CN108938630B - 2-巯基吡啶-n-氧化物金盐化合物的新应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种2‑巯基吡啶‑N‑氧化物金盐化合物的新应用。本发明通过大量的实验研究发现具有式I结构的2‑巯基吡啶‑N‑氧化物金盐化合物(AuPT)能够明显的抑制蛋白酶体功能，能明显抑制26S蛋白酶体去泛素化酶的活性，在众多癌细胞系中具有细胞毒性作用，在诱导肿瘤细胞死亡方面效果显著，AuPT能够有效抑制裸鼠移植瘤的生长。本发明的AuPT还为临床上防治炎症、组织缺血‑再灌注损伤、心肌肥大等疾病提供了更多的治疗选择。

Description

2-巯基吡啶-N-氧化物金盐化合物的新应用
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，特别是涉及一种2-巯基吡啶-N-氧化物金盐化合物的新应用。
背景技术
真核细胞中存在两种不同的蛋白质降解途径，一种是自噬-溶酶体途径，主要降解包括应激产生蛋白，膜相关蛋白和经包吞进入细胞的外源性蛋白；一种是泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasome system,UPS)，泛素-蛋白酶体途径介导了细胞内80％以上蛋白的降解，包括一系列重要的生命活动调节蛋白(参见Hershko A,等，Annu RevBiochem.1998，67，425-479；Mizushima等，Nature.2008,451,1069-1075)，从而参与细胞生命过程的调节。由于该系统的发现及其重要性，以色列及美国的三位科学家共同分享了2004年度诺贝尔化学奖。UPS已经成为肿瘤等许多疾病治疗的重要靶点。硼替佐米(bortezomib)，商品名为万珂(Velcade)是一种靶向作用于20S蛋白酶体的抑制剂，已经被美国FDA批准用于临床治疗多发性骨髓瘤和淋巴瘤等疾病，并取得了良好的疗效(参见KaneRC,等，Clin Cancer Res 2006；12(10):2955-2960)。
泛素-蛋白酶体系统降解蛋白质主要包括两个步骤：靶蛋白被标记上多聚泛素链和26S蛋白酶体降解标记上泛素链的靶蛋白。26S蛋白酶体(2.5MD)是一种依赖ATP的蛋白降解复合体，它由2个环状的19S调节亚基(890KD)和1个圆筒状的20S催化亚基组成。被泛素标记的蛋白在降解之前必须经位于19S上的去泛素化酶去除泛素标签，去泛素化酶抑制同样能够引起大量泛素化蛋白的聚集，但与20S蛋白酶体抑制剂不同的是，大部分去泛素化酶抑制剂只针对特异的一部分重要的去泛素化酶，比20S蛋白酶体抑制剂具有更好的特异性和选择性，用于肿瘤的治疗具有重要意义。2011年11月，瑞典学者Stig Linder等在NatureMedicine杂志报道，19S蛋白酶体调节亚基上的去泛素化酶是重要的有效的抗肿瘤靶点，并证实化合物b-AP15是一个重要的去泛素化酶抑制剂，引起了学术界广泛的关注(参见Linder S.等，NatMed 2011；17(12):1636-1640)。2012年9月，美国学者在Cancer Cell杂志报道针对去泛素化酶USP7的抑制剂能够有效诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡以及有效克服硼替佐米耐药，(参见Chauhan D,等，Cancer Cell 2012；22(3):345–358)。因此，去泛素化酶抑制剂逐渐成为抗肿瘤研究的热门靶点，目前报道的去泛素化酶抑制剂归结起来有以下几个共同特点：多数作用于某些特异性去泛素化酶；具有使UPS底物蛋白质在细胞内积聚并导致细胞稳态失衡的作用；具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用；具有抗肿瘤的作用。
发明内容
基于此，本发明提供了2-巯基吡啶-N-氧化物金盐化合物的新应用。
具体技术方案如下：
具有式I结构的2-巯基吡啶-N-氧化物金盐化合物在制备去泛素化酶抑制剂中的应用
在其中一些实施例中，所述去泛素化酶为26S蛋白酶体去泛素化酶。
上述具有式I结构的2-巯基吡啶-N-氧化物金盐化合物作为去泛素化酶抑制剂在制备防治肿瘤的药物中的应用。
在其中一些实施例中，所述肿瘤包括：肺癌、肝癌、白血病、骨髓瘤、胃癌、前列腺癌、乳腺癌。
上述的具有式I结构的2-巯基吡啶-N-氧化物金盐化合物作为去泛素化酶抑制剂在制备防治炎症、组织缺血-再灌注损伤或心肌肥大疾病的药物中的应用。
本发明还提供了一种防治肿瘤的药物。
具体技术方案如下：
