组氧化还原峰，峰电流值之比接近于1:1；当在裸电极上修饰两层多壁碳纳米管后，循环伏安曲线氧化还原峰电流值明显增大，且峰形较裸电极更加对称，如图6b所示，表明多壁碳纳米管具有良好的导电性能，对探针离子在电极上的氧化还原反应起到催化作用；当CMWCNTs/GCE表面电沉积金纳米颗粒后CV曲线如图6c所示，氧化还原峰电流强度略微增加，但不明显，其主要作用是增加功能化功能单体p-ATP自组装的结合位点。

实施例10 电聚合时不同浓度的原料对电流的影响

本实施例对电聚合过程中，功能单体与模板物质不同的摩尔浓度比对电流的影响进行了探究。其中，聚合膜的制备过程与实施例1相同，不同之处仅在于：功能单体与模板物质的摩尔浓度比不同。具体的试验结果如图7所示。

由图7可以得知，当模板物质与功能单体的摩尔浓度比在本发明所确定的1:8-1:12范围内时，印迹效果良好；若不在该范围内，无明显印迹效果。

实施例11 分子印迹电极的制备

本实施例将预组装好的电极浸没在含有含有1mmol/L DES、10mmol/L p-ATP、0.2g/L HAuCl₄·4H₂O、50mmol/L TBAP的电聚合液中循环扫描10圈，扫描电位-0.3V～1.2V，聚合曲线如图8所示。由图8可以看出在此聚合液及聚合条件下，对巯基苯胺在电极表面的聚合是一个不可逆的过程。聚合第一圈时，在电位+0.6V和+0.9V附近处出现了两个明显的氧化峰，但在聚合第二圈时，+0.9V附近的氧化峰电流强度骤减，随着聚合圈数的增加，电流强度逐渐降至接近于0。此结果表明，对巯基苯胺不导电聚合物逐渐覆盖整个电极表面，阻碍了聚合液中对巯基苯胺继续在电极表面进行电子转移，无法进一步氧化；在+0.6V附近的氧化峰从第一圈开始，氧化峰逐渐减弱，最后接近于零，此现象可能是由于氯金酸中Au³⁺被逐渐还原并被包裹到对巯基苯胺聚合膜中所致。综上所述，经过电聚合作用，功能单体和模板分子在电极表面成功形成不导电聚合物膜。此后，将电极置于洗脱剂中浸泡将模板分子洗脱，得到分子印迹电极。

实施例12 模板物质洗脱时间对印迹传感器电流的影响

模板物质洗脱的时间对己烯雌酚分子印迹传感器的电化学性能有重要的影响，本实施例对洗脱时间进行了探索，本实施例中己烯雌酚分子印迹传感器的制备步骤与实施例1相同，不同之处仅在于：模板物质洗脱过程中的洗脱时间不同，具体结果见图9。

由图9可知，当洗脱时间在本发明所确定的6-12min时，响应电流值满足检测需求；若不在该范围时，响应电流值较低，所制备的电化学传感器不适合用于实际样品的检测。

实施例13 己烯雌酚分子印迹电化学传感器的印迹效应表征

差分脉冲伏安法表征

将实施例1所提供的己烯雌酚分子印迹电化学传感器置于电活性探针溶液中（电活性探针溶液以及探针的类型均与实施例1相同）进行循环伏安表征，分别对裸玻碳电极、AuNPs-CMWCNTs/GCE、p-ATP和DES修饰电极、DES-MIP/GCE、MIP/GCE及MIP/GCE再吸附后六种电极的电化学行为进行表征，结果如图10所示。

