CN108949752A - 抑制腺苷a2a受体功能的基因、表达载体及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抑制腺苷A2A受体功能的基因及其表达载体和应用，该基因包含SEQ ID NO:1所示序列或其同源序列。表达载体包括SEQ ID NO:2所述序列或其同源序列。可用于治疗神经系统疾病，如阿尔兹海默病、帕金森病、抑郁等。解决了现有临床治疗技术所带来的副作用，药物分布范围局限，既能够特异性抑制A2AR功能，又可以在局部发挥功效。

Description

抑制腺苷A2A受体功能的基因、表达载体及应用
技术领域
本发明涉及生物医疗技术领域，尤其是一种抑制腺苷A2A受体功能的基因、表达载体及应用。
背景技术
腺苷A2A受体（A2AR）是一种G蛋白偶联受体，主要分布于人类的心血管系统以及神经系统：心血管系统的A2AR主要发挥调节血管收缩而增高血压的作用；中枢神经系统中的A2AR主要分布在纹状体和嗅球等脑区中，其能够与谷氨酸能受体以及多巴胺能受体等发生相互作用并调节谷氨酸和多巴胺的释放，在神经系统的疾病如抑郁，焦虑，阿尔兹海默病，帕金森氏病，亨廷顿病等病症中发挥重要作用。大量研究表明干预这些疾病中A2AR的作用能够影响疾病的发生发展，因此A2AR也成为了治疗这些疾病潜在的新治疗靶点。
目前，人为干预A2AR的作用主要通过利用其激动剂和拮抗剂，这些药理学干预手段的特异性存在着缺陷，在用于临床治疗时，特异性低的激动剂和拮抗剂将会作用于除A2AR之外的其它受体而引起副作用，限制了其临床的运用。此外，目前激动剂和拮抗剂都是以药物的形式进行给药，存在药物半衰期，药物分布范围难以控制等缺点。
因此，寻找新的能够特异性抑制或激活A2AR功能，又可以在局部发挥功效的新方法将为A2AR作为治疗疾病的靶点提供有力的工具。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种抑制腺苷A2A受体功能的基因及其表达载体和应用。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一方面，本发明实施例公开了一种抑制腺苷A2A受体功能的基因，其包含以下任意一种：
（1）SEQ ID NO: 1所示序列；
（2）与SEQ ID NO: 1所示序列的同源性大于60%的序列。
另一方面，本发明实施例还公开了一种抑制腺苷A2A受体功能的表达载体，包括以下任意一种：
（1）SEQ ID NO: 2所示序列表示的基因。
（2）与SEQ ID NO: 2所示序列的同源性大于60%的序列。
进一步地，其包括将上述的1基因插入pcDNA3.1(+)后，转化、扩增、纯化后得到。
上述的抑制腺苷A2A受体功能（Anti-A2AR）表达载体的制备方法，包括：
步骤（1）构建Anti-A2AR质粒；
步骤（2）将构建的Anti-A2AR质粒进行感受态细菌的转化，得到单克隆菌落；
步骤（3）挑取单克隆菌落进行质粒扩增、纯化，得到Anti-A2AR载体。
进一步地，所述感受态细菌为大肠杆菌DH5α。
进一步地，所述质粒扩增选用LB培养基。
进一步地，所述构建Anti-A2AR质粒包括将AntiA2AR表达基因插入pcDNA3.1(+)。
第三方面，本发明的实施例还公开了上述的基因，在治疗腺苷A2A受体功能紊乱有关的疾病中的应用。尤其是作为治疗神经系统疾病的药物的应用。
第四方面，本发明实施例还公开了上述的表达载体，在治疗腺苷A2A受体功能紊乱有关的疾病中的应用。
第五方面，本发明实施例还公开了一种拟制腺苷A2A受体功能的病毒，包含上述的基因及病毒载体。
第六方面，本发明实施例还公开了一种药物制剂，其包含上述的载体。
进一步地，所述药物制剂的剂型包括注射液、乳剂、霜剂、膏剂或喷雾剂。
本发明的优点：
本发明所公开的抑制腺苷A2A受体功能的基因可在真核细胞中表达。而该基因载体，可用于局部注射或全身注射，使其在特定位置长期、稳定、特异表达，应用于大脑相关的阿尔兹海默病、帕金森病，抑郁等神经精神疾病的预防和治疗，比传统药物特异性更高。
附图说明
为了更好的理解本发明，并且更清楚的展示如何实现本发明，现通过示例的方式参考附图，在附图中：
图1是本发明一实施例中的AntiA2AR可拮抗A2AR下游信号cAMP含量；