一种防治肿瘤的药物，其活性成分包括有具有式I结构的2-巯基吡啶-N-氧化物金盐化合物
Figure BDA0001300968480000031
本发明还提供了一种防治炎症、组织缺血-再灌注损伤或心肌肥大疾病的药物。
具体技术方案如下：
一种防治炎症、组织缺血-再灌注损伤或心肌肥大疾病的药物，其活性成分包括有具有式I结构的2-巯基吡啶-N-氧化物金盐化合物
本发明提供了一种名称为Au(1-oxidopyridine-2-thione)2Na(H2O)4(简称AuPT，结构式如上述式I所示)的2-巯基吡啶-N-氧化物金盐化合物的新应用，通过大量的实验研究了发现AuPT能够明显的抑制蛋白酶体功能，能明显抑制26S蛋白酶体去泛素化酶的活性，在众多癌细胞系中具有细胞毒性作用，在诱导肿瘤细胞死亡方面效果显著。AuPT能够有效抑制裸鼠移植瘤的生长。
本发明的AuPT还为临床上防治炎症、组织缺血-再灌注损伤、心肌肥大等疾病提供了更多的治疗选择。
附图说明
图1为AuPT晶体结构图；
图2为实施例2中AuPT对多种肿瘤细胞活力的影响结果图；
图3为实施例3中AuPT诱导肿瘤细胞凋亡的情况图；
图4为实施例4中AuPT诱导肿瘤细胞内泛素化蛋白量的变化图；
图5为实施例5中AuPT对蛋白酶体外源性特异性底物GFPu和泛素化蛋白的影响结果图；
图6为实施例6中AuPT诱导的细胞凋亡与caspase相关蛋白的表达情况图；
图7为实施例7中AuPT抑制蛋白酶体功能和诱导细胞凋亡的先后关系结果图；
图8为实施例8中EDTA对AuPT诱导的泛素化蛋白聚集和细胞凋亡的影响结果图；
图9为实施例9中AuPT对26S蛋白酶体去泛素化酶活性和细胞内总的去泛素化酶活性的影响结果图；
图10为实施例10中AuPT对裸鼠移植瘤(A549)的抑制情况图；
图11为实施例11中AuPT对裸鼠移植瘤(SMMC7721)的抑制情况图；
图中的DM是指不含AuPT的DMSO溶剂。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，以下通过具体实施例结合附图对本发明做进一步的阐述，但不用于限制本发明。
以下实施例中没有具体注明的实验方法都按本领域的常规方法进行，所用原料或试剂均为市售普通原料或试剂，AuPT浓度的配制所用的溶剂均为DMSO。
实施例1
化合物Au(1-oxidopyridine-2-thione)2Na(H2O)4的制备
Figure BDA0001300968480000041
将三苯基膦氯金(49mg,0.1mmol)，溶解在20ml二氯甲烷中，将2-巯基吡啶-N-氧化物钠盐(40mg,0.2mmol)添加到上述溶液中，常温下搅拌反应6h,反应物过滤，滤渣用甲醇溶解，在空气中缓慢挥发，7天后得到块状透明晶体，用乙醇洗涤，在空气中自然干燥，产率32％。通过X-射线单晶衍射仪鉴定，确认该化合物为Au(1-oxidopyridine-2-thione)2Na(H2O)4，本发明中简称为AuPT。X-射线单晶衍射仪结果参见图1，数据如下表所示：
Figure BDA0001300968480000051
Figure BDA0001300968480000061
实施例2：AuPT对多种肿瘤细胞活力的影响
用不同浓度的AuPT(5、10、15、20、30、40μM)处理A549、NCI-H1299、SMMC-7721、HepG2、K562、U266、MGC-803、SGC-7901、DU145、PC3、MCF-7、MDA-MB-231细胞24h和48h后，加入MTS溶液孵育1-4h，酶标仪(490nM)检测其吸光度值。结果显示，AuPT可明显抑制多种肿瘤细胞的活力，且呈剂量依赖关系。结果参见图2。
实施例3：AuPT诱导肿瘤细胞凋亡的情况
用不同浓度的AuPT(2.5、5.0、10、20μM)分别处理A549、SMMC-7721细胞24h后，加入AnnexinV-FITC/PI双染试剂，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果表明，AuPT可剂量依赖的诱导A549、SMMC-7721细胞凋亡。结果参见图3。
实施例4：AuPT诱导肿瘤细胞内泛素化蛋白量的变化
用不同浓度的AuPT(2.5、5、10、20μM)分别作用于A549、SMMC-7721细胞12后，收集细胞提取总蛋白，进行Western Blot免疫印迹，检测Ub-Prs、K48-的表达情况。结果表明，AuPT能明显抑制蛋白酶体功能。结果参见图4。