由图10可知，AuNPs-CMWCNTs/GCE峰电流值最大，且较裸电极电流高出几倍，与上述试验结果相符，表明纳米金与多壁碳纳米管能够大幅度提高电极表面电子交换速率，增大峰电流强度；当p-ATP、DES组装在AuNPs-CMWCNTs/GCE表面后，峰电流强度略有所下降，表明p-ATP与纳米金颗粒完成自组装并且一部分DES与p-ATP进行了预组装；当p-ATP、DES修饰电极在聚合中扫描一定圈数后，差分脉冲伏安法表征曲线是一条平滑线，氧化还原峰接近于零，表明通过电化学聚合法，模板分子和功能单体在电极表面形成一层致密的薄膜，阻碍了探针离子在玻碳电极表面进行电子传递；DES-MIP/GCE浸入50%乙醇-0.1mol/L H₂SO₄（V/V，1:1）中洗脱6min后，差分脉冲伏安曲线在电位0.2V左右再次有氧化峰出现，表明洗脱剂将一部分模板分子去除后，在分子印迹膜表面形成具有特异性识别作用的空穴，致使探针离子可以通过空穴游离到电极表面，在电极表面发生氧化还原反应，但曲线峰电流大小跟探针离子电子转移数量有关，由于分子印迹膜形成的空穴有限，只允许部分探针离子到达电极表面，因此其峰电流强度高于洗脱前，小于p-ATP、DES修饰电极；当洗脱后的分子印迹电极MIP/GCE再次浸入到模板分子溶液，吸附若干时间后表征，峰电流强度明显下降，表明模板分子再次占据印迹空穴阻碍探针离子在电极表面的电子转移。

实施例14 传感器选择性能及重复性能研究

（1）选择性能的考察

为了考察聚对巯基苯胺膜对模板物质的选择性，本实施例选择了3种与模板分子呈结构类似物的雌激素类药物（双酚A、双烯雌酚、雌二醇）进行选择性吸附试验。

将实施例1所制备的印迹电极置于电活性探针溶液中（电活性探针溶液以及探针类型均与实施例1相同），分别加入浓度为1.0×10^-5mol/L的目标物质（A：己烯雌酚，B: 双烯雌酚，C: 雌二醇，D: 双酚A）进行搅拌吸附试验，采用DPV法进行表征，结果如图11所示。由图11可知，吸附相同浓度的雌激素类物质，印迹电极对模板物质己烯雌酚以及与模板分子结构十分相似的代谢物双烯雌酚的ΔI (吸附前后响应电流的变化值)值最大，而对其它结构类似物响应很小，因此说明该传感器对己烯雌酚有特异性吸附作用。

（2）重复性能的考察

本实施例同时考察了实施例1所提供的印迹传感器的重复性，将制备的己烯雌酚分子印迹电化学传感器连续洗脱、吸附模板分子20次，其中，洗脱步骤以及所用的试剂与实施例1中洗脱步骤相同，所得ΔI的相对标准偏差平均值为2.1%（n=10），表明该传感器具有良好的重复性，并且性能无衰减。

实施例15 基于电聚合对巯基苯胺膜制备己烯雌酚分子印迹电化学传感器在食品样品检测中的应用

（1）样品处理

①样品的提取

分别称取5.00g（液体样品取5mL）样品(牛奶、猪肉)，均质，置于50mL离心管中，加入10mL乙腈振荡混匀，超声20 min，10000r/min离心5min，取上清液。重复提取2次，合并两次提取液。氮气吹干，再用乙腈定容至20mL，过膜待测。

②样品检测

在室温下，采用DPV法对处理过的牛奶、猪肉样品进行检测。测量参数设置如下，电位增量：4mV，脉冲宽度：0.05s，脉冲幅度：0.05V，脉冲间隔：0.1s。每次测定后，将电极置于50%乙醇-0.1mol/L硫酸 (1:1，V/V)溶液中洗脱，以去除模板分子，再进行下一次测量。

（2）线性关系与检出限

在最佳试验条件下，采用DPV法检测，印迹传感器对不同浓度己烯雌酚的响应电流如图12所示。图12中1-5曲线分别对应于己烯雌酚的浓度（即1-5分别对应于浓度由大到小）。分别以相对峰电流ΔI为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线，见图13。由图13可以看出，己烯雌酚的浓度在1.0×10^-9～1.0×10^-5 mol/L范围内与其相对峰电流呈良好的线性关系，线性方程为ΔI =-4.84lgC-22.1，线性相关系数为0.9991，检出限为3.0×10^-10mol/L。