图2是本发明一实施例中的小鼠大脑纹状体转染表达AntiA2AR AAV病毒后的旷场实验结果；
图3、图4是本发明一实施例中的小鼠大脑纹状体转染表达AntiA2ARAAV病毒后高架十字迷宫实验结果；
图5是本发明一实施例中的小鼠大脑纹状体转染表达AntiA2AR AAV病毒后饮水冲突实验结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1 AntiA2AR表达质粒的构建、扩增、纯化
1. AntiA2AR表达质粒的构建
该质粒由南京金斯瑞公司构建并提供DNA成品。
2.感受态细菌的转化
从-80℃低温冰箱中取出DH5α感受态细菌30μl，在室温下加入质粒DNA 10ng，对照感受态菌液当中不加入质粒DNA，冰上放置30分钟， 42℃水浴90秒，冰上放置2分钟，加入500μlLB培养基，37℃,180r/min震荡1小时，取100μl涂布于含有Amp和不含有Amp的LB固体培养基中，37℃培养过夜，观察单克隆菌落的生长情况。
3.质粒扩增
挑出已转化成功的质粒阳性克隆，接种于50ml的含有Amp的LB培养基中，37℃，170r/min摇晃培养13小时。
按照质粒中量抽提试剂盒（AP-MD-P-25 AxyPrep，Axygen）说明书进行，取50ml在LB培养基中培养过夜的菌液3000g（重力加速度）离心8分钟，弃上清并倒置吸干培养基，加入4.5ml的Buffer S1，充分悬浮细菌沉淀，加入4.5ml的Buffer S2，温和并充分地混合均匀使菌体充分裂解直至形成透亮的溶液，加入4.5ml 4℃预冷的Buffer S3K，温和并充分的混匀，直至出现颜色均一并且紧实的凝集块，室温放置5分钟。加入4.5ml4℃预冷的Buffer B，温和并充分的混匀10次，8000g离心10分钟。将一个中量制备管放入50ml离心管中，吸取上述混合液转移到中量滤器当中，插入推杆垂直向下缓慢推注至中量制备管中，将一新推杆插入制备管中，垂直向下缓慢推注至一新50ml离心管中直至液体被完全推净，取出推杆加入7ml Buffer W1至制备管中垂直向下缓慢推注直至液体被完全推干净，取出推杆，加入8ml的Buffer W2至制备管中，将插杆插入制备管中垂直向下缓慢推注直至推干净，取下制备管头置于洁净的1.5ml离心管中，加入0.3mlBuffer W2溶液，12000g离心2分钟，将制备管头置于另一个洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加入350μl Eluent A，室温静置1分钟，12000g离心1分钟收集质粒DNA，弃制备管在滤液中加入350μl预冷的Buffer ETR，混合均匀后加入88μl的Buffer PF，置于56℃孵育2-5分钟，室温12000g离心2分钟，取无色上相至1.5ml的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇混合均匀，室温静置10分钟，12000g离心10分钟，尽可能弃净上清后加入1ml预冷的ET-free water洗涤沉淀，12000g离心5分钟。尽可能弃净上清在超净台中干燥5-10分钟，加入150μlEluent A溶解质粒DNA。
4.鉴定
取抽提得到的质粒样本5μl送往北京六合华大基因科技有限公司进行测序鉴定，测序结果如下序列表所示。
SEQ ID NO: 1 序列表
GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCAGGCTCCAGCGTGAAGATCTCCTGCAAGACCAGCGGCGACTCTTTCACAGCTTACAACATGAATTGGGTGAAGCAGTCCCACGGCAAGAGCCTGGAGTGGATCGGCAACATCAATCCTTACTATGGCAGCACCAGGTACAACCAGAAGTTTAAGGGCAAGGCCACCCTGACAGTGGACAAGTCTTCCAGCACCGCTTATATCCAGCTGAACTCCCTGACAAGCGAGGATTCTGCCGTGTACTATTGTGCTAGGGAGGGCAATTACTATGACGGCGGCTCTGTGCGGTACTTCGATTATTGGGGCCAGGGCACCACACTGACAGTGTCTTCCGCCAAGACCACATGA