Western Blot方法：1、配置SDS-PAGE所需要的凝胶。首先按照配方配置下层分离胶，配置好后缓慢加入装备好的两层玻璃夹板中，加入适量双蒸水封闭压线；待下层分离胶凝固后，将上步中的上层水倒掉，加入配置好的浓缩胶后插上梳子，静待凝固。2、将提取的蛋白煮沸变性后，根据蛋白浓度以相同的样品量加入到凝胶孔内，开始电泳(浓缩胶85V，分离胶100V)，一定时间后停止电泳，采用湿转的方法将蛋白转移到PVDF膜上。3、转膜结束后，将PVDF膜取出，采用5％的脱脂奶粉室温封闭1h。4、封闭结束后，用PBST洗膜3次，每次5min，加入一定量配置好的一抗，室温孵育1-2h。5、一抗孵育结束后，用PBST洗膜3次，每次5min，加入一定量二抗，室温孵育1-2h。6、二抗孵育结束后，用PBST洗膜3次，每次5min，显影。
实施例5：AuPT对蛋白酶体外源性特异性底物GFPu和泛素化蛋白的影响
用不同浓度的AuPT处理GFPu-HEK-293细胞(稳定转染GFPu)12h后，收集细胞提取总蛋白，进行Western Blot免疫印迹(参见实施例4)或荧光显微镜原位拍照，检测Ub-Prs、GFPu的表达情况。结果表明，AuPT能明显抑制蛋白酶体功能。结果参见图5。
实施例6：AuPT诱导的细胞凋亡与caspase相关蛋白的表达情况
用不同浓度AuPT(2.5、5.0、10、20μM)分别作用于A549、SMMC-7721细胞24h后，收集细胞提取总蛋白。然后进行Western Blot免疫印迹(参见实施例4)，检测caspase-3、-8、-9和PARP及其活化形式的表达情况。结果表明，AuPT可以诱导肿瘤细胞PARP切割和caspase活化。结果参见图6。
实施例7：AuPT抑制蛋白酶体功能和诱导细胞凋亡的先后关系
用AuPT(5μM)分别处理A549、SMMC-7721细胞后，在指定时间(3h、6h、12h、24h)收集细胞提取总蛋白，进行Western Blot免疫印迹(参见实施例4)，检测Ub-Prs、K48-、PARP的表达情况。结果表明，AuPT在抑制蛋白酶体功能之后引起PARP的切割。结果参见图7。
实施例8：EDTA对AuPT诱导的泛素化蛋白聚集和细胞凋亡的影响
AuPT(5μM)或AuPT(5μM)联合EDTA(100μM)作用于A549、SMMC-7721细胞12h后，收集细胞提取总蛋白，进行WesternBlot免疫印迹(参见实施例4)，检测Ub-Prs、PARP的表达情况。结果表明，AuPT EDTA可部分逆转AuPT诱导的泛素化蛋白聚集和PARP的切割。结果参见图8。
实施例9：AuPT对26S蛋白酶体去泛素化酶活性和细胞内总的去泛素化酶活性的影响
采用纯化的26S和未处理的细胞裂解液作为DUBs的供体，用不同浓度的AuPT(1、2、4μM)作用于蛋白30min后，加入Ub-AMC(400nM)作为DUBs(USP类/UCH类)的底物，用多功能酶标仪(350/438nm)每4min检测一次，观察DUB活性的动态变化。结果显示AuPT可以明显的抑制26S蛋白酶体去泛素化酶的活性。结果参见图9。
实施例10：AuPT对裸鼠移植瘤(A549)的抑制情况
将A549细胞悬液(5×106/ml，无血清RPMI1640培养基)皮下接种于BALB/c裸鼠(18-20g，购自广东省动物中心)背部外侧，随机分为2组(对照组、AuPT组)，每组6只，AuPT溶于DMSO，浓度为5μM，按照40mg/kg腹腔给药，对照组给予相同体积的不含AuPT的DMSO溶剂，每天记录裸鼠体重，隔天记录裸鼠肿瘤体积，持续15天。记录肿瘤大小，肿瘤重量，肿瘤体积的变化。结果显示，AuPT可显著抑制裸鼠移植瘤(A549)的生长。结果参见图10。
实施例11：AuPT对裸鼠移植瘤(SMMC-7721)的抑制情况
将SMMC-7721细胞悬液(5×106/ml，无血清RPMI1640培养基)皮下接种于BALB/c裸鼠(18-20g，购自广东省动物中心)背部外侧，随机分为2组(对照组、AuPT组)，具体方案参见实施例10。结果显示，AuPT可显著抑制裸鼠移植瘤(K562)的生长。结果参见图11。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (2)

1.具有式I结构的2-巯基吡啶-N-氧化物金盐化合物作为去泛素化酶抑制剂在制备防治肿瘤的药物中的应用：
Figure FDA0002296750700000011
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括：肺癌、肝癌、白血病、骨髓瘤、胃癌、前列腺癌、乳腺癌。
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