（3）牛奶、猪肉中己烯雌酚的样品加标回收率和精密度试验

在最佳试验条件下对牛奶、猪肉样品在0.01×10^-6mol/L和0.1×10^-6mol/L 2个添加水平下进行加标回收率试验，分析结果如表2所示，样品加标平均回收率在83.1%~97.5%之间，相对标准偏差（RSD）在1.3%~3.8%之间（n=5）。由此说明本发明制备的己烯雌酚分子印迹电化学传感器回收率高，精密度好。

表2 不同样品的回收率和精密度试验结果

实施例1-6仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明所作的其它形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施例所作出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。

Claims

1.一种基于电聚合对巯基苯胺膜制备己烯雌酚分子印迹电化学传感器的方法，其特征在于它按照如下的步骤顺序进行：

（1）玻碳电极预处理

（2）多壁碳纳米管修饰电极

取0.0200g MWCNTs加入到10mL N,N-二甲基甲酰胺中，磁力搅拌10min后超声分散30min，得到2g/L的浅黑色MWCNTs-DMF分散液，与相同体积的壳聚糖-1%CH₃COOH溶液混合，组成壳聚糖多壁碳纳米管CMWCNTs修饰剂；用微量进样器吸取10μL CMWCNTs修饰剂分两次，每次5µL滴涂到（1）中玻碳电极表面，自然晾干，即得到CMWCNTs修饰电极；

（3）纳米金修饰电极

将（2）中得到的电极浸于含有0.6g/L氯金酸水合物的0.1mol/L H₂SO₄溶液中，在-0.2V恒定电位下沉积300～600s后取出电极，依次用超纯水和无水乙醇冲洗，然后室温下自然晾干，最终得到壳聚糖多壁碳纳米管与纳米金修饰玻碳电极AuNPs-CMWCNTs/GCE；

（4）功能单体自组装与模板分子预组装

将（3）中得到的AuNPs-CMWCNTs/GCE浸入到50mmol/L对巯基苯胺p-ATP乙醇溶液中，室温下放置24h，p-ATP与AuNPs通过Au-S键结合，完成自组装后，将电极浸于5mmol/L己烯雌酚乙醇溶液中，室温下放置5h，然后取出依次用超纯水、无水乙醇除去物理吸附的己烯雌酚，氮气吹干，得到己烯雌酚与p-ATP修饰电极；

（5）电聚合对巯基苯胺膜

将（4）中处理后的电极置于聚合液中，在-0.3～1.2V的电位区间、扫描速度为0.05～0.1V/s时，循环扫描10～15圈得到嵌有模板分子的致密不导电的聚对巯基苯胺膜印迹电极，氮气吹干；

所述的功能单体为对巯基苯胺，模板分子为己烯雌酚；功能单体的摩尔浓度为8-12mmol/L；模板分子与功能单体的摩尔浓度比值为1:8～12；

（6）模板分子的洗脱

将（5）中电极置于体积比为1:1的50%乙醇-0.1mol/L硫酸混合溶液中浸泡洗脱6～12min后，得己烯雌酚分子印迹电化学传感器。

2.根据权利要求1所述的基于电聚合对巯基苯胺膜制备己烯雌酚分子印迹电化学传感器的方法，其特征在于：所述的步骤（1）中，电活性探针为铁氰化钾/亚铁氰化钾，电活性探针溶液是由5mmol/L铁氰化钾/亚铁氰化钾与1mol/L氯化钾溶液按照体积比1:1配制而得。

3.根据权利要求1所述的基于电聚合对巯基苯胺膜制备己烯雌酚分子印迹电化学传感器的方法，其特征在于：所述的步骤（1）中，玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm的Al₂O₃粉在麂皮或其它抛光布上抛光。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的基于电聚合对巯基苯胺膜制备己烯雌酚分子印迹电化学传感器的方法，其特征在于：所述的步骤（1）中，在电活性探针溶液中循环扫描时的电位区间为-0.2～0.8V、扫描速度为0.01～0.1V/s。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述方法制备的基于电聚合对巯基苯胺膜制备己烯雌酚分子印迹电化学传感器的一种应用，其特征在于：它用于特异性吸附己烯雌酚与双烯雌酚。

6.根据权利要求5所述的基于电聚合对巯基苯胺膜制备己烯雌酚分子印迹电化学传感器的一种应用，其特征在于：它应用于动物源性食品、饲料和其他样品中己烯雌酚残留的分析检测。