SEQ ID NO: 2 序列表
EVQLQQSGAELVKPGSSVKISCKTSGDSFTAYNMNWVKQSHGKSLEWIGNINPYYGSTRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYIQLNSLTSEDSAVYYCAREGNYYDGGSVRYFDYWGQGTTLTVSSAKTT
5.定量
取样品以1：10的比例稀释后在紫外分光光度计下进行浓度测定，并记录OD260/280的比值，观察所抽提质粒的纯合程度。
实施例2 AntiA2AR功能体外验证
1.细胞转染
HEK293T细胞使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基进行培养，随后使用Lipofectamine2000进行质粒共转染（AntiA2AR，A2AR，pGloSensor™-22F cAMP），对照组质粒组成为（mCherry，A2AR，pGloSensor™-22F cAMP）,质粒组成比例均为100:1:1。
2. AntiA2AR拮抗作用测定
测定A2AR直接的下游信号分子环磷酸腺苷（cAMP）反映A2AR的活性变化。在转染24小时后更换培养基为含10%FBS，2%GloSensor™ cAMP Reagent的CO2-Independent培养基中继续室温下培养2小时，各转染组分别设置对照组，CGS21680（1μM）组和ZM241385（1μM）组，药物刺激时间为10分钟。酶标仪中检测化学发光的发光值。结果参见图1， meCherry质粒转染的对照组中应用CGS21680后cAMP显著升高，而AntiA2AR质粒转染组中应用CGS21680后cAMP不升高，说明AntiA2AR可显著抑制了激动剂对A2AR的激活作用，从而表明AntiA2AR的抑制作用极佳。
实施例3 AntiA2AR质粒应用于治疗神精系统疾病
1.模型制备
动物：C57BL/6小鼠，健康状况良好，雌雄不拘，体重20±2g。
病毒注射：采用2%的戍巴比妥钠以45mg/kg的剂量进行小鼠麻醉，麻醉后采用手术刀剃除颅骨顶部的毛发，固定在立体定位仪上，使用碘伏消毒处理后用手术刀进行开颅处理，刮除骨膜后以前卥为原点进行定位并用电钻开孔，吸取2μl AntiA2AR AAV病毒进行左侧纹状体注射，对照组注射对照病毒mCherry AAV病毒，注射完成后将皮肤进行缝合处理，术后小鼠单笼饲养避免感染，饲养2个月等病毒稳定表达后（表达高峰期）进行行为学观察。
2.动物焦虑行为学观察
结果参见图2，图3，图4，图5。在评定动物焦虑的模型旷场实验、高架十字迷宫实验以及饮水冲突实验中可以观察到注射表达AntiA2AR病毒的小鼠焦虑状态与对照组相比显著降低，说明拮抗了纹状体中A2AR受体能够有效地降低小鼠的焦虑状态。
上述实施例中，采用的试剂和培养基主要有：
1.质粒：插入AntiA2AR表达基因或A2AR表达基因的pcDNA3.1(+)（南京金斯瑞生物科技有限公司）；
2.感受态大肠杆菌DH5α；
3.质粒抽提试剂盒：中量抽提（AP-MD-P-25 AxyPrep，Axygen）；
4.转染试剂：lipofectamine2000(invitrogen，美国)；
5.cAMP含量测定：pGloSensor™-22F cAMP Plasmid和GloSensor™ cAMP Reagent（promega,美国）；
6.AAV病毒：能够在真核生物体内表达的AntiA2AR-AAV病毒（上海和元生物技术股份有限公司）；
7.HEK293T细胞（本实验室保存）；
8. A2AR刺激剂CGS21680，ZM241385（Tocris，英国）
9. LB培养基（1000ml）：10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g氯化钠溶于蒸水中并定量至1L，调整节pH至7.0，高温灭菌20分钟后备用。
10. 含有氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基：10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g氯化钠，15g琼脂，加蒸馏水溶解并定容至1L，高温高压灭菌20分钟，待冷却至55℃后加入Amp使其终浓度为100μg/ml。
由上述的实施例可以看出，将结构较为简单的AntiA2AR的序列插入到pcDNA3.1+当中构建含有1个氨苄青霉素抗性基因（Amp）1个插入的A2AR序列基因、自身复制起始位点和多克隆位点的真核表达载体AntiA2AR。AntiA2AR能够在真核细胞中转染后局部表达并拮抗A2AR的功能作用。解决了现有技术的临床治疗的副作用，药物分布范围局限，既能够特异性抑制A2AR功能，又可以在局部发挥功效，为A2AR作为治疗疾病的靶点提供了有力的工具。可以制成注射液、乳剂、霜剂、膏剂、或喷雾剂等多种药物制剂使用。
以上仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学第三附属医院（野战外科研究所）
<120> 抑制腺苷A2A受体功能的基因、表达载体及应用
<141> 2018-07-13
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaggtgcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggtgaagc caggctccag cgtgaagatc 60
tcctgcaaga ccagcggcga ctctttcaca gcttacaaca tgaattgggt gaagcagtcc 120
cacggcaaga gcctggagtg gatcggcaac atcaatcctt actatggcag caccaggtac 180
aaccagaagt ttaagggcaa ggccaccctg acagtggaca agtcttccag caccgcttat 240
atccagctga actccctgac aagcgaggat tctgccgtgt actattgtgc tagggagggc 300
aattactatg acggcggctc tgtgcggtac ttcgattatt ggggccaggg caccacactg 360
acagtgtctt ccgccaagac cacatga 387
<210> 2
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asp Ser Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asn Tyr Tyr Asp Gly Gly Ser Val Arg Tyr Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr
115 120 125

Claims (9)

1.一种抑制腺苷A2A受体功能的基因，其特征在于，包含以下任意一种：
（1）SEQ ID NO: 1所示序列；
（2）与SEQ ID NO: 1所示序列的同源性大于60%的序列。
2.一种抑制腺苷A2A受体功能的表达载体，其特征在于，包括以下任意一种：
（1）SEQ ID NO: 2所示序列表示的基因；
（2）与SEQ ID NO: 2所示序列的同源性大于60%的序列。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，包括将权利要求1所述的基因插入pcDNA3.1(+)后，转化、扩增、纯化后得到。
4.根据权利要求1所述的基因，在治疗腺苷A2A受体功能紊乱有关的疾病中的应用。
5.根据权利要求1所述的基因，在神经系统疾病的药物中的应用。
6.根据权利要求2或3所述的表达载体，在治疗腺苷A2A受体功能紊乱有关的疾病中的应用。
7.一种拟制腺苷A2A受体功能的病毒，其特征在于，包含权利要求1所述的基因及病毒载体。
8.一种药物制剂，其特征在于，包含权利要求2或3所述的载体。
9.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的剂型包括注射液、乳剂、霜剂、膏剂或喷雾剂。
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